貝萊斯芽孢桿菌SB10的篩選、鑒定及其在番茄青枯病防治中的應(yīng)用

摘要：為獲得雷爾氏青枯菌（Ralstonia solanacearum）高效拮抗生防菌株資源，從生姜患病組織中分離、篩選出高效拮抗菌株SB10，經(jīng)理化指標(biāo)及分子生物學(xué)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。該菌對(duì)病原菌的平板拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，SB10具有廣譜抑菌功能，其對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、大麗輪枝孢菌（Verticilium dahliae）等病原真菌和柑橘黃單胞桿菌（Xanthomonas campestris）、燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N（Acidovorax avenae subsp.Citrulli）及青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）等病原細(xì)菌均有顯著的抑制作用，抑菌圈直徑均在 3.0 cm 以上。生防盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，SB10菌體重懸液和發(fā)酵液均對(duì)青枯雷爾氏菌具有預(yù)防和治療作用，且其發(fā)酵液的預(yù)防作用的相對(duì)防效為80%，顯著優(yōu)于治療作用的相對(duì)防效（42%）；且SB10菌體重懸液和發(fā)酵液對(duì)青枯雷爾氏的防治效果有差異，其菌體重懸液生防效果優(yōu)于發(fā)酵液。促生盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，接種菌株SB10菌體重懸液顯著地增加了番茄的地上部鮮重。綜上，Bacillus velezensis SB10菌株具有廣譜抑菌能力，對(duì)番茄植株有明顯促生效果，可作為番茄青枯病高效生防菌劑資源。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；番茄青枯病；廣譜抑菌功能；生防作用；促生作用；土傳病害

中圖分類號(hào)：S182；S436.412.1₊5" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）19-0134-09

收稿日期：2023-10-25

基金項(xiàng)目：韶關(guān)市科技計(jì)劃（編號(hào)：220805106270728、210806164532037）；廣州市科技計(jì)劃（編號(hào)：202201011832）；廣東特支計(jì)劃（編號(hào)：2021JC06N628）；“十四五”廣東省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新十大主攻方向“揭榜掛帥”項(xiàng)目（編號(hào)：2022SDZG09、2023SDZG09）。

作者簡(jiǎn)介：劉玉敏（1995—），女，河南確山人，碩士，助理工程師，從事生防菌株資源的收集和利用，E-mail：3074307426@qq.com；共同第一作者：謝小林（1986—），男，江西上饒人，博士，高級(jí)工程師，從事農(nóng)用固體有機(jī)廢棄物資源化利用，E-mail：522353739@qq.com。

通信作者：朱紅惠，博士，研究員，從事農(nóng)用微生物種質(zhì)資源挖掘及創(chuàng)新利用。E-mail：zhuhh@gdim.cn。

番茄青枯病是一種由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的典型的土傳病害^［1］，具有分布范圍廣，發(fā)病嚴(yán)重、致死率高的特點(diǎn)，而且病原菌可在土壤中越冬，一旦發(fā)病，很難將其根除^［2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在番茄種植中因番茄青枯病造成的病害，輕病地塊減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)50%以上，甚至絕收^［3］。目前，番茄青枯病的防治主要包括抗性產(chǎn)品的選擇^［4］、物理防治^［5］、化學(xué)防治^［6］和生物防治^［7］等措施?；瘜W(xué)防治因見效快、操作簡(jiǎn)單被長(zhǎng)期推廣使用，但化學(xué)農(nóng)藥的濫用可能會(huì)導(dǎo)致病原菌的耐藥性增強(qiáng)，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，而且大量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)造成土壤板結(jié)、酸化、鹽漬化和水體的富營(yíng)養(yǎng)化^［8-13］，這些嚴(yán)重阻礙了我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展。因此，尋找綠色、安全、高效的番茄青枯病防治方法對(duì)番茄產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。

生物防治因其安全、綠色、無(wú)污染的特點(diǎn)，逐漸成為國(guó)內(nèi)外番茄青枯病防治的研究熱點(diǎn)^［6］。而貝萊斯芽孢桿菌具有良好的抑菌活性和廣譜抑菌性，對(duì)瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabies）、赤霉?。‵usarium head blight）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等植物病原菌均有明顯的抑制作用^［14-16］，對(duì)番茄青枯病等作物病害也具有良好的防治效果^［17-18］。Kang等的室內(nèi)共培養(yǎng)試驗(yàn)表明，接種內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌CCO9具有良好抑菌性，對(duì)葉枯病防治效果達(dá) 21.64%，對(duì)小麥全蝕病的防治效果達(dá)到66.67%^［19］。曹宇等的試驗(yàn)表明，同時(shí)接種Bacillus velezensis HNU24和青枯雷爾氏菌EP1至番茄植株，青枯病的發(fā)病率明顯下降^［20］。郭浩群的盆栽試驗(yàn)表明，提前5 d接種貝萊斯芽孢桿菌2014WK-N60發(fā)酵液，對(duì)青枯雷爾氏菌GMI1000的防效達(dá)到 58.90%^［21］。有大量室內(nèi)試驗(yàn)研究表明，同時(shí)接種貝萊斯芽孢桿菌和病原菌時(shí)，貝萊斯芽孢桿菌可有效降低病害的發(fā)生率，但關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌對(duì)病原菌的預(yù)防作用和治療作用相關(guān)研究較少，且對(duì)于生防菌株菌體和發(fā)酵液對(duì)病害防治的效果差異的相關(guān)研究不多?；诖?，本試驗(yàn)從生姜患病組織中分離出1株高效拮抗青枯雷爾氏菌的內(nèi)生菌株貝萊斯芽孢桿菌SB10，評(píng)估其廣譜抑菌性，并利用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)評(píng)估其對(duì)番茄青枯病的生物防治及促生效果，重點(diǎn)關(guān)注SB10菌體重懸液和發(fā)酵液的生防效果及其差異以及SB10菌劑預(yù)防和治療作用效果的差異，以期為揭示該菌株生防機(jī)制以及高效生防菌劑的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品：樣品于2021年6月采集自河北省唐山市路南區(qū)生姜種植大田，采用五點(diǎn)取樣法采集大田健康土壤和患病植株，進(jìn)行病原菌和生防菌的分離和篩選。

供試菌株：青枯雷爾氏菌HB23，分離自姜瘟病患病組織，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為 GDMCC 1.3036；立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、大麗花輪枝孢菌、燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N、青枯雷爾氏菌和柑橘黃單胞桿菌等靶標(biāo)病原菌均由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

供試植株：供試番茄品種為新金豐一號(hào)，是青枯雷爾氏菌易感品種，育苗至3～5張真葉時(shí)備用。因分離自生姜姜瘟病的病原菌青枯雷爾氏菌可導(dǎo)致番茄青枯病病害，且番茄植株生長(zhǎng)周期較生姜短，在廣東省番茄種植面積多于生姜種植面積，因此選擇番茄作為供試植株。

供試土壤：自然風(fēng)干的土壤和沙子，按照3 ∶1體積比混勻，過(guò)2 mm（10目）孔徑篩，121 ℃高壓蒸汽滅菌1 h，重復(fù)3次，分別間隔1 d，晾干后備用^［22］。

1.2 青枯雷爾氏菌病原菌的分離

取新鮮生姜患病根部組織，采用組織分離法^［23］分離病原菌。具體分離步驟為：自來(lái)水沖洗生姜組織5 min左右，切取病健交接部位使用75%乙醇和1% NaClO進(jìn)行消毒，置于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d左右，之后根據(jù)形態(tài)差異純化菌株^［22］。

經(jīng)氯化三苯甲基四氮唑（TTC）平板法^［23］和柯赫氏回接法^［24］驗(yàn)證病原菌的致病力。

1.3 菌株SB10的分離和篩選

1.3.1 可培養(yǎng)菌的分離

采用稀釋涂布法^［25］從生姜種植土壤樣品中分離可培養(yǎng)微生物，具體分離步驟為：取10 g根際土壤樣品，在無(wú)菌三角瓶中加入 90 mL 無(wú)菌水和20顆左右的滅菌玻璃珠，置于搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。分別取10^-3、10^-4、10^-5稀釋液100 μL涂布于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（NA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和R2A瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)梯度3次重復(fù)，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)3 d左右。待菌落長(zhǎng)出后挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行純化，3～4次后獲得純菌落，置于25%甘油中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 青枯雷爾氏菌生防菌的初篩

采用平板對(duì)峙法^［25］進(jìn)行生防菌的初篩，以青枯雷爾氏菌HB23為靶向病原菌，將其活化后接入至NB培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24 h后調(diào)節(jié)D_{600 nm}到 1.0左右，然后用無(wú)菌水稀釋1 000倍，吸取100 μL病原菌菌液均勻涂布至NA平板上，將活化好的待測(cè)菌株采用點(diǎn)接法接種在距培養(yǎng)皿中心3 cm處的四均分位點(diǎn)，每個(gè)平板點(diǎn)接4個(gè)菌株，每個(gè)菌株2次重復(fù)，置于28 ℃培養(yǎng)約48 h后，觀察抑菌情況^［22］。

1.3.3 青枯雷爾氏菌生防菌的復(fù)篩

參考陳丹丹等的方法^［26］進(jìn)行生防菌的復(fù)篩，以青枯雷爾氏菌HB23為靶向病原菌，選擇有明顯抑菌圈的菌株復(fù)篩。方法為：病原菌發(fā)酵后菌液稀釋后涂布于NA平板上，距培養(yǎng)皿中心3 cm處呈“十”字形打孔4個(gè)（孔徑為8 mm），挑取生防菌單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min 培養(yǎng)24 h成生防菌液，吸取50 μL生防菌液于孔中，置于28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察其抑菌圈直徑^［22］。

1.4 菌株SB10的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選到的拮抗菌株SB10接種到NA平板上，根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)^［27］和常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)^［28］觀察菌落形態(tài)，通過(guò)革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)^［28］。

1.4.2 生理生化鑒定

參照陳芳芳等的方法^［29］，采用API試劑條（梅里埃）和 API ZYM試劑條（梅里埃）對(duì)SB10進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定

挑取活化后的SB10單菌落，于NB培養(yǎng)基中 30 ℃ 200 r/min 條件下培養(yǎng) 12 h 后，1 000 g離心收集菌體，提取DNA，DNA純度檢測(cè)合格后，送測(cè)并做全基因組掃描圖分析^［22］。基于16S rDNA的比對(duì)鑒定結(jié)果，將SB10的全基因序列與NCBI及EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，使用UBCG（http：//172.16.20.20：8080/BioUI/Task QueryListener）建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap值設(shè)置為1 000）^［22］。

1.5 菌株SB10廣譜抑菌性試驗(yàn)

采用平板對(duì)峙法評(píng)估青枯雷爾氏拮抗菌SB10的廣譜抑菌功能，選擇表1中作物常見病害病原菌為靶向病原菌，細(xì)菌病原菌拮抗平板選擇NA培養(yǎng)基，真菌病原菌拮抗平板選擇PDA培養(yǎng)基，具體操作參考謝永麗的方法^［30］，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

1.6 菌株SB10對(duì)番茄青枯病防治效果試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)于2021年11月26日在廣東省科學(xué)院微生物研究所（廣東省廣州市越秀區(qū)）100號(hào)大院59號(hào)樓光照培養(yǎng)室進(jìn)行，共設(shè)7個(gè)處理（表2），每個(gè)處理5次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。將土壤和沙按 3 ∶1 體積比混勻后裝入圓盆中，每盆500 g基質(zhì)，移入1株番茄苗，移栽7 d后進(jìn)行病原菌和生防菌劑的處理^［22］。生防菌劑的制備：SB10挑取單菌落制備種子液，按照2%接種量接種至NB培養(yǎng)液中，于30 ℃、200 r/min 搖床中培養(yǎng)24 h制備發(fā)酵液，調(diào)節(jié)D_{600 nm}到1.0，即為SB10的發(fā)酵液（有效活菌數(shù)為4.3×10₇ CFU/mL）^［22］。將一半SB10菌液 6 000 r/min，10 min 離心后取其菌體，采用0.9%生理鹽水重懸，即為SB10菌體生理鹽水重懸液，灌根接種。病原菌菌液制備：將活化好的青枯雷爾氏菌菌株HB23接到NB培養(yǎng)基中，同樣方法培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制備成病原菌菌液（有效活菌數(shù)為2.5×10₉ CFU/mL）。病原菌的接種采用傷根灌注接種法，菌液接入量為20 mL/盆^［22］。試驗(yàn)處理為：對(duì)照組（CK）為清水對(duì)照；病原菌對(duì)照組為接種20 mL青枯雷爾氏菌菌液和20 mL無(wú)菌生理鹽水（A1）或者20 mL NB液體培養(yǎng)基（A2）；預(yù)防組處理為：先接種20 mL SB10生防菌劑（B1接種SB10菌體生理鹽水重懸液/B2接種SB10發(fā)酵液），24 h后接種20 mL青枯雷爾氏菌菌液；治療組處理為：先接種20 mL青枯雷爾氏菌菌液，5 d后發(fā)病接種20 mL SB10生防菌劑（C1接種SB10菌體生理鹽水重懸液/C2接種SB10發(fā)酵液）。

番茄苗經(jīng)處理后置于光照培養(yǎng)室中，控溫至 30 ℃ 左右，控濕至80%左右，隨機(jī)區(qū)組擺放，按照20%土壤含水量稱重澆水。每天觀察，待番茄植株處理5 d后發(fā)病，按照Kempe對(duì)青枯病的發(fā)病級(jí)別劃分^［31］，發(fā)病7 d后統(tǒng)計(jì)以下指標(biāo)：植株發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100%；病情指數(shù)（DI）=［∑（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)別數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)別值）］×100；相對(duì)防效（BE）=［（對(duì)照組的病情指數(shù)-試驗(yàn)處理組的病情指數(shù)）/對(duì)照組的病情指數(shù)］×100%^［31］。

1.7 菌株SB10對(duì)番茄促生效果試驗(yàn)

促生試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，即CK為清水對(duì)照，SB10為接種貝萊斯芽孢桿菌SB10的菌體重懸液，每個(gè)處理3次重復(fù)。SB10的菌體重懸液制備方法同“1.6”節(jié)中菌體生理鹽水重懸液的制備。番茄苗移栽7 d后，每盆按照5×10₉ CFU接種量接入SB10菌體重懸液，對(duì)照接入等體積水。整個(gè)試驗(yàn)周期為30 d，試驗(yàn)周期內(nèi)共處理3次，間隔10 d處理1次。置于溫室大棚中培養(yǎng)，每天定量澆水至土壤含水量保持在20%左右，培養(yǎng)30 d后測(cè)定番茄株高、莖粗及地上部、地下部的鮮干重。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPAdes Contigs Filter拼接SB10的全基因組序列。功能性基因由RSAT進(jìn)行注釋。通過(guò)anti SMASH （https：//dl.secondarymetabolites.org/ releases/4.0.2/）軟件對(duì)樣本的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得代謝產(chǎn)物基因注釋結(jié)果。

生防試驗(yàn)和促生盆栽試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用軟件IBM SPSS Statistics Version 21.0進(jìn)行方差分析（ANOVA，Turkey’s HSD檢驗(yàn)）、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析（ANOVA，Turkey’s HSD檢驗(yàn)），表格等使用軟件Microsoft Excel 2007進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯雷爾氏菌病原菌的分離

菌株HB23分離自生姜患病根部組織，經(jīng)16S rRNA鑒定為青枯雷爾氏菌。圖1-A中青枯雷爾氏菌單菌落在TTC平板上邊緣為白色，中間為粉紅色，具有致病力，圖1-B中青枯雷爾氏菌單菌落為鮮紅色，不具有致病力，同時(shí)根據(jù)柯赫氏法則傷根灌根回接確定其致病性。篩選圖1-A中邊緣為白色，中間為粉紅色的青枯雷爾氏菌具有致病力的單菌落進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌株SB10的分離和篩選

從土壤樣品和生姜組織中共分離篩選出56株菌落形態(tài)有差異的菌株，初篩后得到6株青枯雷爾氏菌生防菌株，經(jīng)復(fù)篩，其中分離自生姜組織的內(nèi)生菌SB10菌株對(duì)青枯雷爾氏菌抑制效果最好，且效果穩(wěn)定，抑菌圈直徑為3.0 cm，其平板抑菌效果如圖2所示。

2.3 菌株SB10廣譜抑菌效果

由圖3可知，菌株SB10對(duì)立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌及大麗輪枝孢菌等3種常見病原真菌及柑橘黃單胞桿菌、燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N及青枯雷爾氏菌3種病原細(xì)菌具有明顯的抑制作用。其中，貝萊斯芽孢桿菌SB10對(duì)大麗輪枝孢菌的抑制效果最明顯，抑菌圈直徑最大可達(dá)6 cm，對(duì)立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、柑橘黃單胞桿菌、燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N、青枯雷爾氏菌病原菌的抑菌圈直徑為3 cm及以上。

2.4 菌株SB10的鑒定

2.4.1 形態(tài)鑒定

由圖4可知，SB10單菌落在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上呈白色、圓形、不透明狀、表面粗糙，邊緣微凸起，菌落直徑為1～3 mm（圖4-A）。革蘭氏陽(yáng)性菌，顯微鏡下菌體呈桿狀（圖4-B）。

2.4.2 生理生化鑒定

由表3可知，SB10菌株生理生化指標(biāo)中，硝酸反應(yīng)和明膠反應(yīng)為陽(yáng)性，可以水解β-葡萄糖苷酶，可以產(chǎn)生堿性磷酸鹽酶、酯酶、類脂肪酶和苯酚-AS-BI-磷酸水解酶。

2.4.3 分子生物學(xué)鑒定

由圖5可知，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，菌株SB10與Bacillus velezensis NRRL B-41580聚在了一支上，且2株菌株相似性為99.8%，而且SB10與Bacillus velezensis NRRL B-41580的平均核苷酸相似度（ANI）為98.29%，大于96%，可聚類為同種菌株。綜上所述，菌株SB10鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。該菌株作為專利菌株（專利保藏編號(hào)為 GDMCC NO.62370）保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（2021.10.11）。

2.4.4 基因注釋分析

由表4可知 SB10菌株經(jīng)基因組測(cè)序獲得掃描圖，共獲得4 073 835 bp序列，將其進(jìn)行拼接，有825個(gè)序列。經(jīng)RAST注釋，有28%的基因被注釋。其中促生相關(guān)的基因，注釋到11個(gè)鐵載體基因和3個(gè)生長(zhǎng)素生物合成基因。生長(zhǎng)素合成基因有APRT、PRAI、TSa，與鐵載體相關(guān)的基因有dhbB、dhbC、dhbE、dhbF。

本研究利用anti SMASH 對(duì)菌株SB10進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物基因預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，菌株SB10編碼7種次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，其中包括與生防相關(guān)的基因簇有非核糖體肽合成酶NRPS、聚酮化合物PKS、RiPP-like、T3PKS、Terpene、Trans-AT PKS、Tropodithietic acid，均未比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)已知信息，可能為該菌株特有。

2.5 菌株SB10對(duì)番茄青枯病的防治效果

由表5可知，SB10菌劑對(duì)番茄青枯病具有預(yù)防作用。相較于A1組（只接病原菌），提前接種SB10菌體重懸液（B1）降低發(fā)病率至60%，顯著降低病情指數(shù)至15，相對(duì)防效達(dá)到85%；相較于A2組（只接病原菌），提前接種SB10發(fā)酵液（B2）降低發(fā)病率至60%，病情指數(shù)顯著降低至20，相對(duì)防效達(dá)到80%。以上結(jié)果表明，SB10菌劑無(wú)論菌體重懸液還是發(fā)酵液，均對(duì)番茄青枯病有顯著的預(yù)防作用。

SB10菌劑對(duì)番茄青枯病具有一定的治療作用，由表5可知，相較于A1組，后接種SB10菌體重懸液（C1）顯著降低發(fā)病率至50%，降低病情指數(shù)至50，相對(duì)防效達(dá)到50%；相較于A2組，后接種SB10發(fā)酵液（C2）降低發(fā)病率至83%，降低病情指數(shù)至58，相對(duì)防效達(dá)到42%。

SB10菌體重懸液和發(fā)酵液對(duì)青枯雷爾氏菌的作用存在差異，相較于A2，SB10菌體重懸液（B1）和SB10發(fā)酵液（B2）處理的發(fā)病率軍降低至60%，但SB10菌體重懸液降低病情指數(shù)15低于發(fā)酵液病情指數(shù)20，SB10菌體重懸液對(duì)青枯雷爾氏相對(duì)防效85%高于發(fā)酵液的相對(duì)防效80%，雖沒有達(dá)到顯著水平，但表明可能是SB10菌體在生防作用中起到主要作用。

2.6 菌株SB10對(duì)番茄植株的促生效果

由表6可知，相較于對(duì)照組，SB10處理組極顯著促進(jìn)了番茄植株地上部鮮重增加，且番茄植株的地上部和地下部的鮮重、干重以及株高均增加，但未達(dá)到顯著水平。結(jié)果表明，SB10具有顯著促生作用，且在持續(xù)的觀察中發(fā)現(xiàn)SB10菌劑處理組番茄葉片整體更為翠綠，開花更早。

3 討論

生物防治是防控番茄青枯病的有效途徑^［7］，功能菌種貝萊斯芽孢桿菌對(duì)常見植物病害病原菌具有廣譜抑菌功能^［32］。平板拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌SB10對(duì)香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌具有抑制作用，這與萬(wàn)青等的平板拮抗試驗(yàn)結(jié)果具有一致性，其篩選出的貝萊斯芽孢桿菌B18平板對(duì)峙試驗(yàn)中對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率為 44.17%^［33］。本試驗(yàn)中貝萊斯芽孢桿菌SB10對(duì)于水稻紋枯病病原菌立枯絲核菌、棉花黃萎病病原菌大麗花輪枝孢菌病原真菌以及番茄青枯病病原菌青枯雷爾氏菌、哈密瓜角斑病病原菌燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N、柑橘潰瘍病病原菌柑橘黃單胞桿菌等3種病原細(xì)菌具有顯著的抑制作用，其抑菌圈直徑大于3 cm，表明菌株SB10具有廣譜抑菌功能，雖然抑菌活性大小有差異，但具有生防菌劑研發(fā)的潛力，這與郭佳的試驗(yàn)結(jié)果相似，其篩選的菌株 GS-7 對(duì)黃瓜灰霉病病菌、香蕉葉枯病病菌、梨腐爛病病菌和棉花枯萎病病菌都有抑制作用^［34］。

本試驗(yàn)對(duì)SB10進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)基因注釋和次生代謝產(chǎn)物基因預(yù)測(cè)來(lái)探尋其潛在的生防促生機(jī)制，菌株SB10編碼7種次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，其中包括與生防相關(guān)的基因簇有非核糖體肽合成酶NRPS、聚酮化合物PKS（polyketides）、RiPP-like、T3PKS、Terpene、Trans-AT PKS、Tropodithietic acid。這些基因簇雖未比對(duì)至數(shù)據(jù)庫(kù)中具體產(chǎn)物種類（可能為該菌株特有），但與抗生素的合成緊密相關(guān)，如表面活性素、伊枯草素和豐原素等脂肽類物質(zhì)和聚酮類物質(zhì)，可以裂解細(xì)胞或者抑制病原菌，是生防菌抑菌機(jī)制之一^［35］。吳黎明在B.amyloliquefaciens FZB42代謝產(chǎn)物中分離得到聚酮活性物質(zhì)Bacilysin和Difficidin，對(duì)Xanthomona spp.（黃單胞菌）有顯著抑制效果^［36］。劉雪嬌等研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15 能夠產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物如表面活性素等抑菌物質(zhì)，能夠抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)率至93.2%，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致菌絲膨大、彎曲、纏繞、螺旋等變形甚至斷裂等^［37］。

番茄生防盆栽試驗(yàn)中生防預(yù)防組B1菌體生理鹽水菌懸液處理組顯著降低發(fā)病率至60%，生防治療組C1菌體生理鹽水重懸液處理組顯著降低發(fā)病率至50%，這表明SB10菌株成功定殖到土壤中，并對(duì)青枯雷爾氏菌起到抑制作用，通過(guò)生態(tài)位或者養(yǎng)分的競(jìng)爭(zhēng)抑制病原菌可能是貝萊斯芽孢桿菌SB10防治番茄青枯病的機(jī)制之一，這與Perea-Molina等的研究結(jié)果相似，其試驗(yàn)結(jié)果表明B. velezensis IBUN 2755，通過(guò)特定生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)，減少水稻植株中細(xì)菌性谷枯病莢殼伯克霍爾德菌的數(shù)量 是該菌株的生防機(jī)制之一^［38］。相較于CK，生防預(yù)防組菌體發(fā)酵液處理組B2和生理鹽水菌懸液處理組B1的發(fā)病率均為60%，表明SB10對(duì)青枯雷爾氏菌的防治機(jī)制可能以競(jìng)爭(zhēng)作用或者誘導(dǎo)植物免疫抗性為主，SB10發(fā)酵液代謝產(chǎn)物起到較小作用。這與 Abo-Elyousr 等的結(jié)果具有相似性，其分離出的泛菌PYTOPO2菌體重懸液處理組對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制作用大于其發(fā)酵液的抑制作用^［39］。

貝萊斯芽孢桿菌SB10對(duì)青枯雷爾氏菌具有預(yù)防和治療作用，鄭雪芳等的研究表明，提前接種耐寒短桿芽孢桿菌FJAT-20261或特基拉芽孢桿菌 FJAT-19700菌液對(duì)番茄青枯菌的防效分別達(dá)72.73%和67.77%^［3］。貝萊斯芽孢桿菌SB10對(duì)青枯雷爾氏菌的預(yù)防作用優(yōu)于其治療作用，可能與青枯菌致病機(jī)制相關(guān)，青枯菌病原菌侵染植株后在維管束內(nèi)迅速繁殖，會(huì)分泌一些糖類和蛋白，阻塞植株

的運(yùn)輸器官，導(dǎo)致植物缺失水分養(yǎng)分而死^［40］，由雷爾氏菌引起的青枯病一旦發(fā)病，其治療難度增加，因此在農(nóng)業(yè)應(yīng)用上較推薦提前施用生防菌劑來(lái)防治病害的發(fā)生。

貝萊斯芽孢桿菌SB10菌劑處理極顯著增加了番茄植株的地上部鮮重，促進(jìn)了番茄的生長(zhǎng)，這與Dhouib等的試驗(yàn)結(jié)果一致，表明貝萊斯芽孢桿菌可能分泌如 IAA、NH和ACC脫氨酶等多種植物激素等物質(zhì)，能夠促進(jìn)作物的生長(zhǎng)發(fā)育^［41］。貝萊斯芽孢桿菌SB10促進(jìn)番茄植株的生長(zhǎng)，提高植物對(duì)病原菌的防御能力，降低植物病害的發(fā)生可能是其生防機(jī)制之一。成娜娜的研究表明，B. velezensis J-4發(fā)酵液對(duì)辣椒根腐病防治效果達(dá)到58.01%，其發(fā)酵液顯著促進(jìn)了辣椒生物量的增加，對(duì)辣椒的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用^［42］。菌株對(duì)植物的促生機(jī)制可以是直接作用，歸因于養(yǎng)分的可利用性、生物固氮、細(xì)胞分裂的調(diào)控、植物激素的產(chǎn)生以及磷酸鹽的增溶作用和鐵載體的產(chǎn)生或者是間接作用^［3］，包括生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)、酶或者次生代謝產(chǎn)物等底物的競(jìng)爭(zhēng)、鐵載體或者揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生，這些物質(zhì)可以誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性^［40］。本試驗(yàn)對(duì)篩選出的促生菌株SB10進(jìn)行基因功能注釋，注釋到與生長(zhǎng)素合成相關(guān)的基因APRT、PRAI、TSa，與鐵載體相關(guān)的基因dhbB、dhbC、dhbE、dhbF，這些基因可能都與菌株SB10的促生相關(guān)。

生物防治在植物病蟲害防治和環(huán)境友好治理方面具有巨大的潛力。本試驗(yàn)篩選出的菌株SB10具有抑菌能力具有廣譜性，且對(duì)番茄青枯病具有較好的防治效果，同時(shí)可顯著增加番茄地上部的鮮重，可以作為具有促生和生物防治功能的菌劑開發(fā)潛力的高性能菌株。

4 結(jié)論

本研究從姜瘟病患病生姜組織分離篩選出1株青枯雷爾氏菌拮抗菌株貝萊斯芽孢桿菌SB10。菌株SB10的抑菌能力具有廣譜性，對(duì)立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、大麗輪枝孢菌病原真菌和青枯雷爾氏菌、燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N、柑橘黃單胞桿菌病原細(xì)菌具有顯著的抑制作用，其抑菌圈直徑均在3 cm及以上。生防盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SB10對(duì)青枯雷爾氏菌具有預(yù)防和治療作用，且其預(yù)防作用顯著高于治療作用，菌體重懸液的防治效果要優(yōu)于發(fā)酵液，推測(cè)菌株SB10對(duì)青枯雷爾氏菌的防治機(jī)制可能以養(yǎng)分或者生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)作用或者誘導(dǎo)植物免疫抗性為主，SB10發(fā)酵液代謝產(chǎn)物起到較小作用。促生盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，接種SB10菌株對(duì)番茄植株具有顯著促生作用，可能與生長(zhǎng)素合成基因相關(guān)。因此，貝萊斯芽孢桿菌SB10可以作為具有促生和生物防治功能的菌劑開發(fā)潛力的高性能菌株。

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