基于BSA-seq的一個苗期黃化轉(zhuǎn)綠突變體基因定位

摘要：葉片是植物進行光合作用的重要場所，葉色突變往往制約水稻具有充足的源，研究葉色突變體對選育高光效品種以及進一步解析葉色調(diào)控的分子機制均具有重要意義。以育種中間材料苗期葉片黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry為對象，對其進行主要農(nóng)藝性狀分析，并對其突變性狀進行遺傳分析、基因定位。結(jié)果顯示，該突變體3葉期前植株呈淡黃色至白色，4葉期變綠，除成熟期株高顯著高于野生型以外，其他主要農(nóng)藝性狀均無顯著差異。通過遺傳分析確定該突變體的黃化轉(zhuǎn)綠表型受隱性單基因控制。利用gry突變體與野生型的F2群體構(gòu)建混池，通過BSA-seq的ΔSNP-index和ED 2種算法進行基因定位，結(jié)果顯示gry基因被定位在22.23～26.77 Mb區(qū)間內(nèi)。在該區(qū)間內(nèi)開發(fā)KASP標記對62個F2黃化轉(zhuǎn)綠單株進行驗證與連鎖分析，驗證gry基因在21.18～25.30 Mb區(qū)間內(nèi)?；诙ㄎ粎^(qū)間，結(jié)合基因注釋數(shù)據(jù)庫與水稻基因變異數(shù)據(jù)庫推測候選基因為LOC_Os03g40020，測序表明該基因在第1 768位發(fā)生單堿基T缺失，導致編碼的氨基酸大量改變而產(chǎn)生功能變化。

關(guān)鍵詞：苗期黃化轉(zhuǎn)綠突變體；BSA-seq；ΔSNP-index算法；ED算法

中圖分類號：S511.01 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0053-07

水稻是全球主要的糧食來源。水稻產(chǎn)量形成主要受“源、庫、流”及其相互之間的協(xié)調(diào)關(guān)系影響［1］。水稻葉片是主要的源性狀，它是植物進行光合作用的重要場所，水稻產(chǎn)量的90%以上來自葉片的光合作用，葉色突變往往制約水稻具有充足的源，并且葉色突變體是研究葉綠體發(fā)育、葉綠素生物合成、信號轉(zhuǎn)導、光合作用機制的理想材料，葉色突變的分子機制又是復雜多樣的［2］。因此，水稻葉色突變體研究不僅可以為選育強源的高光效品種提供理論依據(jù)，還可以進一步解析葉色調(diào)控的分子機制。

有關(guān)水稻葉色突變體的研究是廣泛而持續(xù)的，水稻葉色突變體包括黃化、斑馬、斑點、類病斑、滯綠、白化、紫色、白化轉(zhuǎn)綠等不同類型的表型［3-8］。目前已經(jīng)克隆了100多個相關(guān)基因，如參與葉綠體發(fā)育的SPP（編碼基質(zhì)加工肽酶，表型為白化）、AL1（編碼質(zhì)體核糖體L12蛋白，表型為白化致死）、ClpP（編碼Clp蛋白酶水解亞基，表型為黃化轉(zhuǎn)綠）、OsALBL（編碼三角狀五肽蛋白，表型為白化），參與光捕獲的OsLIL3（編碼捕光色素蛋白，表型為黃綠葉）和DYE1（編碼光系統(tǒng)Ⅰ中捕光復合物Ⅰ的一個亞基Lhca4，表型為持綠）；參與葉綠素生物合成的OsCAO1（編碼葉綠素a加氧酶，表型為淡綠葉）、OsCHLD（編碼鎂螯合酶的CHLD亞基，表型為黃化葉）和YGL1（編碼葉綠素合成酶，表型為黃化轉(zhuǎn)綠）；參與葉綠素降解的OsSGR（編碼鎂離子去螯合酶，表型為持綠）、YPD1（編碼LRR-Like1蛋白，表型為黃化）和NYC1（編碼葉綠素b還原酶，表型為滯綠）［9-18］。其中PPR（pentatricopeptide repeat，PPR）基因表達受阻易形成白化表型，該基因編碼的五肽蛋白在真核生物中無處不在，在原核生物中也有報道［19-20］。大多數(shù)植物三角狀五肽蛋白被定位在線粒體、質(zhì)體（葉綠體）上，也有研究將PPR定位于細胞質(zhì)、細胞核。在水稻中，大約每1.6 Mb就存在一個PPR基因，目前水稻中有400多個非冗余的PPR蛋白，并且不同位置的PPR蛋白具有不同的功能。例如位于線粒體的PPR（FLO18）可以調(diào)控線粒體功能和水稻胚乳發(fā)育，位于細胞質(zhì)中的PPR（OsCPPR1）有助于花粉發(fā)育，位于葉綠體的PPR（YSA）缺失對不同溫度和光照條件下雄性不育性不產(chǎn)生影響，并對雜種F1的產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀沒有負面影響［21-24］。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，BSA-seq已經(jīng)逐漸成熟，并且準確性有了明顯提高、成本也大幅降低［25-26］。將BSA-seq與傳統(tǒng)定位方法相結(jié)合可以快速、有效地獲得/縮小定位區(qū)間［27-28］。本研究利用該方法，將苗期黃化轉(zhuǎn)綠基因快速定位在22.23～26.77 Mb，并推測候選基因為LOC_Os03g40020，該基因編碼1個與葉綠體發(fā)育相關(guān)的三角狀五肽重復蛋白，以期為選育高光效品種及解析葉色調(diào)控的分子機制提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

gry是鎮(zhèn)稻18號中間材料的一個自然突變，經(jīng)過多代種植表明黃化轉(zhuǎn)綠表型可以穩(wěn)定遺傳。gry與9311構(gòu)建的F2群體作為分析群體，gry與野生型構(gòu)建的F2群體作為定位群體。試驗材料均種植于江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所行香創(chuàng)新基地，5月10日播種，6月15日移栽，單本種植，株行距 13.3 cm×25.0 cm。在拔節(jié)孕穗期取葉片提取DNA用于 BSA-seq。在成熟期，分別選取gry與野生型各20株進行農(nóng)藝性狀測定，包括株高、有效穗數(shù)、穗長、結(jié)實率、千粒重。

1.2 試驗方法

1.2.1 BSA-seq混池構(gòu)建及測序

播種后10 d，用掛牌區(qū)分gry與野生型構(gòu)建的F2群體中黃化與正常表型個體，移栽時分開種植。根據(jù)Takagi等的方法，在拔節(jié)孕穗期取gry與野生型親本各20株，F(xiàn)2群體突變與正常個體各40株，提取DNA并檢測其濃度，分別等量混合構(gòu)建P1池（gry）、P2池（鎮(zhèn)稻18號中間材料）、R池（黃化轉(zhuǎn)綠型F2）、D池（正常表型F2）［29］。然后對應構(gòu)建文庫，并采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行全基因組重測序，測序深度30×。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)分析

首先利用FastQC 0.11.5對測序結(jié)果（Raw reads）進行質(zhì)量控制得到Cleaned reads。再利用BWA 0.7.9將有效數(shù)據(jù)（Cleaned reads）比對到參考基因組（http：//plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index）上［30］。然后利用SAMtools 1.0比對對結(jié)果進行排序，利用Picard 1.120標記重復reads［31］。利用Picard V4.0局部重新比對與堿基質(zhì)量校正。最后利用重復標記后的比對結(jié)果進行覆蓋度、深度等統(tǒng)計。利用SAMtools 1.0檢測、過濾SNP及InDel信息；利用VEP 4.3注釋單核苷核多態(tài)性（SNP）及InDel結(jié)果?；谝陨汐@得的信息，利用MutMap pipeline進行數(shù)據(jù)分析，計算SNP在R池和D混池出現(xiàn)的頻率，對ΔSNP-index （2個子代池的SNP-index 的差值）進行滑窗作圖后，出現(xiàn)1個峰，該處就是連鎖區(qū)域，即可得到和突變表型連鎖的染色體區(qū)段和可能的突變位點［32］。同時，本研究還采用ED（euclidean distance）算法，通過計算不同混池間各突變型的頻率距離，采用距離差異來反映標記與目標區(qū)域的連鎖強度［33］。

1.2.3 定位區(qū)間分析驗證

基于BSA-seq區(qū)間，結(jié)合基因注釋與RiceVarMap2 （ncpgr.cn）公布的 4 726 個水稻品種的變異位點進行分析，推測候選基因。然后選取候選基因內(nèi)的變異位點與高峰兩側(cè)的變異位點各1個，設計引物開發(fā)KASP標記，選取62個F2單株進行驗證。引物利用SNPWay（http：//www.snpway.com/）進行設計，引物信息見表1，KASP檢測委托武漢市景肽生物科技有限公司進行。

1.3 表型數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics 21對突變體與野生型、秈稻93-11相互雜交的F2群體進行χ2檢驗，對突變體與野生型的株高、有效穗數(shù)、千粒重、結(jié)實率等表型數(shù)據(jù)進行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

突變體葉子在三葉期前植株呈淡黃色至白色（圖1-A），四葉期變綠（圖1-B），成熟期與野生型一樣呈綠色（圖1-C）。成熟期對突變體與野生型進行農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果顯示突變體株高顯著高于野生型，穗長、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、單株有效穗數(shù)無顯著差異（表2）。

2.2 gry突變性狀的遺傳分析

gry突變體分別與綠色野生型（粳稻）、93-11（秈稻）雜交，F(xiàn)1代均表現(xiàn)為綠色，F(xiàn)2代均出現(xiàn)黃化轉(zhuǎn)綠表型與綠色表型分離現(xiàn)象。經(jīng)卡方（χ2）檢驗，黃化轉(zhuǎn)綠植株與綠色植株數(shù)量符合3 ∶1的分離比（表3）。遺傳分析結(jié)果表明，gry突變體的黃化轉(zhuǎn)綠表型是隱性的，受單基因控制。

2.3 測序質(zhì)量分析

對來自gry×野生型的F2群體極端個體及雙親分別構(gòu)建的P1池（gry）、P2池（鎮(zhèn)稻18號中間材料）、R池（黃化轉(zhuǎn)綠型F2）、D池（正常表型F2）進行全基因組重測序，共獲得23.05 Gbp數(shù)據(jù)量，過濾后數(shù)據(jù)22.85 Gbp，并且過濾后數(shù)據(jù)質(zhì)量主要分布在Q30≥88%以上，GC含量在40%～41%。另外，P1、P2、R池、D池中分別有98.00%、99.00%、98.73%、98.63%的Clean Reads數(shù)比對到參考基因組（表4），這說明測序數(shù)量與質(zhì)量均合格，可用于后續(xù)分析。

2.4 SNP和InDel多態(tài)性分析

經(jīng)過檢驗、過濾，如表5所示，共鑒定出4 266個SNPs、435個InDels在雙親間有多態(tài)性。其中，SNP和InDel標記在12條染色體上的平均密度分別為11.43 SNP/Mb和1.17 InDel/Mb，每條染色體都有充分多、高質(zhì)量的標記可以用于BSA-seq分析。

2.5 基因定位及候選基因預測

根據(jù)ΔSNP-index方法分析，以95%置信區(qū)間作為閾值，在第3號染色體上鑒定出1個候選區(qū)間；根據(jù)ED方法分析，在第3號、第9號染色體上共鑒定到2個區(qū)間。由于黃化轉(zhuǎn)綠表型由單基因控制，結(jié)合2種算法，本研究將2種方法重疊的1個區(qū)間（22.23～26.77 Mb）認為是最終的候選區(qū)間（圖2）。

根據(jù)BSA-seq測序結(jié)果分析，候選區(qū)間內(nèi)共有684個SNP變異位點和156個Indel變異，這些變異位于58個基因。結(jié)合MSU-RGAP和RAP-DB 2個數(shù)據(jù)庫的基因注釋篩選出LOC_Os03g40020、LOC_Os03g44850、LOC_Os03g44880、LOC_Os03g44890、LOC_Os03g44900 5個基因。然后通過RiceVarMap2 （ncpgr.cn）公布的4 726個水稻品種的變異位點與5個初篩基因中的變異位點的對比分析，排除了4個基因中的變異位點，推測候選基因為LOC_Os03g40020［33］。該基因編碼1個與葉綠體發(fā)育相關(guān)的三角狀五肽重復蛋白，該基因僅由1個外顯子組成，通過突變體與野生型的測序比對表明：該基因在第1 768位發(fā)生單堿基T缺失，突變位點位于外顯子上，屬于移碼突變，導致該基因編碼的742個氨基酸中153個發(fā)生改變（圖3），從而影響其功能。因此將該基因確定為本研究的候選基因。

2.6 目標區(qū)間及變異位點驗證

本研究選取候選基因LOC_Os03g40020內(nèi)的變異位點與高峰兩側(cè)的變異位點各1個，設計KASP標記3-2223、3-2118、3-2530，基因分型結(jié)果顯示，3個標記可以用于區(qū)分不同基因型。然后利用F2群體中的突變表型單株進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標記3-2118處有1個交換株，標記3-2223處有0個交換株，標記3-2530處有27個交換株，并且左右兩邊交換株不同，這表明gry基因位于3-2118（21.18 Mb）和3-2530（25.30 Mb）之間，且3-2118為共分離標記（圖4）。結(jié)合標記3-2118所在變異位點為基因LOC_Os03g40020內(nèi)引起的功能變異，本研究認為，黃化轉(zhuǎn)綠表型是由LOC_Os03g40020基因突變引起的。

3 討論

水稻葉片是水稻最主要的源器官，提高源器官的光合效率能有效提高水稻單產(chǎn)。水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多葉色相關(guān)的基因，但是多數(shù)葉色相關(guān)基因會伴有葉片早衰、生育期延遲、產(chǎn)量降低等不良性狀［8，34］。因此，挖掘不影響水稻綜合農(nóng)藝性狀的葉色相關(guān)基因具有重要意義。本研究的突變體除幼苗期表現(xiàn)明顯白化外，后期產(chǎn)量性狀與野生型相比無顯著差異，具有潛在利用價值。因此，本研究的目的是研究苗期黃化轉(zhuǎn)綠突變體的遺傳基礎，并通過BSA-seq分析確定候選基因，助力解析高光效品種強源機制及葉色調(diào)控的分子機制，同時為設計育種選育強源、高光效的高單產(chǎn)品種奠定基礎。

與傳統(tǒng)基因定位相比，BSA-seq更高效，但是分析過程中使用不同的計算方式、置信區(qū)間閾值等會使定位區(qū)間產(chǎn)生波動，所以還需要結(jié)合傳統(tǒng)定位方式確定候選基因。例如，qFLT9通過BSA-seq方法被定位在9號染色體19.10～20.03 Mb區(qū)域，并通過連鎖圖譜分析將候選區(qū)域縮小到0.928 Mb的區(qū)間［35］。郭微利用BSA-seq中的ED算法將耐堿QTL定位在5條染色體上，InDel-index 算法將該QTL定位在第2號染色體，綜合這2種方法與傳統(tǒng)QTL定位結(jié)果進一步確定了候選區(qū)域［36］。本研究中，利用ΔSNP-index方法分析，以95%置信區(qū)間作為閾值，在第3號染色體上鑒定出1個候選區(qū)間；利用ED方法分析，以95%置信區(qū)間作為閾值，在第3號染色體、第9號染色體上鑒定到2個區(qū)間。由于黃化轉(zhuǎn)綠表型由單基因控制，本研究將2種方法重疊的一個區(qū)間認為是最終的候選區(qū)間。這也說明，若利用BSA-seq進行QTL鑒定需要通過傳統(tǒng)方式驗證，以排除算法等分析造成的影響。

另外，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，大量數(shù)據(jù)庫被發(fā)布，一些包含大量水稻基因組序列或者表型序列的數(shù)據(jù)庫為水稻相關(guān)研究提供了便利。本研究利用RiceVarMap2 （ncpgr.cn）數(shù)據(jù)庫，通過查詢數(shù)據(jù)庫中堿基在指定位置的出現(xiàn)頻率排除變異位點。例如LOC_Os03g44850基因在25 304 267 bp處有A（突變型）、G（野生型）2種類型，通過數(shù)據(jù)查詢，4 726 個水稻品種中56.10%為A型，43.30%為G型，說明這個位點是一個常見變異位點。而本研究的黃化轉(zhuǎn)綠自然突變表型是一個非常規(guī)表型，因此可以將該位點排除。該數(shù)據(jù)庫的利用促進了本研究的進行，為普通水稻功能基因組研究者和水稻育種者提供了便捷有效的途徑。

本研究利用BSA-seq定位了1個隱性苗期黃化轉(zhuǎn)綠突變體基因gry，并利用KASP標記進行了驗證，將區(qū)間確定在21.18～25.30 Mb區(qū)間內(nèi)。通過基因注釋數(shù)據(jù)庫與水稻基因變異數(shù)據(jù)庫推測候選基因為LOC_Os03g40020，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)gry基因與前人克隆的ysa基因［24］等位。但是通過對DNA序列和氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，gry基因為1個堿基缺失，ysa基因為5 bp缺失，并且缺失位置不同，ysa基因突變導致更多氨基酸的改變（圖3）。因此，本研究定位的gry基因是一個具有新的變異位點的LOC_Os03g40020等位基因。

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收稿日期：2023-06-30

基金項目：句容市農(nóng)業(yè)科技支撐計劃（編號：ZA32221）；鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學院青年基金（編號：QNJJ2018002）。

作者簡介：杜燦燦（1989—），女，江蘇徐州人，碩士，助理研究員，主要從事水稻遺傳育種及推廣應用研究。E-mail：20162804@jaas.ac.cn。

通信作者：龔紅兵，碩士，研究員，主要從事水稻新品種選育及推廣應用研究。E-mail：hongbinggong973@sina.com。