雜交水稻育種技術(shù)的發(fā)展與創(chuàng)新

摘要：近期，水稻無融合生殖研究取得了系列進(jìn)展。通過對水稻減數(shù)分裂基因和配子發(fā)育相關(guān)基因的編輯或表達(dá)調(diào)控，初步實(shí)現(xiàn)了水稻雜交種的自交傳代，為一系法雜交水稻成功實(shí)現(xiàn)奠定了重要基礎(chǔ)。本文對三系法、兩系法、智能不育系及一系法4種雜交水稻制種技術(shù)的歷史、現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹了各技術(shù)的分子生物學(xué)研究進(jìn)展及各自的優(yōu)缺點(diǎn)，并對各育種技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了展望，為后續(xù)創(chuàng)制優(yōu)良雜交水稻種子繁殖體系及進(jìn)一步發(fā)揮雜交水稻潛力提供參考。

關(guān)鍵詞：雜交水稻；細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；光/溫敏核雄性不育系；智能不育系；無融合生殖

中圖分類號(hào)：S511.035.1" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）19-0001-07

收稿日期：2024-03-19

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32200690）

作者簡介：張 超（1988—），男，山東濟(jì)寧人，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：chaozhang@yzu.edu.cn。

通信作者：于恒秀，博士，教授，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：hxyu@yzu.edu.cn。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球超過1/2的人口以稻米為主食^［1］。人口的持續(xù)增加、耕地面積的不斷減少及極端氣候的頻繁出現(xiàn)，使糧食安全面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。中國雜交水稻種植面積占比超過50%，占全國水稻總產(chǎn)量的60%以上，為我國乃至世界糧食增產(chǎn)做出了卓越貢獻(xiàn)^［2-3］。雜交水稻是利用雜種優(yōu)勢提高產(chǎn)量的成功應(yīng)用，也是解決日益嚴(yán)重的糧食短缺危機(jī)的關(guān)鍵技術(shù)之一。

雜種優(yōu)勢廣泛存在于生物界，它指2個(gè)不同遺傳背景的親本雜交產(chǎn)生的雜種F₁代在抗逆性、抗病性、適應(yīng)性、生長勢、產(chǎn)量和品質(zhì)等方面優(yōu)于親本的現(xiàn)象。雜種優(yōu)勢在作物改良方面的利用對提高產(chǎn)量具有顯著的效果。20世紀(jì)50年代，半矮稈基因sd1的鑒定利用和半矮稈作物品種培育促成了第1次“綠色革命”，這解決了發(fā)展中國家的糧食短缺問題^［4］。1926年，美國農(nóng)學(xué)家Jones率先提出了水稻具有雜種優(yōu)勢的理論，雜種優(yōu)勢的利用被認(rèn)為是“第二次綠色革命”。雜交水稻能獲得比常規(guī)水稻高15%以上的產(chǎn)量優(yōu)勢^［5-6］。

1963年，Henry Beachell于印度尼西亞首次成功培育出雜交水稻，隨后日本新城長友在1968年育成了具有Chinsurah Boro Ⅱ細(xì)胞質(zhì)的不育系臺(tái)中65，率先實(shí)現(xiàn)了粳型雜交水稻的3系配套。但由于親緣關(guān)系太近而優(yōu)勢較弱等問題，未能在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用^［7］。20世紀(jì)60年代，袁隆平鑒定了1個(gè)雄性不育野生稻品系，該品系攜帶野生稻敗育細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因（cytoplasmic male sterility-wild abortion，CMS-WA）。如今CMS-WA已經(jīng)滲入到各種水稻背景中，產(chǎn)生了許多CMS系，并在這些系的基礎(chǔ)上開發(fā)了“三系”雜交育種系統(tǒng)^［8-9］。1973年，石明松在湖北仙桃發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)光敏感雄性核不育水稻農(nóng)墾58S，拉開了基于光溫敏核不育基因（photoperiod/ thermo-sensitive genic male sterile，PTGMS）的“兩系”雜交稻系統(tǒng)的發(fā)展序幕^［10］。目前，雜交水稻種子生產(chǎn)主要以三系法和兩系法為主要繁殖體系。此外，近些年發(fā)展的水稻智能不育系及無融合生殖技術(shù)為雜交水稻育種提供了更多可能性，并指出了新的發(fā)展方向。

1 水稻三系法雜交育種技術(shù)研究現(xiàn)狀

三系法雜交水稻技術(shù)又被稱為“第一代雜交水稻技術(shù)”，該技術(shù)體系由細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系和恢復(fù)系組成。雄性不育系的雄性生殖器官發(fā)育不正常，花粉敗育，但其雌性生殖器官發(fā)育正常，可接受外來正常花粉受精結(jié)實(shí)。保持系的細(xì)胞質(zhì)基因正常，花粉可育，能夠自交結(jié)實(shí)繁殖，將保持系花粉授給不育系后產(chǎn)生的后代為不育系。恢復(fù)系具有能夠恢復(fù)不育系細(xì)胞質(zhì)雄性不育的核基因，與不育系雜交后產(chǎn)生的雜交種正?？捎?，可應(yīng)用于大面積水稻生產(chǎn)^［11-12］。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育系受到細(xì)胞質(zhì)不育基因和對應(yīng)的細(xì)胞核基因的共同控制，通常是由于編碼細(xì)胞毒性蛋白的異常線粒體基因干擾了植物正常代謝，產(chǎn)生多種異常生理反應(yīng)，導(dǎo)致花粉敗育^［13-15］。CMS根據(jù)不育機(jī)制和恢保關(guān)系的不同主要分為野生稻敗育細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS-WA）、紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS-HL）及包臺(tái)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS-BT），其中CMS-HL和CMS-BT是配子體不育型，CMS-WA是孢子體不育型^［16-17］。

CMS-WA是最早被發(fā)現(xiàn)并利用的一類不育胞質(zhì)類型，由線粒體基因WA352控制。該基因在花藥絨氈層特異表達(dá)，所編碼的蛋白可與核編碼的線粒體跨膜蛋白COX11互作，抑制COX11清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的功能。受到活性氧損害的絨氈層細(xì)胞程序性死亡提前，產(chǎn)生花粉敗育表型^［18］。水稻CMS-HL的不育基因是orfH79，而CMS-BT的不育基因是orf79。這2個(gè)基因都與線粒體嵌合基因atp6-orf79轉(zhuǎn)錄本相關(guān)，其序列相似性達(dá)到98%^［16］。orf79與復(fù)制的atp6基因（B-atp6）共轉(zhuǎn)錄。其編碼具有細(xì)胞毒性的多肽。免疫印記分析表明，ORF79蛋白在小孢子內(nèi)特異性積累，導(dǎo)致CMS-BT小孢子敗育^［19］。orfH79有2種存在方式，一種是與atp6共轉(zhuǎn)錄形成的融合轉(zhuǎn)錄本，另一種為orfH79的單獨(dú)轉(zhuǎn)錄本^{［16，19-20］}。關(guān)于CMS-HL的不育機(jī)制尚不完全明確。彭曉玨等利用原核系統(tǒng)證明微量的ORFH79天然蛋白強(qiáng)烈抑制了細(xì)菌生長，為思考水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理提供了研究線索^［21］。Wang等發(fā)現(xiàn)，ORFH79通過與電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅲ的亞基互作，影響了線粒體功能，導(dǎo)致花粉敗育^［22］。

保持系具有與CMS系相同的核基因，但不具有異常線粒體基因，表現(xiàn)為可育，通過自交可以繁殖保持系。保持系對不育系的異花授粉可以繁殖不育系^{［11-12，23］}?；謴?fù)系包含特定的育性恢復(fù)（Restorer of fertility，Rf）基因，其可通過作用于CMS基因的RNA或蛋白質(zhì)抑制相應(yīng)CMS基因功能，因此CMS的育性能夠在CMS系和恢復(fù)系的雜交種中得到恢復(fù)^{［12，24］}，例如CMS-WA基因育性可被Rf3和Rf4恢復(fù)。有研究表明，Rf3可能在WA352翻譯或翻譯后水平發(fā)揮作用，而Rf4在WA352的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用^{［18，23，25］}。CMS-BT基因育性可被Rf1a和Rf1b恢復(fù)。RF1A與RF1B均定位于線粒體，二者分別通過核酸內(nèi)切及mRNA降解途徑抑制ORF79的蛋白含量^［19］。CMS-HL基因育性可被Rf5和Rf6恢復(fù)。RF5參與融合轉(zhuǎn)錄本atp6-orfH79的剪接，而RF6可促進(jìn)該轉(zhuǎn)錄本的加工過程，從而恢復(fù)花粉育性^［26-27］。獲得的三系雜交種具有明顯的雜種優(yōu)勢^{［23，28-29］}。

南優(yōu)2號(hào)是我國第1個(gè)大面積推廣應(yīng)用的雜交水稻組合，由CMS-WA衍生而來，于1973年被發(fā)現(xiàn)，具有明顯的雜種優(yōu)勢^［30］。1980年，由謝華安等研發(fā)的汕優(yōu)63是我國推廣面積最大的雜交水稻組合，大面積生產(chǎn)，產(chǎn)量達(dá)到600 kg/667 m₂^［31］。由于雜交水稻在生產(chǎn)上具有明顯的產(chǎn)量優(yōu)勢，在我國迅速推廣，應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)^{［11，32-33］}。目前，我國推廣面積較大的雜交稻還有汕優(yōu)64、威優(yōu)64、汕優(yōu)2號(hào)、岡優(yōu)22、汕優(yōu)6號(hào)、威優(yōu)6號(hào)、Ⅱ優(yōu)838、D優(yōu)63、汕優(yōu)10號(hào)（國家水稻數(shù)據(jù)中心），這些品種的種植面積都超過了600萬hm₂。

三系法雜交水稻在產(chǎn)量上取得了巨大的成功，但可培育為不育系的水稻種質(zhì)資源較少，不育系選育效率低。受恢保關(guān)系制約，三系法配組不自由，雙親間遺傳差異小，導(dǎo)致水稻雜種優(yōu)勢難以充分利用。此外，部分不育系的育性受溫度影響發(fā)生波動(dòng)^{［9，32-34］}，這限制了三系法雜交水稻的產(chǎn)量提高及進(jìn)一步推廣。

2 水稻兩系法雜交育種技術(shù)研究現(xiàn)狀

“第二代雜交水稻技術(shù)”是以依賴于光溫敏核不育系的“兩系雜交水稻”^{［3-4，9，32，34］}。PTGMS育性受光照時(shí)長或溫度的影響，隨環(huán)境條件進(jìn)行轉(zhuǎn)換，可育條件下自交繁殖不育系，不育條件下與大多數(shù)常規(guī)水稻品種（兩系恢復(fù)系）雜交生產(chǎn)具有雜種優(yōu)勢的雜交種。根據(jù)影響其育性轉(zhuǎn)換的主要因素不同，通常將PTGMS分為2類，即光敏核不育（photoperiod-sensitive genic male sterile，PGMS）和溫敏核不育（thermo-sensitive genic male sterile，TGMS）。

PGMS的育性受到光周期的影響，一般可分為長光敏核不育型和短光敏核不育型。長光敏核不育型表現(xiàn)為在長日照條件下雄性不育，在短日照條件下育性恢復(fù)正常，短光敏核不育型則相反。典型的PGMS還受到溫度的負(fù)向互作。在我國各水稻研究中心，農(nóng)墾58S（NK58S）被廣泛用于將PGMS性狀轉(zhuǎn)移到粳稻和秈稻優(yōu)良品種（系）中。目前認(rèn)為控制粳稻農(nóng)墾58突變?yōu)镹K58S雄性不育的光敏核不育基因主要有pms1、pms2和pms3。有研究指出，pms1是不完全顯性基因，編碼1個(gè)長鏈非編碼RNA，在幼穗中表達(dá)量較高，是miRNA2118的作用靶標(biāo)。miRNA2118可以識(shí)別并剪切pms1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PMS1T，從而形成21 nt的phasiRNA（phased small-interfering RNAs）。NK58S在pms1基因上存在單堿基突變，導(dǎo)致在長日照條件下phasiRNA在水稻幼穗內(nèi)大量積累，從而造成雄性不育^［35］。pms2基因尚未克隆，其不育機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。Ding等克隆了pms3，其編碼1個(gè)長度為1 236 bp的長非編碼RNA（lncRNA）-LDMAR。由于在NK58S的LDMAR中發(fā)生了G到C的突變，改變了其RNA 2級(jí)結(jié)構(gòu)，并造成LDMAR的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度升高，導(dǎo)致在長日照條件下轉(zhuǎn)錄本減少，從而造成花藥程序化死亡提前，出現(xiàn)在長日照條件下雄性不育的現(xiàn)象^{［23，36］}。pms3在秈稻中的等位基因p/tms12-1不同于在粳稻NK58S中調(diào)控光敏核雄性不育基因，p/tms12-1在秈稻培矮64S（PA64S）背景中調(diào)控溫敏雄性不育，野生型P/TMS12-1是一個(gè)非編碼RNA基因，它的原始轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過至少2次加工產(chǎn)生1個(gè)小RNA。突變型p/tms12-1在該小RNA上產(chǎn)生單堿基突變（與pms3一致），導(dǎo)致p/tms12-1溫敏不育^［37］。R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子CSA調(diào)控水稻糖的分配，在水稻花粉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用^［38］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在秈稻及粳稻背景下，csa的花粉在短日照條件下表現(xiàn)不育，長日照條件下表現(xiàn)為可育。短日照條件下，CSA基因的表達(dá)量更高。CSA的同源基因MYB5和MYB8在長日照條件下具有更高的表達(dá)量。因此，CSA及其同源基因在不同光照條件下的功能互補(bǔ)可能是csa光敏不育的原因^［39］。

TGMS的育性受到環(huán)境溫度的影響。TMS5編碼1個(gè)保守的RNA酶Z^S1（RNaseZ^S1）。RNaseZ^S1能剪切并降解3個(gè)泛素核糖體L40融合蛋白基因Ub_L40mRNA。而在tms5突變體中，RNaseZ^S1功能缺失，不能對Ub_L40mRNA進(jìn)行切割降解。高溫導(dǎo)致Ub_L40mRNA過度積累，使花粉發(fā)育受阻，花粉敗育^［40-41］。水稻tms10高溫下表現(xiàn)為雄性不育，低溫條件下雄性可育。與其同源蛋白的雙突變體tms10 tms10l在高溫及低溫條件下均表現(xiàn)為不育。TMS10L可在常溫下互補(bǔ)TMS10的功能，從而使tms10突變體在常溫下表現(xiàn)雄性可育^［42］。組蛋白結(jié)合蛋白OsMS1的自然等位基因OsMS1^wenmin1可引起水稻溫敏雄性不育。高溫可導(dǎo)致OsMS1^wenmin1的蛋白含量降低，且減低幅度大于OsMS1^［43］。高溫敏感調(diào)控基因OsTMS19編碼五肽重復(fù)（pentatricopeptide repeat，PPR）蛋白。在高溫及長光照條件下，ostms19花藥中積累過多的活性氧，破壞了花粉內(nèi)壁的形成，造成雄性不育。這種活性氧的動(dòng)態(tài)平衡與育性轉(zhuǎn)換的關(guān)系在其他PTGMS中也存在，表明活性氧的調(diào)控可能是水稻PTGMS育性轉(zhuǎn)換的普遍機(jī)制^［44］。唐杰等鑒定到育性受光溫影響的雄性不育突變體tms3650，但控制該性狀的基因尚未克隆，不育機(jī)制還有待進(jìn)一步研究^［45］。

相對于三系法雜交水稻，兩系法雜交水稻不需要保持系來繁殖雄性不育系，這大大簡化了雜交育種的程序。此外，PTGMS系的雄性不育由隱性核基因控制，它們可以與任何攜帶野生型育性基因的植株雜交，以恢復(fù)雜種的生育能力，這使得雜交組配更加自由，促使大多數(shù)種質(zhì)資源的雜種優(yōu)勢得到開發(fā)利用^{［9，32，34，46］}。據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心提供的數(shù)據(jù)，2017—2021年期間通過國家審定的水稻品種中，兩系法雜交水稻占比57.3%。但是，PTGMS的育性容易受到環(huán)境影響，在不可預(yù)測的環(huán)境條件下，光溫敏不育系面臨育性轉(zhuǎn)換臨界溫度不穩(wěn)定的問題，特別是不能穩(wěn)定保持的環(huán)境溫度容易導(dǎo)致PTGMS種子和雜交種子的生產(chǎn)失敗，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來損失^［47-48］。

3 水稻“智能不育系”育種技術(shù)研究現(xiàn)狀

利用基因工程技術(shù)改造普通核不育系，是進(jìn)一步利用水稻雜種優(yōu)勢的新型育種技術(shù)體系。普通核不育系僅由1對隱性基因控制，任何品系都能轉(zhuǎn)育成為不育系，任何品系都能作為普通核不育系的恢復(fù)系。同時(shí)，普通核不育系花粉敗育徹底，不育性穩(wěn)定^［49］。普通核不育系和父本能夠不斷擴(kuò)大遺傳差異，同時(shí)本身可以結(jié)合任何優(yōu)良基因，聚合各種優(yōu)良性狀，不受遺傳背景限制，能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)育種，因此又稱為智能不育系。由于純合隱性雄性不育系的完全敗育難以在生產(chǎn)中大量繁殖，限制其在雜種優(yōu)勢利用中的應(yīng)用價(jià)值。1993年，Williams等提出一種轉(zhuǎn)基因保持系的新策略，即通過用雄性育性恢復(fù)基因和花粉致死基因連鎖表達(dá)轉(zhuǎn)化隱性雄性不育植物，從而創(chuàng)建水稻保持系，通過保持系的自交可以繁殖雄性不育系和保持系種子^［50］。2002年，Perez-Prat等提出了引入第3個(gè)標(biāo)記基因的想法，即用育性恢復(fù)基因、選擇標(biāo)記基因（種子顏色基因）和花粉致死基因，這3個(gè)基因構(gòu)建緊密連鎖表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化雄性不育突變體，以產(chǎn)生保持系。保持系自交授粉的后代將產(chǎn)生比例為 1 ∶1 的雄性不育系種子和帶顏色保持系種子，兩者可以通過顏色選擇標(biāo)記進(jìn)行分選，雄性不育系可以用于配置雜交種^［51］?；谏鲜鱿敕ǎ?006年Dupont Pioneer率先在玉米中開發(fā)了雄性不育系種子生產(chǎn)技術(shù)（the seed production technology，SPT）。利用雄性不育的育性恢復(fù)基因Ms45、花粉特異啟動(dòng)子PG47控制的玉米編碼α-淀粉酶基因ZmAA1和紅色熒光蛋白基因DsRed2這3個(gè)基因緊密連鎖的構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化玉米雄性不育突變體ms45，從而生產(chǎn)保持系。Ms45可以恢復(fù)雄性不育突變體ms45的雄性育性?；ǚ厶禺悊?dòng)子PG47控制下的Zm-aa1用來防止花粉中的淀粉積累，從而特異性地使攜帶轉(zhuǎn)基因成分的花粉失活，使只有非轉(zhuǎn)基因花粉才能參與受精結(jié)實(shí)。紅色熒光蛋白基因DsRed2用作識(shí)別后代是否攜帶轉(zhuǎn)基因成分的顏色篩選標(biāo)記^［52］。雜合轉(zhuǎn)基因植物恢復(fù)雄性育性并產(chǎn)生1 ∶1的不帶轉(zhuǎn)基因的可育花粉粒和帶轉(zhuǎn)基因的不育花粉粒。由于轉(zhuǎn)基因不影響雌性器官的育性，轉(zhuǎn)基因植物自花授粉產(chǎn)生2種種子。一種是攜帶轉(zhuǎn)基因且被標(biāo)記為紅色熒光的種子，為保持系；另一種是非轉(zhuǎn)基因沒有顏色的種子，為雄性不育系，這2種種子可以通過熒光機(jī)械化分選。SPT技術(shù)自2012年起已經(jīng)在美國被應(yīng)用于玉米雜交種生產(chǎn)，且生產(chǎn)的雜交玉米被美國、澳大利亞和日本的監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)證為非轉(zhuǎn)基因玉米^［53］。盡管SPT技術(shù)最早是在玉米中開發(fā)的，但它對于不易人工去雄的作物，如水稻、小麥、油菜等具有兩性花的作物更有適用性。

2010年，Wang等在水稻中采用了相同的方法，將花粉特異啟動(dòng)子PG47驅(qū)動(dòng)下的玉米α-淀粉酶基因Zm-aa1、糊粉酮特異性LTP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的紅色熒光蛋白DsRed2與水稻Ms26基因（OsCYP704B2）緊密相連，轉(zhuǎn)化進(jìn)粳稻背景下的Oscyp704b2雄性不育突變體中^［54］。由此產(chǎn)生了攜帶單拷貝轉(zhuǎn)基因插入的保持系，保持系自交產(chǎn)生了比例為1 ∶1的帶熒光種子和不帶熒光種子，表明該技術(shù)在水稻生產(chǎn)上具有應(yīng)用潛力。然而，由于水稻種子具有穎殼，給利用紅色熒光標(biāo)記進(jìn)行水稻種子分選帶來難度^［55］。2014年，于恒秀等提出利用對除草劑敏感性差異建立雜交水稻種子繁殖體系，利用水稻中OsCYP81A6基因的功能喪失會(huì)破壞水稻對磺酰脲類除草劑如苯達(dá)松的抗性這一原理，將OsCYP81A6基因的RNA干擾結(jié)構(gòu)與水稻隱性雄性核不育基因的育性恢復(fù)基因和花粉致死基因緊密連鎖構(gòu)建成連鎖結(jié)構(gòu)，再轉(zhuǎn)入相應(yīng)的雄性不育系中獲得保持系，保持系自交后代只需要噴灑磺酰脲類除草劑如苯達(dá)松就可以將可育株去除，篩選出雄性不育株^［56］。同時(shí)，在載體構(gòu)建時(shí)可以引入對另一類除草劑具有抗性的基因（如BAR基因），通過施用另一類除草劑噴施來提高保持系的制種產(chǎn)量^［57］。

2016年，Chang等利用源自甲基磺酸乙酯（EMS）誘變的秈稻品種黃華占（HHZ）的隱性雄性不育突變體Osnp1（Oryza sativa No Pollen 1）和相應(yīng)的育性恢復(fù)基因OsNP1構(gòu)建了新核雄性不育系繁殖體系。HHZ是一個(gè)半矮稈、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)秈稻品種，在我國廣泛種植。OsNP1編碼絨氈層退化和花粉外壁形成所需的葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，Osnp1突變體在不同環(huán)境條件下均呈現(xiàn)穩(wěn)定的雄性不育。將OsNP1基因、由花粉特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Zm-aa1以及由糊粉特異性LTP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白DsRed連鎖表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入Osnp1突變體中，通過篩選和鑒定獲得了一個(gè)名為Zhen18B的保持系，該保持系攜帶有單拷貝轉(zhuǎn)基因^［58］。Zhen18B在形態(tài)、生長發(fā)育和結(jié)實(shí)方面與HHZ沒有差異，但自交產(chǎn)生的種子為1 ∶1的帶熒光轉(zhuǎn)基因種子和不帶熒光非轉(zhuǎn)基因種子，帶熒光種子為保持系Zhen18B，而不帶熒光種子為雄性不育系，命名為Zhen18A。在以Zhen18A為母本與其他水稻種質(zhì)的雜交試驗(yàn)中，約85%的單株產(chǎn)量超過親本^［59］。這些結(jié)果證明該系統(tǒng)在雜交水稻生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

2021年，李莉等利用基因編輯技術(shù)敲除細(xì)胞色素P450羥化酶編碼基因CYP703A3，成功獲得了雄性不育突變體9311^03a3。突變體9311^03a3的花粉量顯著減少，僅觀察到少量皺縮的不育花粉粒。將花粉育性恢復(fù)基因CYP703A3、花粉致死基因orfH79和選擇標(biāo)記基因DsRed2構(gòu)建的三元素連鎖表達(dá)載體通過幼穗愈傷組織轉(zhuǎn)化進(jìn)突變體9311^03a3，通過鑒定篩選獲得了保持系9311-3B。通過自交保持系9311-3B，產(chǎn)生了含轉(zhuǎn)基因成分的保持系9311-3B和不含轉(zhuǎn)基因成分的雄性不育系9311-3A，且兩者比例為1 ∶1。以9311-3A為母本與優(yōu)良品種雜交，與對照相比產(chǎn)量增加了13%以上^［60-61］。

唐曉燕團(tuán)隊(duì)利用干擾技術(shù)，降低糖代謝相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)水平，使含有干擾載體的種子胚乳皺縮，重量變輕，但NMS種子胚乳正常且較重。通過重量分選機(jī)，可以輕松、準(zhǔn)確地將保持系種子從NMS種子中分選出來，從而獲得純凈、飽滿的NMS種子。該系統(tǒng)以種子重量為篩選機(jī)制較之前用DsRed2的篩選機(jī)制，避免了因熒光信號(hào)弱而無法分選保持系種子與雄性不育系種子的問題。同時(shí)基于重量的分選機(jī)器較基于熒光的分選機(jī)器更為常見且成本低，工作效率更高^［62］。此外，Pak等利用CRISPR/Cas9技術(shù)在中花11號(hào)（ZH11）中敲除OsOPR7基因，獲得了雄性不育突變體，經(jīng)過篩選得到了能夠通過外源施加茉莉酸甲酯恢復(fù)育性的雄性不育系^［63］。

智能不育系以普通核不育系為基礎(chǔ)，通過基因工程技術(shù)創(chuàng)制遺傳工程雄性不育系，完美解決了純雄性不育無法商業(yè)化生產(chǎn)的問題，具有育性穩(wěn)定和組配自由的優(yōu)點(diǎn)，且生產(chǎn)的種子不含有轉(zhuǎn)基因成分，是創(chuàng)制優(yōu)良雜交水稻種質(zhì)、提高水稻產(chǎn)量的重要技術(shù)。

4 無融合生殖水稻的興起

一系法雜交水稻主要利用水稻無融合生殖，即不經(jīng)過減數(shù)分裂和雌雄配子融合而產(chǎn)生種子的繁殖方式。二倍體無融合生殖可使世代更迭但不會(huì)改變基因型，后代的遺傳構(gòu)成與母本相同，因此可以固定雜種優(yōu)勢，育成性狀不分離的雜交種。

2016年，Mieulet等在水稻中將3個(gè)減數(shù)分裂關(guān)鍵基因REC8、PAIR1和OSD1通過CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)生的突變體兩兩雜交，成功地將減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變?yōu)橛薪z分裂，創(chuàng)制出MiMe（Mitosis instead of Meiosis）材料，為在水稻中引入無融合生殖建立了基礎(chǔ)^［64］。2018年，Khanday等發(fā)現(xiàn)AP2家族轉(zhuǎn)錄因子BBM1在受精后的胚胎發(fā)生過程中發(fā)揮中作用，卵細(xì)胞中異位表達(dá)BBM1基因可以觸發(fā)水稻孤雌生殖。將BBM1基因的異位表達(dá)與MiMe結(jié)合，可以得到雜交種子的克隆后代，且可進(jìn)行多代穩(wěn)定遺傳^［65］。2019年，Wang等在水稻雜交種中同時(shí)編輯單倍體誘導(dǎo)基因OsMTL和MiMe相關(guān)基因，獲得了無融合生殖的Fix（fixation of hybrids）材料，獲得了雜交水稻的克隆種子，但克隆種子誘導(dǎo)率和結(jié)實(shí)率均偏低^［66］。2022年，Vernet等優(yōu)化轉(zhuǎn)基因策略，獲得了克隆種子誘導(dǎo)率超過95%的無融合生殖株系^［67］。2023年，王克劍團(tuán)隊(duì)利用擬南芥卵細(xì)胞特異啟動(dòng)子pDD45驅(qū)動(dòng)BBM4，發(fā)現(xiàn)BBM4卵細(xì)胞異位表達(dá)植株可以誘導(dǎo)孤雌生殖，獲得了無融合生殖的Fix2植株。Fix2植株結(jié)實(shí)率與野生型相同，但克隆種子誘導(dǎo)率偏低（3.2%）^［68］。2024年，Dan等在MiMe材料中利用擬南芥卵細(xì)胞特異啟動(dòng)子AtDD45驅(qū)動(dòng)BBM1基因，在高結(jié)實(shí)率的情況下（6816%），獲得的克隆種子比率高達(dá)90.79%。該研究發(fā)現(xiàn)，異位表達(dá)BBM1基因并結(jié)合MiMe會(huì)產(chǎn)生多胚現(xiàn)象（1粒種子含有多個(gè)胚）及孤雌生殖頻率的隔代遺傳現(xiàn)象，相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究^［69］。

5 展望

三系法和兩系法作為目前雜交水稻育種的主要手段，還有較大的改進(jìn)空間。三系法雜交水稻的育性受到恢保關(guān)系的制約，可供選擇的恢復(fù)系及保持系較少，雜交組合的選擇自由度低。兩系法育性轉(zhuǎn)換溫度偏高或不穩(wěn)定而導(dǎo)致的育性波動(dòng)是制約其可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。目前，光溫敏核不育系的不育基因資源來源相對單一，需要發(fā)掘更多的光溫敏核不育系，拓寬光溫敏不育系種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。最近的研究表明，一些水稻花粉育性調(diào)控基因的弱等位突變體表現(xiàn)為溫敏不育，這為兩系法雜交水稻的發(fā)展提供了新的思路^［70-72］。

智能不育系在理論創(chuàng)新和技術(shù)儲(chǔ)備上都已達(dá)到實(shí)用化的程度。由于水稻種子有穎殼包裹，常用的紅色熒光篩選機(jī)制在水稻中的精準(zhǔn)度并不理想，容易在普通核不育系中混入含轉(zhuǎn)基因成分的保持系種子。另外，熒光分選機(jī)械的分選效率較低、操作復(fù)雜。因此，研發(fā)一臺(tái)高精度、高效率、操作簡便的分選機(jī)械是推動(dòng)以熒光分選為基礎(chǔ)的智能不育系系統(tǒng)發(fā)展的基礎(chǔ)。除了熒光分選機(jī)制以外，其他篩選機(jī)制例如基于種子重量和除草劑抗性等也是在構(gòu)建NMS系統(tǒng)時(shí)的優(yōu)良選擇。其中種子重量的變化對后代發(fā)育是否有影響還需進(jìn)一步研究，而除草劑的使用在田間生產(chǎn)中較為常見，不會(huì)影響水稻產(chǎn)量，且在苗期就可以實(shí)現(xiàn)分選。施用化學(xué)藥劑使雄性不育株恢復(fù)育性是創(chuàng)制不育系的創(chuàng)新思路，但化學(xué)復(fù)雄如何能不影響雜交后代種子的發(fā)芽率以及藥劑殘留是否會(huì)對人體健康產(chǎn)生影響，這都是需要考慮和解決的問題。

一系法的發(fā)展，是科學(xué)與工程結(jié)合的典范?；蚓庉嬍侄蔚膭?chuàng)新和作物功能基因組學(xué)的發(fā)展，使成功培育一系法雜交水稻逐漸成為可能。當(dāng)前，MiMe體系已經(jīng)非常成熟，獲得不重組的二倍體配子的效率達(dá)到 100%。孤雌生殖基因的發(fā)掘及改良（比如與MiMe結(jié)合后的實(shí)際效應(yīng)）是一系法雜交水稻研究的重點(diǎn)。已有研究指出，克隆種子的比例與結(jié)實(shí)率存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，且克隆種子比例在代際之間存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象^［69］。這些是一系法走向商業(yè)化應(yīng)用需要解決的問題。

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