水稻內生放線菌Ahn109的分離鑒定及對稻瘟病的抑制活性

摘要：利用植物內生放線菌防控水稻稻瘟病，已成為新的生物防治方法。為挖掘對稻瘟病菌具有高效拮抗作用的植物內生放線菌資源，采用平板對峙法和菌絲速率抑制法對海南水稻組織中分離純化的內生放線菌進行篩選，通過菌落形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察、16S rRNA和基因組序列分析對篩選菌株進行鑒定，并初步研究了拮抗菌株的抗逆特性、次生代謝產物組成及其對稻瘟病的防治效果。結果表明，一株微白黃鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）Ahn109對稻瘟病菌的抑制效果較好，其平板對峙抑菌率為56.73%，發(fā)酵濾液稀釋10倍后抑菌率為59.84%?？鼓嬖囼烇@示，該菌株具有良好的紫外、堿和鹽耐受性。AntiSMASH軟件分析預測該菌株基因組中含有白地霉抗菌素、菲特霉素和纈氨霉素等多種抗菌化合物的生物合成基因簇。盆栽試驗結果顯示，該菌株對水稻葉瘟和穗頸瘟均有較好防效，其孢子懸浮液處理水稻組織后，盆栽水稻的葉瘟和穗頸瘟發(fā)病率比對照分別降低了35.65%和39.08%，葉瘟和穗頸瘟病情防效分別為35.77%和33.64%。綜上所述，菌株Ahn109具有較高的生防潛力，可用于水稻稻瘟病生防菌劑的開發(fā)。

關鍵詞：內生放線菌；微白黃鏈霉菌；稻瘟??；生物防治；分離鑒定

中圖分類號：S435.111.4+1；S182 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0133-08

水稻稻瘟病是由病原真菌稻梨孢菌（Magnaporthe oryzae）侵染水稻不同組織而引起的一種嚴重危害水稻產量和質量的病害，發(fā)病可貫穿于水稻整個發(fā)育時期［1］。每年水稻因稻瘟病造成的產量損失約為 10%～30%，損失的稻米可以養(yǎng)活近 6 000 萬的人口［2-3］。近年來，我國多地暴發(fā)稻瘟病，部分地區(qū)水稻大面積減產甚至絕收，導致國家糧食安全受到嚴重威脅［4］。目前，水稻稻瘟病的防治主要依賴于化學農藥的施用，而化學農藥的降解周期相對較長，長期施用對土壤和環(huán)境帶來了較大的污染，給水稻安全生產和人類健康帶來較大的隱患［5-6］。此外，種植水稻抗病新品種也是防止水稻發(fā)生稻瘟病的一種策略，但抗病新品種的培育周期較長，且抗瘟性還會隨著稻瘟病菌的變異而消失［7］。因此，當前社會迫切需要發(fā)展新的稻瘟病防控方法，其中生物防治成為一個重要研究方向。

微生物菌劑因為具有對環(huán)境友好、低毒且不易誘發(fā)病原菌抗性等優(yōu)點，在稻瘟病生物防治領域具有廣闊的應用前景［8-10］。而放線菌作為農用抗生素的主要來源之一，已逐漸成為生物防治稻瘟病的“主力軍”。如產色鏈霉菌（Streptomyces griseochromogenes）和春日鏈霉菌（S. kasugaensis）產出的次生代謝產物滅瘟素-S、春雷霉素已大規(guī)模應用于稻瘟病防治，并取得了不錯的生防效果［11-12］。同時，許多放線菌，尤其是鏈霉菌，也相繼被報道用于生物防治稻瘟病。Zeng等研究發(fā)現(xiàn)水稻內生吸水鏈霉菌（S. hygroscopicus）OsiSh-2可通過其分泌的多種抗菌化合物抑制稻瘟病菌的生長并顯著降低水稻葉瘟的發(fā)生［13］。阮宏椿等從紅豆杉根際土壤樣品中分離篩選到1株對稻瘟病菌具有顯著拮抗活性的殺結節(jié)鏈霉菌（S. tubercidicus） ST7-2，室內盆栽和田間小區(qū)試驗結果表明，該菌發(fā)酵液對水稻苗瘟和穗頸瘟的防效分別為 82.76%和73.57%，與 75%三環(huán)唑可濕性粉劑的作用效果無明顯差異［14］。Patel等從高粱中分離的內生鏈霉菌可通過誘導水稻防御基因的表達降低水稻稻瘟病的發(fā)?。?5］。另有研究表明，婁徹氏鏈霉菌（S. rochei）、灰色鏈霉菌（S. griseus）、米修鏈霉菌（S. misionensis）對稻瘟病菌也有較好的抑制作用［16-18］。由此可見，鏈霉菌是一類非常重要的生防微生物資源。

內生菌是指生長周期的全部或部分階段能穩(wěn)定生活在健康植物細胞內或細胞間隙的微生物菌群［19］。它們比根際和土壤微生物具有更優(yōu)越的定殖性能，且在長期的進化過程中與宿主形成了良好的合作關系，宿主為內生菌提供定殖空間和基本營養(yǎng)需求，而內生菌可通過其分泌的多種代謝產物促進水稻的生長，調節(jié)水稻的抗逆性能，提高水稻對病害的防御，因而內生菌比其他微生物具有更大的生防潛能［20-23］。本研究從海南水稻根組織中分離到1株對稻瘟病菌具有高效拮抗作用的內生鏈霉菌，并對其菌株分類地位、環(huán)境耐受性能、基因組序列進行了系列分析，并通過盆栽試驗評價了該菌株的生防潛能，以期為稻瘟病的生物防治提供新的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和水稻品種

拮抗菌株 Ahn109 為筆者所在研究組從海南水稻稻瘟病發(fā)病區(qū)的未發(fā)病水稻根組織中分離篩選得到；供試稻瘟病病原菌TCYD1由筆者所在本研究組分離純化［24］；選擇超優(yōu)千號系列“湘兩優(yōu)900”用于拮抗菌株的盆栽防效試驗。

1.2 培養(yǎng)基

（1）放線菌分離培養(yǎng)基：HV 培養(yǎng)基［25］，MS培養(yǎng)基：甘露醇2%、大豆粉2%、瓊脂2%，TWYE培養(yǎng)基［25］。（2）放線菌培養(yǎng)：ISP2 培養(yǎng)基［24］，察氏培養(yǎng)基［26］，高氏一號培養(yǎng)基［26］。（3）稻瘟病菌培養(yǎng)：ISP2 平板用于菌絲培養(yǎng)，燕麥培養(yǎng)基用于孢子培養(yǎng)［24］。

1.3 內生放線菌的分離、純化

水稻組織的清洗和表面消毒參照王真真等的方法［18］。消毒后的組織小段用無菌鑷子放置于3種添加有20 mg/L萘啶酸和50 mg/L苯菌靈的分離培養(yǎng)基上，分別置于27 ℃和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3～4 d，將水稻組織上析出的放線菌轉移到ISP2平板上進行劃線純化，獲得純培養(yǎng)物。

1.4 拮抗放線菌的篩選

采用平板對峙法對拮抗放線菌進行初篩，抑菌能力強的菌株在ISP2培養(yǎng)液中28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm無菌濾膜過濾，將濾液與冷卻至 50 ℃ 的ISP2培養(yǎng)液以1 ∶10的體積比混合倒板，接入稻瘟病新鮮菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測量病原菌菌落直徑。對照采用無菌水代替發(fā)酵濾液，每處理重復3次，計算菌絲生長抑制率［24］。

1.5 拮抗放線菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)特征和培養(yǎng)特征觀察 將放線菌接種于ISP2、察氏和高氏一號培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)3～15 d，觀察菌落形態(tài)、菌絲和孢子顏色及有無色素產生；采用蔡司顯微鏡在明場下觀察菌絲的形態(tài)特征。

1.5.2 分子生物學鑒定 拮抗放線菌的16S rDNA的PCR擴增參照王玉雙等的方法［24］，基因序列由上海擎科生物有限公司長沙分公司進行測序后，經GenBank 和EzBioCloud等數據庫中進行比對分析，選擇相鄰物種的同長度16S rDNA序列，經軟件 Culstal W2 和Mega 7.0進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。使用液體ISP2液體培養(yǎng)基于28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)拮抗放線菌3 d，菌體經離心收集送武漢菲沙基因信息有限公司進行全基因組測序，采用PacBio Sequel Ⅱ平臺建庫測序，采用Microbial Assembly（smrtlink8）、HGAP4軟件（smrtlink8）和Canu（v1.6）軟件對純三代數據進行組裝。測序完成后，運用在線工具OrthoANIu（www.ezbiocloud.org/）計算菌株Ahn109和標準菌株基因組之間的平均核苷酸同源性（Average Nucleotide Identity，簡稱ANI）［27］；采用BLAST+方法，使用在線工具Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0（https：//ggdc.dsmz.de/ggdc.php）計算菌株基因組間的DNA-DNA 雜交值（ DDH）［28］。所有相鄰標準菌株的全基因組序列從GenBank 數據庫和EzBioCloud數據庫中下載。

1.6 拮抗放線菌的抗逆性測定

拮抗放線菌對pH值、鹽和紫外的耐性試驗參照肖蓉等的方法進行檢測［29］。

1.7 拮抗放線菌的antiSMASH分析

拮抗菌株測序完成后，參照Blin等的方法使用在線工具 antiSMASH （http：//antismash.secondar ymetabolites.org/）對基因組進行分析，預測拮抗放線菌基因組中次級代謝產物的生物合成基因簇［30］。

1.8 拮抗放線菌的盆栽防效試驗

1.8.1 試驗時間和地點 盆栽試驗于2022年5—10月在湖南省微生物研究院樓頂的溫室大棚進行。

1.8.2 拮抗放線菌和稻瘟病菌分生孢子懸浮液制備 在ISP2平板上，28 °C培養(yǎng)拮抗放線菌5～7 d，待分生孢子成熟后用無菌勺刮取孢子粉至適量的含0.05%吐溫的水溶液中懸浮，混合均勻后，采用血球計數板計數孢子濃度，并用適量的吐溫水將孢子懸浮液稀釋至108 CFU/mL備用。稻瘟病菌分生孢子懸浮液的制備參考文獻［24］進行，其濃度為 105 CFU/mL。

1.8.3 溫室水稻培育 選取顆粒飽滿的水稻種子，先后用75%乙醇和1% NaClO各浸泡5 min進行表面消毒，隨后用無菌水沖洗多次至無刺激性氣味為止。表面消毒完成后，將水稻種子轉移至含有濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，于30 ℃恒溫箱中催芽至露白，而后轉移至配制好的拮抗放線菌孢子懸浮液中浸泡 1 h，以無菌水浸泡作為空白對照。種子浸泡完后，隨即轉移至裝有800 g 泥土的陶瓷盆容器中，每個器皿放置3粒水稻種子，每個處理設置4個平行，所有盆栽都在溫室大棚中自然生長。

1.8.4 盆栽水稻孢子懸浮液處理及抗瘟測定 盆栽試驗設置無菌水空白對照、拮抗放線菌孢子懸浮液、75%三環(huán)唑3個處理組。待盆栽水稻生長至分蘗期和抽穗期時，各噴施1次拮抗放線菌孢子懸浮液，平均每盆噴施50 mL菌劑，對照噴施等量的無菌水或75% 三環(huán)唑可濕性粉劑750 倍稀釋液。噴施孢子液5 d 后，所有盆栽植株均按50 mL/盆的量噴施制備好的稻瘟病菌孢子懸浮液，并保持溫室濕度在90%以上且至少持續(xù)24 h。10 d后依據國際稻瘟病圃IRBN 的標準統(tǒng)計各處理水稻葉瘟或穗頸瘟的發(fā)病情況，并根據以下公式計算發(fā)病率和病情指數，評估拮抗放線菌孢子懸浮液防治稻瘟病的效果［31］。

發(fā)病率=（發(fā)病株數/調查總株數）×100%；病情指數 =［∑（各病級植株數×各級代表數值）/調查總植株數×最高級別值］×100；病情指數防治效果=［ （對照病指數-處理病指數）/對照病指數］×100%。

1.9 數據統(tǒng)計和分析

數據的處理和統(tǒng)計采用Excel 軟件進行，不同處理間的數據差異通過SPSS19.0軟件進行0.05水平顯著性分析。數值的表示方式為平均值±標準誤差（x[TX-*3]±s）。

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌Ahn109的分離純化

利用3種分離培養(yǎng)基（HV、MS、TWYE），從海南水稻稻瘟病發(fā)病區(qū)的未發(fā)病水稻組織中分離獲得50株水稻內生放線菌，經平板對峙試驗，篩選出7株對稻瘟病病原菌有抑制活性的菌株，其中分離自水稻莖組織的菌株Ahn109的抑菌活性最強，對稻瘟病菌菌絲的抑制率最高可達56.73%（圖1）。采用菌絲生長抑制法對Ahn109的無菌發(fā)酵濾液進行抗菌活性試驗，發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵濾液稀釋10倍后對稻瘟病菌菌絲生長抑制率為59.84%。

2.2 拮抗菌株Ahn109的鑒定

2.2.1 Ahn109的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征 菌株Ahn109在Isp2培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，菌落平坦呈圓形，顏色微白偏黃，孢子堆呈灰褐色，基絲微黃，無可溶性色素產生（圖2）。同時，該菌的氣生菌絲生長茂盛，分枝較多，呈四散開的樹枝狀（圖3）。這些結果表明，菌株Ahn109有可能是一株鏈霉菌。

2.2.2 Ahn109的分子鑒定 利用Clustal W2和MEGA 7.0對Ahn109和相鄰菌株的16S rRNA進行序列比對，采用鄰接法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。從圖4中可知，菌株Ahn109與微白黃鏈霉菌（S. albidoflavus）標準菌株DSM 40455T處于同一分支，相似性達到99.9% （表1），它們之間的同源距離低于亞種間距。同時，從表1中可以看到，雖然有4個標準菌株與Ahn109的16S rRNA序列同源性達99.90%，但Rong等根據 16S rRNA 基因序列、多位點序列分型（multilocus sequence typing，簡稱MLST）、DNA雜交（DDH）等分析，認為桑氏鏈霉菌（S. sampsonii）、檸檬鏈霉菌（S. limosus）和天藍色鏈霉菌（S. coelicolor）都應該被歸類于微白黃鏈霉菌（S. albidoflavus）亞種［32］。

一般認為，ANI 值接近或高于95%，DDH 預測值高于閾值70%，可以認定屬于同一菌種［33］。從表1的結果可以知道，菌株Ahn109的ANI值與親緣性排名前5的標準菌株的ANI值同源性均大于98.80%，DDH預測值大于89.50%，兩者的結果具有一致性，表明Ahn109與微白黃鏈霉菌（S. albidoflavus）、桑氏鏈霉菌（S. sampsonii）、檸檬鏈霉菌（S. limosus）和天藍色鏈霉菌（S. coelicolor）屬于同一菌種。因此，結合形態(tài)、培養(yǎng)和生理生化特征及16S rRNA和基因組ANI、DDH等分析，可以鑒定Ahn109為微白黃鏈霉菌。

2.3 拮抗菌株Ahn109的抗逆性分析

菌株 Ahn109 對紫外耐受的結果如圖5所示，紫外照射10 min后，菌株濃度輕微下降，照射 30 min，存活菌株數量僅下降1個數量級，從107下降至106，且隨著紫外即便紫外照射時間的延長，存活菌株數量基本趨于穩(wěn)定，照射60 min后，菌株濃度依然保持在3.38×105 CFU/mL水平，說明菌株 Ahn109具有較好的抗紫外能力。同時，[HJ2mm]從圖6可以看到，隨著pH值的上升，菌株Ahn109的生物量及其發(fā)酵液的抑菌水平也在不斷上升，pH值為9時，其生物量及其發(fā)酵液的抑菌水平達到最高，說明Ahn109是耐堿性菌株。此外，Ahn109具有較強的耐鹽特性，在7%和9%的鹽濃度下雖然生長速度變緩，但依然能正常生存（圖7）。

2.4 拮抗菌株Ahn109基因組序列antiSMASH分析

菌株Ahn109送武漢菲沙基因信息有限公司，經全基因組測序及拼接獲得菌株Ahn109 的基因組序列（圖8），其總長 7.1 Mbp，GC 含量為 73.55%，基因預測產生了6 479個開放閱讀框， 平均每個開放閱讀框的長度為967 bp。利用在線軟件antiSMASH對Ahn109的基因組進行次級代謝產物生物合成基因簇預測分析，結果顯示該菌株基因組上可能含有羊毛硫肽（lanthipeptide）、非核糖體肽（nonribosomalpeptide，NRP）和萜類（terpene）等 22 個次級代謝產物的生物合成基因簇，其中可能含有能編碼白地霉抗菌素、菲特霉素和纈氨霉素等抗菌化合物的基因簇（表2）。該菌株豐富的代謝產物生物合成基因簇的存在為其高效的抑菌活性提供了強有力保證。

2.5 拮抗放線菌Ahn109的抗稻瘟病效果

菌株Ahn109在盆栽試驗中對稻瘟病的生防效果如表3所示。從表3可以看出，Ahn109孢子液處理能有效降低盆栽水稻的稻瘟病發(fā)病率，與無菌水空白對照相比，其葉瘟和穗頸瘟的發(fā)病率分別可降低35.65%和39.08%，生防效果顯著。對病情指數進行統(tǒng)計可知，Ahn109孢子液處理組對葉瘟和穗頸瘟的防效分別可達35.77%和33.64%，雖然對照三環(huán)唑的生防效果還有一定差距，但是考慮到試驗僅僅使用菌株Ahn109的孢子懸浮液進行處理，若是改善制劑，如使用發(fā)酵液或添加助劑等，很有可能會大幅度提高Ahn109的防治效果。

3 討論

稻瘟病是我國水稻種植區(qū)威脅稻谷產量的三大病害之一，傳統(tǒng)的培育抗病新種和化學防治方法面臨抗性易失、農藥殘留和環(huán)境污染等問題，難以滿足現(xiàn)代農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求。為了克服上述困難，順利實現(xiàn)農業(yè) “兩減”，生物防治稻瘟病逐漸成為農業(yè)領域的研究熱點。而諸多研究發(fā)現(xiàn)，有效利用具有生防作用的活體微生物對水稻稻瘟病進行生物防治，是一種切實可行的防治方法［9，2 4-36］。這些生防微生物可以通過分泌拮抗活性物質、 與病原真菌進行營養(yǎng)競爭及激發(fā)水稻植株的系統(tǒng)抗性等方式抑制稻瘟病菌的正常生長，從而降低水稻植株稻瘟病的發(fā)病率，不僅實際使用效果突出，還可以增加稻田土壤中有益微生物的豐度，有效改善土壤的微生態(tài)結構，具有廣闊的應用前景。

生防微生物在水稻植株中的定殖效率，是其發(fā)揮生防作用的重要前提［37］。水稻內生菌與水稻在長期的共生環(huán)境下建立了互利互惠的關系，與其他來源的生防微生物相比有著天然的定殖優(yōu)勢，因而生物防效會更穩(wěn)定。一般來說，水稻葉部組織中內生細菌的多樣性最豐富，但在水稻根部組織中參與植株各種代謝生理活動的細菌數量是最多的［38］，而對于能在土壤中生存較長時間的稻瘟病菌來說，從根部開始就樹立一道天然的屏障，對于稻瘟病的防治顯得尤為重要。本研究從水稻根組織中分離篩選到1株對稻瘟病菌有顯著拮抗作用的放線菌Ahn109，經培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察以及16S rRNA基因和基因組序列比對分析，鑒定該菌株為微白黃鏈霉菌。對菌株Ahn109進行抗逆性檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株具有良好的耐紫外、堿和鹽的性能，這有利于保障菌株在田間野外應用時的生防穩(wěn)定性。此外，本研究對菌株Ahn109的基因組進行了antiSMASH分析，結果表明其基因組中可能含有萜類、羊毛硫肽、非核糖體肽等 22 個次級代謝產物的生物合成基因簇，代謝產物組成十分豐富，其中可能還不乏白地霉抗菌素、菲特霉素和纈氨霉素等抗菌化合物的存在，這就為菌株高效的抑菌活性提供了強有力的保證。

在盆栽試驗中，Ahn109孢子液處理能有效降低盆栽水稻葉瘟和穗頸瘟的發(fā)病率，下降比例可達35.65%和39.08%，經病情指數統(tǒng)計，Ahn109孢子液處理組對葉瘟和穗頸瘟的最終防效分別為35.77%和33.64%，表現(xiàn)出不俗的生防潛力。以往的研究［14，17，34］通常使用菌株發(fā)酵液進行盆栽或大田試驗，在次生代謝活性產物的協(xié)助下，生物防效比菌株Ahn109要好，但是與同等處理［18］相比，本研究的菌株Ahn109生防效果處于領先。有研究表明，助劑能有效促進放線菌孢子萌發(fā)，改善菌劑物理性能，從而增加微生物菌體的活性，提高生物防治效果［39］?？梢灶A見，若是改善本研究中菌株的制劑，或是將Ahn109與其他微生物聯(lián)合起來對稻瘟病進行協(xié)同防治，應該會獲得不錯的防治效果。

4 結論

本研究從海南地區(qū)的水稻根組織中分離篩選到1株對稻瘟病菌具有顯著拮抗活性的微白黃鏈霉菌Ahn109，該菌對紫外、堿和鹽具有良好的耐受性，且其基因組中含有豐富的次級代謝產物生物合成基因簇。Ahn109在盆栽試驗中對葉瘟和穗頸瘟的高效抑制作用表明該菌株在防治水稻稻瘟病方面具有廣闊的前景，可用于生物農藥的開發(fā)與應用。

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收稿日期：2023-07-25

基金項目：湖南省技術攻關“揭榜掛帥”項目（編號：2021NK1040）；國家自然科學基金（編號：32171633）；湖南省自然科學基金（編號：2021JJ30411）。

作者簡介：胡 展（1987—），男，湖南湘潭人，碩士，助理研究員，主要從事農業(yè)微生物的基礎和應用研究。E-mail：309594397@qq.com。

通信作者：楊 華（1986—），碩士，助理研究員，主要從事農業(yè)微生物的基礎和應用研究。E-mail：dyyhua@163.com。