糯高粱葉中IAA產(chǎn)生菌的分離篩選及其促植物生長(zhǎng)作用

摘 要：" 糯高粱是白酒釀造的重要原料，其生長(zhǎng)過程需要大量的化學(xué)肥料，作為環(huán)境友好型肥料，微生物菌劑有很廣闊的應(yīng)用前景。為開發(fā)對(duì)糯高粱生長(zhǎng)有促進(jìn)生長(zhǎng)功能的微生物菌劑，該研究以糯高粱葉片為材料，分離篩選具有植物生長(zhǎng)激素吲哚乙酸（IAA）產(chǎn)生功能的微生物菌株，基于菌株的16S rDNA保守序列對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株的分類學(xué)地位；通過菌懸液浸種處理，分析菌株對(duì)糯高粱種子萌發(fā)的影響；通過盆栽實(shí)驗(yàn)，分析菌株對(duì)高粱幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：（1）從糯高粱葉片中分離篩選得到4株具有產(chǎn)IAA功能的微生物菌株，分別編號(hào)為HY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4。其中，IAA單位濃度產(chǎn)生量最高的菌株是HY1-1，為2.56 mol·L-1。（2）運(yùn)用貝葉斯推斷樹對(duì)菌株16S rDNA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示這4株菌都屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。（3）HY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4都能促進(jìn)糯高粱種子萌發(fā)，與對(duì)照組相比，經(jīng)菌懸液浸泡的糯高粱種子發(fā)芽率顯著提高了40.04%～165.52%，其中促進(jìn)效果最明顯的是HY1-1，種子發(fā)芽率提高了165.52%。（4）選取HY1-1菌株做盆栽實(shí)驗(yàn)，在糯高粱幼苗根部接種HY1-1 30 d后，糯高粱幼苗的株高顯著增加了29.17%、全磷含量顯著增加了5.12%；糯高粱根際基質(zhì)中速效氮顯著增加了31.70%，有效磷顯著增加了28.88%。綜上認(rèn)為，糯高粱葉內(nèi)生菌HY1-1能夠通過分泌植物生長(zhǎng)激素IAA以及為植物提供營(yíng)養(yǎng)元素等方式促進(jìn)糯高粱植株的生長(zhǎng)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)促糯高粱生長(zhǎng)菌劑提供了種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞： 植物內(nèi)生菌， 分離篩選， 植物生長(zhǎng)激素IAA， 種子萌發(fā)， 促高粱生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)：" Q948

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：" 1000-3142（2024）10-1807-10

收稿日期：" 2023-09-12 接受日期： 2023-12-18

基金項(xiàng)目：" 貴州省科技廳基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)［2020］1Y076）； 貴州省教育廳科技拔尖人才項(xiàng)目（黔教合KY字［2020］035）； 貴州省教育廳青年科技人才成長(zhǎng)項(xiàng)目（黔教合KY字［2020］232）； 遵義市科學(xué)技術(shù)局——茅臺(tái)學(xué)院市校聯(lián)合科技研發(fā)資金項(xiàng)目（遵市科合HZ字［2020］317號(hào)， 遵市科合HZ字［2021］326號(hào)， 遵市科合HZ字［2021］312號(hào)， 遵市科合HZ字［2021］307號(hào)）； 茅臺(tái)學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（mygccrc［2022］023， mygccrc［2022］027）。

第一作者： 王新葉（1986—），博士，副教授，主要從事微生物資源與利用研究，（E-mail）wangxinye@mtxy.edu.cn。

*通信作者：" 趙亮，博士，副教授，主要從事微生物生態(tài)研究，（E-mail）zhaoliang@mtxy.edu.cn。

Isolation and screening of IAA-producing bacteria

from glutinous sorghum leaves and its plant

growth-promoting function

WANG Xinye， ZHANG Min， TIAN Xiaolong， YUAN Ping， LI Hongxia，

LUO Zhenbiao， YUE Qianqian， ZHAO Liang*

（ Moutai Institute， Renhuai 564500， Guizhou， China ）

Abstract：" Glutinous sorghum is an important raw material for the production of Baijiu （Chinese liquor）. During its growth process， glutinous sorghum requires a substantial amount of chemical fertilizers. As an environmentally friendly fertilizer， microbial agent has a great application prospect in future. The aim of this paper was to develop a growth promoting microbial agent for glutinous sorghum. In this study， the glutinous sorghum leaves were used as experimental materials to isolate and screen microbial strains with plant growth hormone indole acetic acid （IAA） production ability. Phylogenetic analysis was performed to determine the taxonomic status of these microbial strains based on the 16S rDNA conserved sequences. The effects of" strains on glutinous sorghum seed germination were analyzed by soaking the seeds with bacterial suspension. The effects of strains on the sorghum seedlings growth were analyzed by pot experiment. The results were as follows： （1） Four microbial strains capable of producing IAA were isolated and screened from glutinous sorghum leaves， designated as HY1-1， HY1-2， HY1-3， and HY1-4. Among them， HY1-1 exhibited the highest IAA production per unit concentration which was 2.56 mol·L-1. （2） Bayesian inference tree analysis based on the 16S rDNA sequences revealed that all four strains belonged to Bacillus subtilis. （3） HY1-1， HY1-2， HY1-3， and HY1-4 could promote the glutinous sorghum seed germination rates. Compared to the control groups， the germination rates of glutinous sorghum seeds soaked in bacterial suspension significantly increased by 40.04% to 165.52%. Among them， HY1-1 demonstrated the most prominent promotion effect， with a germination rate increase of 165.52%. （4） HY1-1 strain was selected for a pot experiment. After 30 days of inoculation on the roots of glutinous sorghum seedlings， the plant heights of the seedlings significantly increased by 29.17%， and total phosphorus content increased significantly by 5.12%. The rhizosphere substrate of glutinous sorghum exhibited a significant increase in available nitrogen content by 31.70% and available phosphorus content by 28.88%. In conclusion， HY1-1， an endophytic bacterium in glutinous sorghum leaves， can promote the growth of glutinous sorghum plants by secreting the plant growth hormone IAA and providing necessary nutrients. This study provides genetic resources for the further development of microbial agent targeting the growth promotion of glutinous sorghum.

Key words： plant endophytic bacteria， isolation and screening， plant growth hormone IAA， seed germination， glutinous sorghum growth promoting

糯高粱胚乳中支鏈淀粉含量較高，蒸煮后黏性強(qiáng)，是釀造優(yōu)質(zhì)白酒的重要原料（丁延慶等， 2019）。高粱產(chǎn)量的提高離不開肥料的使用，氮肥是高粱增產(chǎn)的主要因素，磷肥次之。然而，持續(xù)的高化肥投入會(huì)造成肥料利用效率降低、土壤環(huán)境破壞、水體污染等問題（陳同斌等， 2002；董二偉等， 2012）。微生物有機(jī)肥既能增加植物養(yǎng)分的供應(yīng)量、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，也能減輕植物病蟲害、減少化肥使用量。因此，微生物有機(jī)肥在可持續(xù)農(nóng)業(yè)戰(zhàn)略發(fā)展中的地位日趨重要（李西強(qiáng)等， 2013）。植物內(nèi)生菌存在于植物的根、莖、葉、樹皮、花和種子里，對(duì)植物的健康和發(fā)育有良好的促進(jìn)作用（Dudeja et al.， 2011;Santoyo et al.， 2016）。葉內(nèi)生菌主要是通過垂直傳播和水平傳播的方式獲得（Balint et al.， 2013），葉片的內(nèi)部組織是一個(gè)吸引大量細(xì)菌和真菌的環(huán)境，含有豐富的微生物資源（Vandenkoornhuyse et al.， 2015）。宿主植物為內(nèi)生菌提供持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，作為回報(bào)，內(nèi)生菌通過磷酸鹽溶解、氮固定、植物生長(zhǎng)激素吲哚乙酸（IAA）產(chǎn)生、鐵載體產(chǎn)生、ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）水解酶合成等促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)（Cueva-Yesquén et al.， 2021）。植物內(nèi)生細(xì)菌與寄主植株在長(zhǎng)期共同進(jìn)化過程中形成了密切的相互關(guān)系，成為化肥和其他微生物制劑的最佳競(jìng)爭(zhēng)者，其合理應(yīng)用將減少化學(xué)農(nóng)藥和肥料對(duì)環(huán)境的污染，有利于保持生態(tài)平衡（梁志超等， 2019）。

IAA屬于植物生長(zhǎng)素家族中的吲哚衍生物，是調(diào)節(jié)植物各種發(fā)育和生理過程的主要激素（Nutaratat et al.， 2015），能夠刺激細(xì)胞分裂、細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞分化、光和重力響應(yīng)、調(diào)節(jié)葉片掉落和果實(shí)成熟等（Teale et al.， 2006）。因此，植物內(nèi)生菌的IAA產(chǎn)生能力被認(rèn)為是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究以釀酒用的糯高粱紅纓子品系為材料，采用LB培養(yǎng)基分離葉內(nèi)生菌，利用Salkowski試劑檢測(cè)菌株的IAA產(chǎn)生能力，結(jié)合16S rDNA測(cè)序分析對(duì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并綜合種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)和糯高粱盆栽實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)菌株對(duì)糯高粱的促生長(zhǎng)能力，從而獲得對(duì)糯高粱生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的微生物菌株，并對(duì)微生物菌株的促生長(zhǎng)機(jī)制進(jìn)行初步探究，以期為進(jìn)一步開發(fā)促糯高粱生長(zhǎng)菌劑提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造用糯高粱，糯高粱品種為‘紅纓子’，來自仁懷市豐源有機(jī)高粱育種中心。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離純化 稱取10 g糯高粱幼苗的葉片，先用無菌剪刀剪成小塊后進(jìn)行表面消毒（70%乙醇2 min，5%次氯酸鈉5 min，70%乙醇2 min，無菌水沖洗3次），再將葉片剪碎，轉(zhuǎn)移到90 mL無菌水中，旋渦振蕩30 min，作為菌懸液母液。將菌懸液用無菌水逐級(jí)稀釋到10-1、10-2和10-3" 三個(gè)濃度梯度，分別從各個(gè)濃度梯度菌懸液中吸取100 μL到LB固體平板上，涂布均勻。在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72 h。挑取LB平板上長(zhǎng)出的單菌落，用分區(qū)劃線法對(duì)菌株進(jìn)行純化，將純化好的菌株用終濃度為30%的甘油進(jìn)行保藏。

1.2.2 IAA產(chǎn)生能力的測(cè)定 將菌株接種于R2A液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r·min-1條件下培養(yǎng)4 d后，測(cè)定菌懸液在λ=600 nm處的吸光值。將培養(yǎng)好的菌懸液置于離心機(jī)中，5 000 r·min-1離心10 min。取上清液10 mL，加入等體積的Salkowski比色液，避光靜置30 min后，測(cè)定混合液在λ=530 nm處的吸光值。通過IAA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IAA的產(chǎn)生量，并計(jì)算菌體濃度OD600 nm為1時(shí)，菌株單位濃度IAA的產(chǎn)生量（何建清等， 2019）。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 用改良月桂酸鈉法提取菌株的基因組DNA，用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGT

TACCTTGTTACGACT-3′）擴(kuò)增菌株的16S rDNA片段，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序得到的16S rDNA序列信息與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，下載與菌株16S rDNA同源性較高模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 11軟件中ClustalW 1.6程序進(jìn)行序列比對(duì)，使用ModelTest 3.7結(jié)合PAUP*4.0v10b用于計(jì)算貝葉斯推斷樹最優(yōu)構(gòu)建模型，模型選取采用Akaike信息準(zhǔn)則（Posada amp; Crandall， 1998）。使用MrBayes 3.1.2軟件構(gòu)建貝葉斯推斷樹，建樹過程采用Metropolis-coupled Markov chain Monte Carlo（MCMCMC）算法，設(shè)置1條冷鏈3條熱鏈抽取隨機(jī)樹，并運(yùn)行運(yùn)算2次，共設(shè)置2 000 000代，每1 000代取1次樣，運(yùn)算收斂（平均分裂標(biāo)準(zhǔn)差lt;0.01）后得到2 000個(gè)樹的后驗(yàn)分布。剔除前25%（共500個(gè)）分布不穩(wěn)定的樣本樹，留下后75%（共1 500個(gè)）樣本樹用于獲得50%最大共有樹，即最終的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹（Huelsenbeck amp; Ronquist， 2001; Ronquist amp; Huelsenbeck， 2003）。

1.2.4 菌懸液制備 從LB平板上挑取單菌落，接種在LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r·min-1條件下培養(yǎng)3 d后，5 000 r·min-1 離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3次后，加入無菌水，制備菌懸液，調(diào)整菌懸液的終濃度OD600 nm為0.5～0.6，備用。

1.2.5 種子預(yù)處理 挑選顆粒飽滿、大小均勻的糯高粱種子，加入70%乙醇，處理2 min；倒掉乙醇，加入5%的次氯酸鈉，處理5 min；倒掉次氯酸鈉，加入70%的乙醇，處理2 min；倒掉70%乙醇，用無菌水沖洗3～5次。

1.2.6 菌懸液浸種 量取100 mL菌懸液，將糯高粱種子浸泡在菌懸液中，用錫紙包裹避光，室溫放置6 h，倒掉菌懸液，用無菌水將糯高粱種子清洗3～5次，用無菌的鑷子將糯高粱種子平鋪在水瓊脂（1.4%瓊脂）平板上，將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組用等量蒸餾水處理，每個(gè)處理選用100顆糯高粱種子，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì) 分別于第3天和第7天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)量，計(jì)算發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率（鄭慶鐘等， 2016）。計(jì)算公式：

發(fā)芽勢(shì)=發(fā)芽初期（第3天）種子發(fā)芽數(shù)供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率=發(fā)芽初期（第7天）種子發(fā)芽數(shù)供試種子數(shù)×100%

1.2.8 種子催芽 將糯高粱種子按照1.2.1的方法進(jìn)行表面消毒處理，將處理好的種子平鋪于水瓊脂平板上，將水瓊脂平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.9 盆栽實(shí)驗(yàn) 將珍珠巖和蛭石按照1∶2的比例混合均勻，裝在塑料花盆中，花盆規(guī)格：17.5 cm （高度） × 11.5 cm （底徑） × 16.5 cm （口徑）。將花盆用報(bào)紙封口后，121 ℃下滅菌30 min。挑選發(fā)芽的糯高粱種子種在花盆中，每個(gè)花盆播種20顆，每個(gè)處理10個(gè)花盆。

1.2.10 接菌 用1.2.4的方法制備菌懸液，待糯高粱幼苗露出土面，向每個(gè)花盆中加入10 mL菌液，對(duì)照組加入等量的無菌水。糯高粱生長(zhǎng)過程中，根據(jù)需要加入改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液［海博生物，霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液（不含硝酸鈣），產(chǎn)品編號(hào)為HB8870-1，使用時(shí)加入NH4NO3 0.92 g·L-1和CaCl2 0.64 g·L-1］。

1.2.11 取樣及指標(biāo)測(cè)定 接菌30 d后，將糯高粱幼苗從基質(zhì)中取出，用流水將根沖洗干凈，用吸水紙將表面的水吸干，測(cè)量糯高粱的株高、鮮重等指標(biāo)。將糯高粱植株用硫酸-雙氧水消解，用凱氏定氮法測(cè)定植物全氮含量（馬宗琪等， 2014），用鉬銻抗比色法測(cè)定植物全磷含量。采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮（速效氮）含量（楊清華， 2018）；用碳酸氫鈉溶液浸提，用鉬銻抗比色法測(cè)定土壤有效磷含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2019軟件，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和鑒定

從糯高粱葉片中分離得到4株細(xì)菌，分別編號(hào)為HY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4。如圖1：A所示，HY1-1在LB平板上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形，黃色，不透明，表面光滑，易挑起；如圖1：B所示，HY1-2在LB平板上生長(zhǎng)旺盛，菌落較大，略帶微紅色，表面光滑，不透明，易挑起；如圖1：C所示，HY1-3為淡黃色，表面光滑，不透明，易挑起；如圖1：D所示，HY1-4為白色針狀菌落，表明光滑，不透明，易挑起。

基于菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類學(xué)地位。如圖2所示，基于貝葉斯推斷樹，HY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4與Bacillus subtilis strain DSM 10聚成一類，置信度為98%，表明這4株菌都屬于枯草芽孢桿菌。因此，分別將這4株菌命名為Bacillus subtilis HY1-1、Bacillus subtilis HY1-2、Bacillus subtilis HY1-3和Bacillus subtilis HY1-4。

2.2 植物生長(zhǎng)激素IAA的產(chǎn)生能力

稱取17.50 mg分析純IAA標(biāo)準(zhǔn)品，用少量乙醇溶解后，加入約90 mL蒸餾水，將溶液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，定容至100 mL，制備濃度為1 mmol·L-1的IAA標(biāo)準(zhǔn)液。以吸光值為橫坐標(biāo)，以IAA濃度為縱坐標(biāo)，繪制IAA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中IAA的含量，并計(jì)算菌液濃度OD600 nm為1時(shí)單位濃度菌株IAA的產(chǎn)生量。如表1所示，單位濃度菌株IAA產(chǎn)生量最高的菌株為HY1-1，為2.56 mol·L-1；其次為HY1-3，單位濃度菌株IAA產(chǎn)生量為2.29 mol·L-1；單位濃度菌株IAA產(chǎn)生量最低的是HY1-2，為1.43 mol·L-1。

2.3 菌株對(duì)糯高粱種子萌發(fā)的影響

如圖3： A所示，對(duì)照組糯高粱發(fā)芽勢(shì)為17.67%，用HY1-1菌懸液對(duì)糯高粱種子進(jìn)行處理后，發(fā)芽勢(shì)為37.33%，顯著提高了111.26%；用HY1-2菌懸液處理后，糯高粱種子發(fā)芽勢(shì)為18.33%，沒有顯著變化；用HY1-3菌懸液處理后，糯高粱種子發(fā)芽勢(shì)為21.33%，顯著增加了7.64%；用HY1-4菌懸液處理后，糯高粱種子發(fā)芽勢(shì)為16.00%，顯著降低了5.88%。如圖3：B所示，對(duì)照組的糯高粱種子發(fā)芽率為18.33%，用HY1-1菌懸液處理后，糯高粱種子的發(fā)芽率為48.67%，顯著提高了165.52%；用HY1-2菌懸液處理后，糯高粱種子發(fā)芽率為37.67%，顯著提高了105.51%；用HY1-3菌懸液處理后，糯高粱種子的發(fā)芽率為41.33%，顯著提高了125.48%；用HY1-4菌懸液處理后，糯高粱種子的發(fā)芽率為25.67%，顯著提高了40.04%。以上表明，4株細(xì)菌（HY1-1、HY1-2、HY1-3、HY1-4）對(duì)糯高粱種子萌發(fā)都有促進(jìn)作用，其中HY1-1的促進(jìn)效果最顯著。

2.4 菌株對(duì)糯高粱生長(zhǎng)的影響

綜合上述結(jié)果，選取HY1-1做盆栽實(shí)驗(yàn)。如圖4：A所示，與不接菌的對(duì)照組相比， 接種HY1-1 30 d后，糯高粱幼苗植株生長(zhǎng)旺盛，莖稈健壯。分別從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組糯高粱幼苗中隨機(jī)選取30株測(cè)量幼苗的株高，如圖4：B所示，對(duì)照組幼苗的平均株高為15.53 cm，實(shí)驗(yàn)組幼苗的平均株高為20.06 cm。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組幼苗的株高顯著增加了29.17%（Plt;0.05）。這表明菌株HY1-1對(duì)糯高粱幼苗的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

2.5 接種HY1-1對(duì)植物-基質(zhì)體系營(yíng)養(yǎng)元素的影響

2.5.1 植株全氮和基質(zhì)速效氮 如圖5：A所示，對(duì)照組糯高粱植株的全氮含量為24.50 g·kg-1，接種HY1-1糯高粱植株的全氮含量為24.60 g·kg-1，兩者無顯著性差異。如圖5：B所示，對(duì)照組糯高粱根際基質(zhì)中速效氮的含量為20.80 mg·kg-1，接種HY1-1糯高粱根際基質(zhì)中速效氮的含量為27.40 mg·kg-1，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組基質(zhì)中速效氮含量增加了31.70%（Plt;0.05）。這表明接種HY1-1雖然增加了糯高粱根際基質(zhì)中速效氮的含量，但沒有影響高粱植株對(duì)氮素的吸收。

2.5.2 植株全磷和基質(zhì)有效磷 如圖6：A所示，對(duì)照組糯高粱植株的全磷含量為3.89 g·kg-1，接種HY1-1糯高粱植株的全磷含量為4.10 g·kg-1，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組糯高粱植株全磷含量增加了5.12%（P lt; 0.05）。如圖6：B所示，對(duì)照組糯高粱根際基質(zhì)中有效磷的含量為10.77 mg·kg-1，接種HY1-1糯高粱根際基質(zhì)中有效磷的含量為13.88 mg·kg-1，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組基質(zhì)中有效磷增加了28.88%（Plt;0.05）。這表明接種HY1-1既增加基質(zhì)中有效磷的含量，又促進(jìn)了糯高粱植株對(duì)磷元素的吸收。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌科是一類好氧性產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，其生理特征豐富多樣，分布廣泛，極易分離培養(yǎng)，是植物內(nèi)生菌里研究最多以及應(yīng)用價(jià)值廣泛的一大類細(xì)菌（龔國(guó)利等，2020）。本研究從糯高粱葉片中篩選獲得的4株內(nèi)生菌均為枯草芽孢桿菌，這4株均具有植物生長(zhǎng)激素IAA產(chǎn)生能力，能夠提高糯高粱種子的發(fā)芽率，其中HY1-1顯著增加了糯高粱幼苗的株高，促進(jìn)了糯高粱生長(zhǎng)。類似的，將枯草芽孢桿菌EA-CB0575接種到土豆根部，土豆干重提高了34.60%。但是，在EA-CB0575的基因組上，由于具有合成吲哚乙酸、鐵載體、固氮酶的基因，這些基因在枯草芽孢桿菌中具有一定的保守性（Nicolás et al.， 2020），因此枯草芽孢桿菌能夠通過溶磷、增強(qiáng)氮固定、產(chǎn)生鐵載體的方式直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)。李樂等（2016）研究表明根瘤菌劑、TBK復(fù)合微生物原菌劑、微生物復(fù)合菌劑能顯著促進(jìn)綠豆生長(zhǎng)。其中，芽孢桿菌具有抑制植物病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力（Alou et al.， 2015; Kotb， 2015）。吳玉洪等（2023）通過研究海洋貝萊斯芽孢桿菌對(duì)黃瓜幼苗促生作用， 發(fā)現(xiàn)海洋貝萊斯芽孢桿菌具有較高的固氮、產(chǎn)ACC脫氨酶、吲哚乙酸和鐵載體能力，對(duì)幼苗有很好的促生長(zhǎng)作用。張榮勝等（2018）通過研究解淀粉芽孢桿菌對(duì)水稻的促生長(zhǎng)作用及其機(jī)理，發(fā)現(xiàn)此菌可產(chǎn)高水平的生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸和亞精胺，不僅對(duì)水稻生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而且具有很好的生防效果。劉魯峰等（2020）從甘蔗中分離得到內(nèi)生枯草芽孢桿菌，通過浸泡接種玉米種子與甘蔗單芽莖，發(fā)現(xiàn)玉米和甘蔗的各項(xiàng)生理指標(biāo)均優(yōu)于未接種處理，表明此菌強(qiáng)效的促生長(zhǎng)性能。本研究以糯高粱為材料，基于種子萌發(fā)、IAA產(chǎn)生量和基質(zhì)體系營(yíng)養(yǎng)元素等指標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對(duì)糯高粱有很好的促生長(zhǎng)性能。本研究與前人的研究相比，不僅擴(kuò)展了芽孢桿菌的促植物生長(zhǎng)寄主范圍， 而且證明了枯草芽孢桿菌在釀酒原料種植方面的應(yīng)用價(jià)值和潛在前景，為白酒釀造原料的可持續(xù)發(fā)展提供了菌株資源和技術(shù)線索。

雖然本研究未對(duì)菌株的溶磷能力和固氮能力進(jìn)行檢測(cè)，但盆栽實(shí)驗(yàn)表明，在接種HY1-1的糯高粱根際基質(zhì)中速效氮（堿解氮）含量增加了31.70%，有效磷的含量顯著增加了28.88%，間接表明HY1-1具有溶磷和固氮能力，進(jìn)而提高了寄主植物對(duì)磷元素和氮元素的吸收能力。植物內(nèi)生菌固氮、溶磷能力可為植物生長(zhǎng)提供氮素和磷素，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。在糯高粱生長(zhǎng)過程中，需要大量的氮肥和磷肥，而土壤往往滿足不了（秦耀祖和尹統(tǒng)利， 1980）。氮素和磷素除了會(huì)對(duì)高粱的產(chǎn)量產(chǎn)生影響以外，還會(huì)影響高粱籽粒中總淀粉和支鏈淀粉的含量（曹昌林等， 2011）。此外，低磷脅迫下，高粱的干重、植株地上部分、葉綠素含量和可溶性蛋白的含量都會(huì)下降（馬建華等， 2013）。本文以糯高粱葉為分離源進(jìn)行研究，結(jié)果表明從中獲得的枯草芽孢桿菌可為寄主植物提供有效的氮素和磷素營(yíng)養(yǎng)，既保障了植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育，又為進(jìn)一步開發(fā)糯高粱促生菌株提供了一條有效的篩選途徑。此外，在今后的研究中，可將高通量測(cè)序和菌株純培養(yǎng)分離手段相結(jié)合，以揭示糯高粱內(nèi)生菌的多樣性及群落組成，篩選獲得具有多重促生特性的優(yōu)良菌株，為選育糯高粱專用菌劑儲(chǔ)備菌種資源。基于對(duì)菌株HY1-1的初步探索，我們認(rèn)為在今后的研究中，可以深入挖掘糯高粱響應(yīng)Bacillus subtilis HY1-1侵染的應(yīng)答機(jī)制，以揭示此菌促進(jìn)糯高粱生長(zhǎng)的深層機(jī)理，為提高糯高粱產(chǎn)量和質(zhì)量提供技術(shù)線索和菌種支持。

本研究得到以下3個(gè)方面的結(jié)論：（1）糯高粱葉片是獲得促生長(zhǎng)內(nèi)生菌的重要分離源；（2）從糯高粱葉片中分離篩選的4株枯草芽孢桿菌具備產(chǎn)IAA的能力（1.43～2.56 mol·L-1），對(duì)糯高粱種子萌發(fā)具有顯著的促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)在可提高種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率；（3）在4株待測(cè)菌株中，HY1-1促生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，可使糯高粱的株高顯著提高29.17%、根際基質(zhì)速效氮含量顯著增加31.70%、有效磷含量顯著增加28.88%、全磷含量顯著增加5.12%，這將為大規(guī)模開發(fā)促生長(zhǎng)菌劑提供了菌種資源。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 王登惠）