伊維菌素澆潑溶液在牛組織中的殘留和消除規(guī)律

摘要：為研究伊維菌素澆潑溶液在牛組織中的殘留消除規(guī)律，500 μg/kg·bw，單次給藥，由背中線澆注伊維菌素澆潑溶液，分別于用藥后7、14、28、48 d用高效液相色譜熒光檢測(cè)法（HPLC-FLD）檢測(cè)牛肌肉、肝臟、腎臟、皮下脂肪以及給藥部位肌肉中伊維菌素的殘留量。HPLC-FLD方法的檢測(cè)限（LOD）為2 μg/kg，定量限（LOQ）為5 μg/kg。結(jié)果表明，以500 μg/kg背部澆淋后，伊維菌素在牛體內(nèi)代謝緩慢，在肝臟組織中的殘留量遠(yuǎn)高于其他組織。伊維菌素在組織中的殘留量：肝臟＞脂肪＞給藥部位＞腎臟＞肌肉。肝臟在給藥后7 d達(dá)到最大濃度306 μg/kg，除肝臟外，肌肉、腎臟、皮脂以及給藥部位肌肉均在給藥后28 d，組織濃度低于最高殘留限量；肝臟在第48天時(shí)，其濃度才低于最高殘留限量；根據(jù)WT1.4軟件分析，參照農(nóng)業(yè)部235公告和歐盟關(guān)于IVM在牛組織中規(guī)定的MRL，測(cè)得各組織的休藥期分別為：肌肉21.2 d、肝臟42.1 d、腎臟21.5 d、皮脂39.9 d、給藥部位肌肉31 d。因此伊維菌素澆潑溶液的休藥期為43 d。

關(guān)鍵詞：伊維菌素澆潑溶液；透皮；高效液相色譜；熒光檢測(cè)器；殘留消除規(guī)律；休藥期

伊維菌素（ivermectin，IVM）是目前公認(rèn)的具有廣譜、高效、低毒、低殘留的大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，對(duì)家畜的胃腸道線蟲、外寄生蟲（蜱、虱、螨、蠅蛆等）有特殊的療效，在臨床上被廣泛使用。已有的研究表明，不同畜種、不同藥物劑型、不同給藥途徑使IVM的藥代動(dòng)力學(xué)有明顯差異。IVM通過(guò)皮膚涂抹的滲透性極低，滲透是涂抹量的0.17%～0.55%[1]；通過(guò)口服或皮下注射，效果顯著，機(jī)體吸收很快，血液濃度在給藥后2 d基本達(dá)到峰值。給藥后7 d藥物清除率達(dá)到90%以上，給藥后28 d藥物在體內(nèi)基本代謝完畢。IVM在犬體內(nèi)排泄較快（半衰期為1.6～1.8 d）。牛、羊體內(nèi)半衰期約為2.7 d；豬的半衰期長(zhǎng)達(dá)4 d[2-3]。吸收后IVM廣泛分布于全身組織，其中肝臟濃度最高，其次為脂肪，最低為腦[4]。國(guó)內(nèi)外許多文獻(xiàn)報(bào)道了口服、注射給藥在牛羊、豬組織中的殘留消除規(guī)律，對(duì)于伊維菌素澆潑透皮劑在牛組織中的殘留消除規(guī)律未見系統(tǒng)的報(bào)道。本研究采用“農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-5-2008高效液相色譜法”對(duì)牛組織中伊維菌素進(jìn)行檢測(cè)[5]，得出肉牛背部澆潑伊維菌素透皮溶液后組織中伊維菌素濃度的變化規(guī)律，為伊維菌素澆潑溶液的臨床使用和食品藥物殘留檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與儀器

超高液相色譜儀（ACQUITY UPLC，配備二元并聯(lián)泵、色譜工作站、熒光檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器等，美國(guó)WATERS公司）；Avanti J-26高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN COULTER公司）； XW-80A旋渦混合儀（上海青浦滬西儀器廠）； KS501digital軌道式搖床（德國(guó)IKA公司）；高速組織勻漿器；氮?dú)獯蹈蓾饪s儀；電子分析天平等。

1.2 試劑藥品與試劑

供試藥品：0.5%伊維菌素澆潑溶液，以伊維菌素（H２B1a+H２B1b）計(jì)算，批號(hào)201205001，內(nèi)蒙古金河動(dòng)物藥業(yè)有限公司，試驗(yàn)前測(cè)定藥物的有效含量（以伊維菌素計(jì)）為0.5%。

伊維菌素對(duì)照品：伊維菌素（H２B1a+H２B1b），純度91.2%，批號(hào)K0191106，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

甲醇、乙腈為色譜純。三乙胺、冰醋酸、異辛烷等均為分析純。水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇18頭健康的黃牛，公母各半，按常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和采食，飼料為全價(jià)日糧，不含任何抗菌藥物。臨床觀察兩周表現(xiàn)健康。

1.4 給藥

將牛分為給藥組（16頭）與空白對(duì)照組（2頭），平均體重為411.3 kg（411.3±24.6 kg），試驗(yàn)組隨機(jī)分為4組進(jìn)行殘留消除試驗(yàn)，每組4頭，給藥組單次背部澆淋伊維菌素澆潑溶液，給藥劑量為500 μg/kg·bw?？瞻捉M澆注生理鹽水，給藥方式同給藥組。

1.5 樣品采集

給藥組在給藥后第7、14、28、48天的時(shí)間點(diǎn)各宰殺一組牛，分別采集以下組織及部位：①肌肉 腿部肌肉，500 g；②肝臟 最大葉部位，500 g；③腎臟 雙腎縱切，各取一半；④給藥部位 以背中線為中心劃10×10cm方形，采10 cm×10 cm×6 cm（深）的肌肉樣本；⑤脂肪 皮下脂肪200 g。各樣品采集后立即做好標(biāo)記、包裝，保存于-20 ℃冰箱，待測(cè)。

1.6 組織樣品中伊維菌素的檢測(cè)方法

1）樣品前處理。①試料制備：取出冷凍試料50 g，切碎、高速均質(zhì)，勻漿備用。每種組織進(jìn)行平行雙樣本測(cè)定。②處理：提取：稱取試樣2.5 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加8 mL乙腈，旋渦0.5 min，2 000 r/min離心2 min，取上清液。殘?jiān)? mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。凈化：取堿性氧化鋁柱，加2 g無(wú)水硫酸鈉。加10 mL乙腈預(yù)洗，將上清液過(guò)柱，收集濾液于雞心瓶中。接著用5 mL乙腈洗脫，收集于同一雞心瓶中，50 ℃下減壓濃縮至干。用0.5 mL乙腈溶解殘余物，旋渦0.5 min，使充分溶解，備用。取C18固相萃取柱，用5 mL乙腈預(yù)洗，將備用液過(guò)柱，收集流出液于5 mL刻度試管內(nèi)，繼續(xù)用3 mL乙腈洗脫，收集于同一雞心瓶中，50 ℃下氮?dú)獯蹈?，備用。熒光衍生化：加入衍生化試劑A液100 μL，旋渦0.5 min，再加衍生化試劑B液100 μL，旋渦0.5 min，密閉。于96 ℃衍生化反應(yīng)100 min，加50 μL乙腈，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行HPLC熒光檢測(cè)。

2）各種溶液配制。伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取的對(duì)照品0.0532 g于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，搖勻，即成500 μg/mL伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)液，4 ℃冰箱保存，臨用前用流動(dòng)相配成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。衍生化試劑：A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v），現(xiàn)用現(xiàn)配。B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v），現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.7 液相色譜條件

色譜柱：Thermo CigODS（4.6 mm×250 mm，5μm），美國(guó)Thermo公司；流動(dòng)相：甲醇：水（98：2，v/v）；流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL；熒光檢測(cè)器；激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)475 nm；柱溫：30 ℃。

1.8 檢測(cè)限與定量限

按信噪比S/N≥3時(shí)為檢測(cè)限（LOD），S/N≥10時(shí)為定量限（LOQ）。所得檢測(cè)限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg，表明方法的靈敏度高，可滿足殘留檢測(cè)的要求。

1.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

在6個(gè)50 mL進(jìn)口離心管中分別稱取1 g空白組織，依次加入工作液，制成含伊維菌素藥物濃度分別如下：5、10、20、50、100、200 μg/kg的組織樣品。按照組織樣品處理方法處理后，進(jìn)樣分析。以測(cè)得的伊維菌素的峰面積（A）與藥物濃度（C）作線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表1。

1.10 回收率和變異系數(shù)測(cè)定

在1 g空白組織中加入伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含藥濃度為5、10、100 μg/g的腎臟、肝臟、肌肉、脂肪組織樣品。按照樣品處理方法處理后，進(jìn)樣分析，每批次每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行樣品，共3個(gè)批次。以其藥物峰面積與外標(biāo)峰面積之比，求得低、中、高3種濃度的回收率，計(jì)算批內(nèi)，批間變異系數(shù)（CV，%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 伊維菌素澆潑溶液在牛組織殘留消除

依據(jù)上述建立的方法，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物在第7、14、28、48天時(shí)間點(diǎn)采集的肌肉、肝臟、腎臟、脂肪、給藥部位肌肉5種組織進(jìn)行了雙樣本檢測(cè)，各組織中伊維菌素的測(cè)定結(jié)果見表2。

2.2 伊維菌素澆潑溶液在牛組織中的休藥期

農(nóng)業(yè)部235公告關(guān)于伊維菌素在牛各個(gè)組織中的最高殘留限量（MRL）規(guī)定如下：肌肉為10 μg/kg，脂肪為40 μg/kg，肝為100 μg/kg。腎臟MRL沒有具體規(guī)定，參照歐盟關(guān)于伊維菌素在鹿體內(nèi)的最高殘留限量，暫定為20 μg/kg[6-7]。根據(jù)計(jì)算機(jī)軟件WT1.4計(jì)算，各種組織的休藥期（95%置信限）見圖1～圖5。

3 討論

3.1 伊維菌素在牛組織中的分布

從檢測(cè)的5種組織所得到的最高濃度點(diǎn)為：肝臟306 μg/kg（7 d）、皮脂194 μg/kg（7 d）、給藥部位肌肉115 μg/kg（7 d）、腎臟89.3 μg/kg（7 d）、肌肉68.8 μg/kg（7 d）。從上述結(jié)果來(lái)看伊維菌素在動(dòng)物組織中以肝臟的濃度最高，殘留時(shí)間最長(zhǎng)，其次是皮脂、給藥部位肌肉、腎臟、肌肉。

試驗(yàn)結(jié)果表明：以500 μg/kg背部澆淋后，伊維菌素在牛體內(nèi)代謝緩慢，肝臟在給藥后7 d達(dá)到最大濃度306 μg/kg，除肝臟外，肌肉、腎臟、皮脂以及給藥部位肌肉均在給藥后28 d，組織濃度低于最高殘留限量；肝臟在第48天時(shí)，其濃度才低于最高殘留限量。

3.2 關(guān)于伊維菌素澆潑溶液在牛體內(nèi)休藥期的評(píng)價(jià)

農(nóng)業(yè)部235公告關(guān)于伊維菌素在牛各個(gè)組織中的最高殘留限量（MRL）規(guī)定如下：肌肉為10 μg/kg，脂肪為40 μg/kg，肝為100 μg/kg；腎臟MRL沒有具體規(guī)定，參照歐盟關(guān)于伊維菌素在鹿體內(nèi)的MRL，暫定為20 μg/kg[4]。

根據(jù)WT1.4軟件，參照農(nóng)業(yè)部235公告和歐盟關(guān)于伊維菌素在牛組織中規(guī)定的MRL，測(cè)得伊維菌素澆潑溶液以500 μg/kg背部澆淋給藥，給藥1次，各組織的休藥期分別為：肌肉21.2 d、肝臟42.1 d、腎臟21.5 d、皮脂39.9 d、給藥部位肌肉31 d" （表3）。

4 結(jié)論

根據(jù)表3結(jié)果，內(nèi)蒙古金河動(dòng)物藥業(yè)有限公司研制的伊維菌素澆潑溶液（0.5%）的休藥期為43 d。

參考文獻(xiàn)：

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[6] 農(nóng)業(yè)部發(fā)布動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量（續(xù)）[J].中國(guó)獸藥雜志，2003 （3）：5-11.

[7] COMMISSION REGULATION （EU） No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin[EB/OL]. https：//eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do？uri=CONSLEG：2010R0037：

20110714：EN：PDF，2010-01-20/2022-05-09.

收稿日期：2023-08-30

作者簡(jiǎn)介：徐先達(dá)（1993— ），內(nèi)蒙古人，碩士，獸醫(yī)師，從事獸藥技術(shù)服務(wù)工作。172467548@qq.com。