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    甘肅臨洮縣馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌的分離鑒定及致病性

    2024-12-31 00:00:00郭瑞何偉羅文芳周軍輝汪雪晶許建軍宋素琴
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年19期
    關(guān)鍵詞:分離鑒定生物學(xué)特性致病性

    摘要:為給甘肅馬鈴薯瘡痂病病的診斷和防治提供研究依據(jù),從甘肅臨洮縣采集馬鈴薯種植區(qū)病薯根際土壤,利用稀釋涂布分離法分離馬鈴薯瘡痂病病原菌菌株,并檢測(cè)致病基因txtAB、nec1、tomA,結(jié)合小蘿卜幼苗法和小薯片法測(cè)定菌株的致病性;通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA序列進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,菌株DW1、DW2、DY4、DY6菌株含有致病基因;其中菌株DW1、DW2、DY4能使小薯片表面變褐,壞死;DW2、DY4、DY6能明顯抑制蘿卜幼苗生長(zhǎng)。其中,菌株DY4同時(shí)具有nec1、tomA等2種致病基因,其余菌株只具有nec1致病基因。經(jīng)16S rDNA 序列分析,菌株DW1為Streptomyces nigra,菌株DW2為S.albogriseolus,菌株DY4為S.scabiei,菌株DY6為S.europaeiscabiei。其中,菌株S.nigra、S.albogriseolus,均為首次報(bào)道具有馬鈴薯瘡痂病致病性的鏈霉菌。

    關(guān)鍵詞:馬鈴薯瘡痂病病原菌;分離鑒定;致病基因;致病性;生物學(xué)特性

    中圖分類(lèi)號(hào):S435.32" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2024)19-0158-07

    收稿日期:2023-10-26

    基金項(xiàng)目:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點(diǎn)培育專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào):Xjkcpy-202203);新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目任務(wù)專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào):2022B02044-2)。

    作者簡(jiǎn)介:郭 瑞(1999—),女,甘肅酒泉人,碩士研究生,從事馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌分離鑒定及代謝產(chǎn)物活性研究。E-mail:1522017534@qq.com。

    通信作者:宋素琴,研究員,從事微生物活性產(chǎn)物及作物病害研究,E-mail:suqin_song@163.com;許建軍,博士,教授,從事為農(nóng)作物及林果病害蟲(chóng)綜合防控研究,E-mail:xjj72@163.com。

    馬鈴薯瘡痂?。╬otato common scab)是由放線菌目鏈霉菌屬的致病鏈霉菌(Streptomyces spp.)通過(guò)皮孔或馬鈴薯表面開(kāi)放性傷口侵染馬鈴薯塊莖引起的土傳病害。馬鈴薯被侵染后,塊莖表面形成木質(zhì)化痂狀病斑;發(fā)生嚴(yán)重時(shí),影響馬鈴薯外觀,降低薯塊質(zhì)量和商品價(jià)值[1-2。隨著馬鈴薯種植面積的逐年增加,馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生也日益增多,已成為馬鈴薯瘡痂病的主要病害之一。甘肅省作為我國(guó)馬鈴薯主要種植區(qū)之一,馬鈴薯產(chǎn)業(yè)也在全省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)占據(jù)主要地位;馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生率達(dá)到30%,嚴(yán)重危害馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4。

    目前,全球已報(bào)道30多種馬鈴薯瘡痂病致病菌種類(lèi),主要致病菌有酸性鏈霉菌(S .acidiscabies)、歐式鏈霉菌(S.europaeiscabiei)、瘡痂鏈霉菌(S.scabies)、加利利鏈霉菌(S.galilaeus)[5-7。其中,我國(guó)已報(bào)道的致病瘡痂鏈霉菌病原共有18種,常見(jiàn)的3種病原為瘡痂鏈霉菌、酸性鏈霉菌、腫痂鏈霉菌(S.turgidiscabies)[8。在致病鏈霉菌中,相關(guān)致病基因聚集在染色體同一區(qū)域,該區(qū)域被稱(chēng)為致病島(pathogenicity island,PAI),PAI由2個(gè)部分組成,第一部分是毒素合成基因,包括txtA、txtB、txtC等;第二部分包括nec1誘導(dǎo)壞死蛋白基因、tomA致病性因子基因和多種與毒力相關(guān)基因[9。由于致病島可以水平轉(zhuǎn)移到鏈霉菌屬的其他種中,從而不斷產(chǎn)生新的致病種10,為馬鈴薯瘡痂病的防治增添了難度。甘肅省臨洮縣地處隴西盆地西緣,臨洮縣地形南北狹長(zhǎng),地勢(shì)由東南向西北傾斜,境內(nèi)以黃土地貌為主,屬溫帶大陸性氣候。目前,在甘肅省馬鈴薯種植區(qū)中已分離鑒定馬鈴薯瘡痂病的病原菌為瘡痂鏈霉菌、加利利鏈霉菌等(表1)[11-14。本試驗(yàn)臨洮縣馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌進(jìn)行分離鑒定及生物學(xué)特性研究,為豐富我國(guó)馬鈴薯瘡痂病原菌種類(lèi)及該病害防治研究提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試馬鈴薯瘡痂病病薯塊莖和根際土壤于2022年8月采自甘肅臨洮縣。對(duì)照菌株S.scabies YN由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。本試驗(yàn)于2023年3月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所進(jìn)行。

    分離培養(yǎng)基為燕麥麩皮固體培養(yǎng)基(OMA):燕麥麩皮20 g、瓊脂15 g和去離子水1 L;高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基(G1):可溶性淀粉20.0 g,K2HPO3 0.5 g,KNO3 1.0 g,NaCl 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,瓊脂粉20.0 g,去離子水 1 000 mL;ISP2固體培養(yǎng)基:酵母浸粉4.0 g,麥芽浸粉10.0 g,葡萄糖4.0 g,瓊脂粉20 g,去離子水 1 000 mL;ISP4固體培養(yǎng)基:可溶性淀粉10.0 g,K2HPO3 1.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,NaCl 1.0 g,(NH42SO4 2.0 g,CaSO4 2.0 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g,MnCl2 0.001 g,ZnSO4·7H2O 0.001 g瓊脂粉 15.0 g,去離子水1 000 mL。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 病原菌的分離純化

    將采集的馬鈴薯瘡痂病發(fā)病地塊土壤于自然條件下風(fēng)干,用無(wú)菌研缽研細(xì),利用稀釋涂布法稱(chēng)取1 g根際土壤,加9 mL無(wú)菌水,渦旋混勻,靜置30 min后進(jìn)行10-2、10-3、10-4、10-5倍梯度稀釋。取80 μL混懸液,分別涂布于OMA、G1、ISP2及ISP4培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)7 d。挑取單菌落在高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上純化并編號(hào),純化菌株轉(zhuǎn)接斜面置于4 ℃冰箱保存。

    1.2.2 病原菌的致病基因測(cè)定

    據(jù)報(bào)道,馬鈴薯瘡痂病致病菌都含有致病基因,包括Thaxtomins毒素合成基因txtAB、壞死基因nec1以及番茄紅素酶tomA,病原菌是否含有致病基因是檢測(cè)該菌是否具有致病性的指標(biāo)14。用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)鏈霉菌中是否含有3種致病基因。以對(duì)照菌株S. scabies YN為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)txtAB、nec1、tomA基因進(jìn)行檢測(cè)。致病基因檢測(cè)PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2,引物序列如表3所示,擴(kuò)增條件如表4所示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)[15。

    1.2.3 病原菌的致病性測(cè)定

    利用小薯片法、蘿卜幼苗法[19-20測(cè)定含有致病基因的鏈霉菌株的致病性。

    1.2.3.1 小薯片法 將分離得到的含有致病基因的菌株接種至G1平板中,30 ℃培養(yǎng)7 d;選擇健康的馬鈴薯和青蘿卜,使用75%乙醇進(jìn)行表面消毒,無(wú)菌水沖洗干凈;之后用無(wú)菌打孔器在塊莖上打孔,無(wú)菌手術(shù)刀切成厚度一致的薯片,放置于含有滅菌濾紙片的培養(yǎng)皿中放入4片/皿;用打孔器在致病基因菌株平板中打孔,將菌餅倒置放置在小薯片中央,以未接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照;30 ℃恒溫培養(yǎng) 7 d,觀察小薯片是否褐變壞死。

    1.2.3.2 蘿卜幼苗法 將含有致病基因的菌株接種至放線菌液體培養(yǎng)基中,30 ℃、150 r/min培養(yǎng) 7 d;用75%無(wú)水乙醇對(duì)蘿卜種子表面消毒,再用無(wú)菌水連續(xù)沖洗3次,晾干;將晾干的種子放置于含有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行催芽;選取長(zhǎng)勢(shì)一致的種子分裝到含有1%水瓊脂的試管中,放入 3 粒/支;將培養(yǎng)好的菌液200 μL 接種至試管中,以接種無(wú)菌液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次;將試管放置于光照培養(yǎng)箱間歇培養(yǎng),7 d后觀察并測(cè)量蘿卜幼苗根長(zhǎng)。

    1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性

    病原菌形態(tài)特征觀察:挑取G1平板上生長(zhǎng)7 d的鏈霉菌單菌落并置于載玻片上,40倍目光學(xué)顯微鏡下觀察鏈霉菌孢子形態(tài)特征。根據(jù)國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃(ISP)方法,進(jìn)行生理生化鑒定。

    1.2.5 16S rDNA序列分析

    菌株基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[21]中的方法進(jìn)行。采用16S rDNA通用引物(通用引物27F、1492R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其反應(yīng)體系為 30 μL:15 μL Mix,2 μL模板,ddH2O 11 μL,上下游引物各1 μL,PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對(duì),利用MTGA 11.0構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 馬鈴薯瘡痂病病原菌的分離

    馬鈴薯根際土壤中共分離純化得到23株放線菌,對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行初步歸類(lèi)并編號(hào)。

    2.2 馬鈴薯瘡痂病病原的致病性測(cè)定

    2.2.1 病原菌的致病基因PCR檢測(cè)

    根據(jù)致病基因測(cè)定方法,對(duì)篩選得到的鏈霉菌進(jìn)行致病基因檢測(cè),結(jié)果(圖1)表明,4株鏈霉菌具有致病基因,其中1株具有tomA基因,3株具有nec1基因,DY4同時(shí)具有tomA和nec1等2種致病基因。

    2.2.2 病原菌的致病性檢測(cè)

    蘿卜幼苗法表明,DW2、DY4、DY6均可以抑制蘿卜幼苗的生長(zhǎng),抑制率達(dá)到69.76%、57.58%、63.46%(表5、圖2)。與空白對(duì)照相比,含有致病基因菌懸液處理的蘿卜幼苗根系長(zhǎng)度明顯縮短,并且出現(xiàn)小部分的皺縮壞死。

    同時(shí),采用小薯片法和蘿卜片法對(duì)含有致病基因的6株菌株進(jìn)行致病性測(cè)定(圖3),處理7 d后觀察到小薯片、蘿卜片。結(jié)果表明,DW1、DW2、DY4菌株處理的小薯片變軟,表面出現(xiàn)褐色病斑并且有明顯凹陷,與陽(yáng)性對(duì)照表現(xiàn)相似;DW2、DY4、DY6菌株處理的小蘿卜片表明出現(xiàn)黑色病斑,小蘿卜片出現(xiàn)變干壞死,與陽(yáng)性對(duì)照表現(xiàn)相似;而對(duì)照的小薯片和蘿卜片無(wú)變化(圖3)。

    2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

    2.3.1 形態(tài)學(xué)描述

    菌株DW1、DW2、DY4、DY6在G1平板上形態(tài)特征如圖4所示。DW1菌落呈灰白色,邊緣稍有褶皺突起,呈同心圓狀,革蘭氏染色呈陽(yáng)性,孢子呈灰白色,孢子鏈呈直柔曲狀(圖4-A);DW2菌落呈灰白色,中心凸起,革蘭氏染色呈陽(yáng)性,孢子呈灰色,孢子鏈呈波曲狀(圖4-B);DY4菌落呈黃色,革蘭氏染色呈陽(yáng)性,孢子呈白色,孢子鏈較直(圖4-C);DY6菌落呈淡黃色,革蘭氏染色呈陽(yáng)性,孢子呈白色,孢子鏈簇生分支(圖4-D)。

    2.3.2 病原菌生物學(xué)特性的測(cè)定

    對(duì)分離得到的含有致病基因的菌株進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表6。所有菌株均能以D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、α-乳糖、棉子糖、肌醇為單一碳源,但DY4、DY6不能利用木糖;菌株DW1、DW2以賴(lài)氨酸、脯氨酸、組氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、天門(mén)冬酰胺、L-賴(lài)氨酸為單一氮源,菌株DY6不能利用甲硫氨酸和組氨酸;所有菌株在10% NaCl培養(yǎng)基中均無(wú)法生長(zhǎng);DY6可以產(chǎn)生H2S;DY4、DY6可以產(chǎn)生黑色素;DW1、DW2、DY6可以產(chǎn)生纖維素酶;DW1、DW2、DY4可以產(chǎn)生脂肪酶;4株菌株對(duì)結(jié)晶紫、0.1%苯酚敏感,均可耐受10 IU/mL青霉素,DY4菌株對(duì)鏈霉素敏感。

    2.3.3 病原菌的16S rDNA序列分析

    對(duì)分離到的、含致病基因的菌株進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增,使用細(xì)菌通用引物27F、1492R得到1 500 bp基因片段(圖5),送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序;將16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)。結(jié)果表明,菌株DW1與灰黑鏈霉菌(S.nigra)(MG572975.1:106-1366)的親緣關(guān)系最近,相似率為100%;菌株DW2與S.albogriseolus(MT229141.1:55-1388)的親緣關(guān)系最近,相似率為100%;菌株DY4與瘡痂鏈霉菌(S.scabiei)(OM909117.1:20-1372)的親緣關(guān)系最近,相似率為99.93%,菌株DY6與歐式鏈霉菌(S.europaeiscabiei)(OK448161.1:21-1377)的親緣關(guān)系最近,相似率為100%。

    3 討論

    瘡痂鏈霉菌通過(guò)侵染使馬鈴薯塊莖表面出現(xiàn)褐色痂狀病斑,通過(guò)土壤和種薯傳播及感病馬鈴薯跨區(qū)域售賣(mài)而廣泛傳播。馬鈴薯瘡痂病原菌的致病基因主要集中在其致病島(PAI)上[16,致病基因島可以在不同鏈霉菌中轉(zhuǎn)移21-22,從而不斷產(chǎn)生新的致病鏈霉菌,因此不斷有馬鈴薯瘡痂病新致病菌出現(xiàn),為進(jìn)行馬鈴薯瘡痂病致病菌、致病基因及防治的研究提供依據(jù)。

    本研究對(duì)甘肅省臨洮馬鈴薯種植區(qū)瘡痂病致病鏈霉菌進(jìn)行分離篩選并進(jìn)行生物學(xué)特性和16S rDNA序列分析,結(jié)果分離篩選得到4株致病菌株,并鑒定為S.nigra、S.albogriseolus、S.scabiei、S.europaeiscabiei,其中S.nigra、S.albogriseolus為首次報(bào)道含有馬鈴薯瘡痂病致病基因的鏈霉菌。S.scabiei含有tomA和nec1等2種致病基因,其他3株菌只含有tomA基因,這驗(yàn)證了致病島可以在鏈霉菌之間轉(zhuǎn)移11,23-24;4株菌株均具有致病性,使小薯片或小蘿卜片產(chǎn)生明顯的病斑,或具有小蘿卜幼苗抑制作用,這證明即使不含有全部3個(gè)致病基因,也具有致病性,這與之前報(bào)道的內(nèi)容[18,24相符。PAI可轉(zhuǎn)移這一特性加大了馬鈴薯瘡痂病的防治難度,同時(shí)馬鈴薯瘡痂病新致病鏈霉菌的發(fā)現(xiàn)為不同地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的系統(tǒng)研究及其防治提供了依據(jù)。

    4 結(jié)論

    本研究對(duì)甘肅臨洮縣馬鈴薯種植地根際土壤進(jìn)行分離,并通過(guò)致病基因PCR以及致病性試驗(yàn)篩選得到4株具有致病性的鏈霉菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)及 16S rDNA 序列同源性分析,初步鑒定4株菌株為S.nigra、S.albogriseolus、S.scabiei和S.europaeiscabiei,其中S.nigra、S.albogriseolus為首次報(bào)道的馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌;S.scabiei DY4菌株含有tomA和nec1等2種致病基因,可以使小薯片出現(xiàn)黑色病斑,小蘿卜片變干壞死,同時(shí)對(duì)小蘿卜幼苗具有明顯的抑制作用;其他3株菌只含有nec1致病基因,且菌株S.albogriseolus DW2對(duì)小蘿卜幼苗的抑制效果最明顯,抑制率達(dá)到69.76%。生物學(xué)特性顯示,菌株S.nigra DW1、S.albogriseolus DW2能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖等6種碳源,菌株S.scabiei DY4、S.europaeiscabiei DY6不能利用木糖;除菌株S.europaeiscabiei DY6外,其他菌株均可以利用賴(lài)氨酸、脯氨酸、組氨酸等6種氮源,菌株S.europaeiscabiei DY6不能利用甲硫氨酸和組氨酸,但可以產(chǎn)生H2S;所有菌株在含10%的NaCl培養(yǎng)基中均無(wú)法生長(zhǎng);S.scabiei DY4、S.europaeiscabiei DY6可以產(chǎn)生黑色素;S.nigra DW1、S.albogriseolus DW2、S.europaeiscabiei DY6可以產(chǎn)生纖維素酶;S.nigra DW1、S.albogriseolus DW2、S.scabiei DY4可以產(chǎn)生脂肪酶;4株菌株對(duì)結(jié)晶紫、0.1%苯酚敏感,均可耐受10 IU/mL青霉素。

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