沃柑霉腐病病原菌的鑒定、生物學特性及拮抗菌株篩選

摘要：沃柑霉腐病原菌的鑒定、生物學特性研究及其拮抗菌株篩選，將有助于沃柑的生物防腐研究。目前對于柑橘霉腐的病原菌已經(jīng)分離出意大利青霉、指狀青霉、擴展青霉等，未見文獻報道針對武鳴地區(qū)沃柑霉腐病病原菌的鑒定及生物學特性研究。為了明確武鳴地區(qū)沃柑霉腐病的主要病原菌及其生物學特性，以在武鳴沃柑種植核心示范區(qū)生產(chǎn)基地采集的霉腐沃柑果實為試驗材料，利用組織培養(yǎng)法和平板劃線法分離病原菌并通過科赫法則驗證明確病原菌，形態(tài)學和分子生物學分析結(jié)合鑒定病原菌，進一步分析病原菌的生物學特性和生物防治菌譜。結(jié)果表明，皮殼青霉（Penicillium crustosum）是引起武鳴沃柑霉腐病的病原菌，它在不同培養(yǎng)基、pH值以及溫度的環(huán)境下生長各不相同，能夠適應多種營養(yǎng)環(huán)境，生命力強，最適生長pH值為7，最適生長溫度為20 ℃，高鹽濃度的環(huán)境會抑制病原菌的生長。生物防治菌譜的研究表明，解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、非脫羧勒克菌以及季也蒙邁耶氏酵母對該病原菌的生長有抑制作用，具有開發(fā)成為病原菌生物防治菌劑的潛力。綜上，本研究鑒定了武鳴地區(qū)沃柑霉腐病病原菌為皮殼青霉，并研究了其生物學特性，明確其最適生長環(huán)境條件和生物防治菌譜，為防治沃柑霉腐病害提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：沃柑；霉腐病；皮殼青霉；生物學特性；生物防治

中圖分類號：S436.66" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0131-08

沃柑（Orah）是以色列科研人員將“坦普爾”橘橙與“丹西”紅橘雜交獲得的晚熟型柑橘品種，其生長勢強，冬季果實落地少，掛果能力強［1］。沃柑果實外觀飽滿喜慶，果肉嫩滑汁多，口感甜柔、低酸爽口；富含氨基酸、維生素C、胡蘿卜素以及膳食纖維等多種營養(yǎng)成分。我國最早在重慶、四川柑橘產(chǎn)區(qū)就引入種植沃柑，但種植效果不理想。2012年沃柑從四川引種到廣西南寧市武鳴區(qū)，獲得了得天獨厚的土壤優(yōu)勢和氣候條件的沃柑，生長旺盛，早結(jié)豐產(chǎn)，而且口感清甜、外觀漂亮，因而深受喜愛，沃柑果實的市場售價曾高達24元/kg［2-3］。沃柑在武鳴地區(qū)種植面積飛速增長，從2012年的53.33 hm2發(fā)展到2022年的30 666.67 hm2，是全國沃柑種植面積最大的縣（區(qū)），產(chǎn)量由7 334 t增長到2022年/2023年采收季的150萬t，年產(chǎn)值達到百億元。沃柑在采收、銷售過程中容易受到機械損傷，極易受到各種致病菌的侵害而引起腐爛。

柑橘采后腐爛是造成經(jīng)濟損失最嚴重的因素之一。腐爛的柑橘既影響銷售價格又污染環(huán)境，危害人體健康。研究表明柑橘腐爛大多是由真菌侵染造成的，其中由指狀青霉引起的綠霉病和意大利青霉引起的青霉病是柑橘采后腐爛的2種主要病害，其造成的損失約占總損失的90%［4-5］。柑橘腐爛病害的發(fā)生與品種、氣候、采收及后續(xù)處理有關。柑橘產(chǎn)區(qū)在溫暖、濕潤地區(qū)比涼爽、干燥地區(qū)的腐爛情況更嚴重，這與病原真菌的適宜生長環(huán)境一致［6］。霉腐病害的防治主要有物理防治、化學防治以及生物防治等方法。物理防治一般是利用熱處理、低溫處理、臭氧氣體熏蒸及紫外照射等物理技術(shù)達到抑制病原菌而防腐，但青霉病菌抗逆性強，在較低的溫度仍能生長，能耐物理輻射，物理防治具有一定局限性?；瘜W防治是使用抑菌哇、撲菌靈、噻菌靈等化學藥劑通過浸泡或噴灑等方式施于果實表面，達到抑制或滅殺病原菌生長而防腐，是一種較為有效的方法；但農(nóng)藥殘留會危害人體健康，如雙胍鹽有致癌作用等，受到消費者的抵制。生物防治是利用益生菌抑制病原菌的生長而起到防腐作用，具有來源安全、高效、無毒以及易于降解的優(yōu)點，是實現(xiàn)水果無公害防腐的有效途徑，也是開發(fā)新型水果生物防腐技術(shù)的發(fā)展方向之一，在水果保鮮領域具有廣闊的前景［7］。

對沃柑霉腐病病原菌進行分離鑒定并研究其生物學特性，將有助于沃柑的生物防腐研究。目前對于柑橘霉腐病的病原菌已經(jīng)分離出意大利青霉、指狀青霉、擴展青霉等病原菌，未見文獻報道針對武鳴地區(qū)沃柑霉腐病病原菌的鑒定及生物學特性研究。因此，本研究擬從武鳴地區(qū)沃柑腐爛果實中分離鑒定出病原菌，并研究其生物學特性，明確其最適生長環(huán)境條件和生物防治菌譜，以期為防治沃柑霉腐病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試發(fā)生霉腐病的沃柑果實在廣西南寧市武鳴區(qū)沃柑種植核心示范區(qū)的生產(chǎn)基地采集，用無菌塑封袋封裝帶回實驗室后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

解淀粉芽孢桿菌A13、解淀粉芽孢桿菌YK3、季也蒙邁耶氏酵母PJ15、貝萊斯芽孢桿菌HS1、貝萊斯芽孢桿菌WYT9、非脫羧勒克菌MA2、糞腸球菌 RU19、非解乳糖鏈球菌 RU6、地衣芽孢桿菌R2、假單胞菌Y6、銅綠假單胞菌CJ8等菌株均為筆者所在實驗室篩選保存。

試驗時間為2021年6月至2022年12月。試驗地點為廣西科學院生物科學與技術(shù)研究所非糧生物質(zhì)能技術(shù)全國重點實驗室的試驗平臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化及形態(tài)特征

選取腐爛的沃柑果實，在超凈工作臺中進行病原菌的分離試驗。先用75%乙醇對病果表面進行消毒，用無菌剪刀剪開腐爛部位，再用無菌鑷子夾取腐爛果皮組織轉(zhuǎn)入PDA平板，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌絲后用無菌接種環(huán)取菌落邊緣的菌絲在新的PDA平板中按“之”字形劃線，待長出單菌落后用無菌接種環(huán)取菌落邊緣的菌絲在新的PDA平板中按“之”字形劃線，重復直至獲得病原菌純培養(yǎng)物。將病原菌純培養(yǎng)物接種至PDA平板，培養(yǎng)觀察菌落大小、邊緣形狀及濕潤程度等，用顯微鏡觀察病原菌分生孢子大小、形態(tài)等特征。

1.2.2 病原菌致腐性的驗證

用無菌水清洗PDA平板上培養(yǎng)的病原菌菌落，制備成1×105 CFU/mL的孢子懸液。選取新鮮、健康的沃柑果實用75%乙醇表面消毒，然后用無菌水沖洗3次，晾干。用 5 mm 的無菌打孔器在沃柑果實腰部打孔但不深入果肉。試驗組每個孔接種50 μL病原菌孢子懸液，對照組接等量的無菌水。裝入無菌袋中密封，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察記錄發(fā)病情況，試驗獨立重復3次。

1.2.3 病原菌的分子生物學鑒定

采用OMEGA公司的真菌DNA提取試劑盒提取病原菌的總DNA，以通用引物ITS1/ITS4（ITS1：5′-FTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-RTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對提取好的病原菌總DNA進行PCR擴增，PCR反應體系（50 μL）為：2× PCR Supermix 25 μL，10 μmol/L Primer-F 2 μL，10 μmol/L Primer-R 2 μL，DNA template 1 μL，ddH2O 20 μL。 PCR反應條件為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán)；72 ℃ 3 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序獲得的序列登錄NCBI進行Nucleotide BLAST序列比對，并將病原真菌的序列與對比得出的同源性序列在MEGA 6.06軟件上用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

制備YPD培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基等8種常見的培養(yǎng)基平板，在超凈臺中操作，接種10 μL 1×105 CFU/mL病原菌孢子懸液至平板的中央，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后觀察菌落形態(tài)，用游標卡尺測量平板菌落直徑，菌落直徑測量采用十字交叉法，所有處理均設置3個重復。

1.2.5 不同pH值對病原菌生長的影響

制備YPD培養(yǎng)基平板，設置不同的pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，在超凈臺中操作，接種10 μL 1×105 CFU/mL 病原菌孢子懸液至平板的中央，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后觀察菌落形態(tài)，用游標卡尺測量平板菌落直徑，菌落直徑測量采用十字交叉法，所有處理均設置3個重復。

1.2.6 不同溫度對病原菌生長的影響

制備YPD培養(yǎng)基平板，在超凈臺中操作，接種10 μL 1×105 CFU/mL病原菌孢子懸液至平板的中央，分別置于4、10、20、30、40、50 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后觀察菌落形態(tài)，用游標卡尺測量平板菌落直徑，菌落直徑測量采用十字交叉法，所有處理均設置3個重復。

1.2.7 不同鹽濃度對病原菌生長的影響

制備YPD培養(yǎng)基平板，設置鹽濃度分別為0、0.5%、1%、2%、4%、6%、8%、10%的NaCl溶液。在超凈臺中操作，接種10 μL 1×105 CFU/mL病原菌孢子懸液至平板的中央，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后觀察菌落形態(tài)，用游標卡尺測量平板菌落直徑，菌落直徑測量采用十字交叉法，所有處理均設置3個重復。

1.2.8 病原菌生物防治菌譜的初步研究

采用平板對峙法驗證解淀粉芽孢桿菌A13、解淀粉芽孢桿菌YK3、季也蒙邁耶氏酵母PJ15、貝萊斯芽孢桿菌HS1、貝萊斯芽孢桿菌WYT9、非脫羧勒克菌MA2、糞腸球菌 RU19、非解乳糖鏈球菌 RU6、地衣芽孢桿菌R2、假單胞菌Y6、銅綠假單胞菌CJ8對病原菌的抑制情況。在平板中央接種10 μL 1×105 CFU/mL病原菌孢子懸液，然后在距離病原菌接種點3 cm處呈十字交叉接種50 μL拮抗菌液（D600 nm=1），對照組僅接種病原菌。糞腸球菌RU19、非解乳糖鏈球菌RU6在MRS平板上進行，解淀粉芽孢桿菌A13、解淀粉芽孢桿菌YK3、季也蒙邁耶氏酵母PJ15、貝萊斯芽孢桿菌HS1、貝萊斯芽孢桿菌WYT9、非脫羧勒克菌MA2、地衣芽孢桿菌R2、假單胞菌Y6、銅綠假單胞菌CJ8在PDA平板上進行。接種后，平板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后觀察菌落形態(tài)，用游標卡尺測量平板菌落直徑，菌落直徑測量采用十字交叉法，所有處理均設置3個重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013 軟件進行整理與統(tǒng)計分析。利用Excel中的STDEVP函數(shù)進行標準差分析，利用Excel分析工具庫里的方差分析進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化及形態(tài)特征

采用組織培養(yǎng)法和平板劃線法對從武鳴沃柑主產(chǎn)區(qū)收集的腐爛沃柑果實進行病原菌的分離，單菌落純化后獲得1株病原菌，命名為Q3。之后將繼續(xù)對Q3的菌落、分生孢子等形態(tài)進行觀察、分析。從PDA平板正面觀察，Q3菌株的菌落呈邊緣較整齊的圓形，初始菌絲為白色，后期菌落為淡綠色，菌落上有放射狀輪紋，質(zhì)地絨狀兼有粉末狀，分生孢子生長較快，能形成明顯的青綠色霉層（圖1-a）。在PDA培養(yǎng)基背面觀察為淡黃色（圖1-b）。在顯微鏡下觀察Q3的菌絲，呈“樹枝”形狀，菌絲粗壯，分生梗先端有1～3個分枝，分生孢子呈現(xiàn)球形，較稀疏（圖1-c）。

2.2 病原菌致腐性的驗證

將從腐爛沃柑果實中分離純化獲得的病原菌Q3接種至無病害的沃柑果實，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，接種Q3的試驗組產(chǎn)生腐爛癥狀（圖2-T），而對照組無腐爛情況（圖2-CK），表明Q3是能夠引起沃柑果實腐爛的病原菌。接種Q3的癥狀是果皮表面腐爛，呈褐色，周圍產(chǎn)生水漬。當Q3菌株侵染了沃柑果實時，起初傷口產(chǎn)生白色的菌絲，周圍產(chǎn)生水漬，逐漸擴大并變得略微凹陷，并長出綠色霉層，果肉腐爛?；亟影l(fā)病的沃柑果實上長出的菌落與接種的Q3形態(tài)相同，根據(jù)科赫法則驗證證明所分離獲得的Q3是導致沃柑果實霉腐病的病原菌。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

提取Q3的總DNA，以ITS1/ITS4通用引物進行PCR擴增并將擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小約為750 bp的片段且無雜帶（圖3），符合測序要求。將PCR擴增產(chǎn)物送至測序公司測序，測序獲得的序列登錄 NCBI 進行Nucleotide BLAST序列比對，并將病原真菌的序列與對比得出的同源性序列在 MEGA 6.06 軟件上用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖4可知，Q3菌株位于皮殼青霉（Penicillium crustosum）的分支，對比序列的同源性為99.81%。結(jié)合形態(tài)學分析，鑒定所分離獲得的沃柑果實霉腐病病原菌Q3為皮殼青霉（Penicillium crustosum）。

2.4 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

由圖5、表1可知，病原菌Q3在8種常見的培養(yǎng)基上均能生長，但在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)表現(xiàn)出較大的差異。其中在YPD培養(yǎng)基上菌落生長速率最快，為 5.55 mm/d；其余依次是察氏培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。在察氏培養(yǎng)基與沙氏培養(yǎng)基上，Q3的生長速率差異不顯著（P＞0.05）；在PDA培養(yǎng)基和玉米粉培養(yǎng)基上，Q3的生長速率差異不顯著（P＞0.05），其余培養(yǎng)基之間的生長速率差異顯著（Plt;0.05）。在YPD培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基上，菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，氣生菌絲連成一片，有褶皺，質(zhì)地較硬，干燥，呈奶白色，孢子較少，無青綠色霉層。在察氏培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基上，均能形成較規(guī)則的圓形、菌絲較為密集的菌落，菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，菌落為綠色，菌落上有放射狀輪紋，質(zhì)地絨狀兼有粉末狀，孢子較多，能形成明顯的青綠色霉層，與PDA培養(yǎng)基接近。在沙氏培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)正好處在上述2類之間，菌落的氣生菌絲連成一片，有褶皺，菌絲呈白色和綠色混合。在營養(yǎng)匱乏的瓊脂培養(yǎng)基上，病原菌Q3仍能生長，但菌絲伸出培養(yǎng)基生長，菌絲分支少，且每段分支較長，無色素產(chǎn)生，無孢子產(chǎn)生。表明病原菌Q3能夠適應多種營養(yǎng)環(huán)境，生命力強。

2.5 不同pH值對病原菌生長的影響

病原菌Q3在pH值4～10的環(huán)境中均能生長（表2），均可以形成較規(guī)則的圓形、菌絲較為密集的青綠色霉層菌落。pH值為7時，最適合病原菌Q3的生長，菌落直徑最大，生長速率最快，為4.14 mm/d，與其他pH值比較差異顯著（Plt;0.05）。病原菌Q3在較偏酸（pH值為4）、較偏堿（pH值為10）的環(huán)境中仍能保持較快的生長速率，且在堿性環(huán)境中的生長速率要比酸性中的快，能夠較好地抵抗偏酸偏堿的極端生物環(huán)境。在pH值為8、9、10的環(huán)境之間，病原菌Q3的生長速率差異不顯著（P＞0.05），在pH值為4、5、6的環(huán)境之間，病原菌Q3的生長速率差異顯著（Plt;0.05）。表明病原菌Q3對酸堿環(huán)境的適應性較強。

2.6 不同溫度對病原菌生長的影響

不同溫度對病原菌Q3的生長影響有顯著性差異（Plt;0.05）（表3）。在10～30 ℃之間可以生長，均可以形成較規(guī)則的圓形、菌絲較為密集的青綠色霉層菌落。其中，在20 ℃條件下，病原菌Q3的生長速率最快，為4.36 mm/d。高溫和低溫均會抑制病原菌Q3的生長，在10 ℃時，病原菌Q3生長較為緩慢；在4 ℃時， 生長緩慢，基本停滯。當溫度上升達到40 ℃以上時，病原菌Q3停止生長。表明在 20～30 ℃附近的環(huán)境溫度最適合病原菌Q3的生長。

2.7 不同鹽濃度對病原菌生長的影響

不同鹽濃度對病原菌Q3的生長影響有顯著性差異（Plt;0.05）（表4）。在0～10%的鹽濃度下，均可以形成較規(guī)則的圓形、菌絲較為密集的青綠色霉層菌落。在0.5%鹽濃度下，仍可以保持正常的生長，生長速率為4.08 mm/d，與無鹽環(huán)境下的病原菌Q3生長速率無顯著差異（P＞0.05）。隨著鹽濃度的升高，病原菌Q3的生長被顯著抑制（Plt;0.05），當鹽濃度達到10%時，病原菌Q3生長已經(jīng)較緩慢，生長速率為1.40 mm/d，比無鹽環(huán)境降低了65.77%。表明高鹽濃度的環(huán)境會抑制病原菌Q3的生長。

2.8 病原菌生物防治菌譜的初步研究

研究筆者所在課題組菌種庫中的各種生防菌對病原菌Q3的抑制作用，結(jié)果見表5。由圖5可知，來源于沃柑葉片和根際土壤的解淀粉芽孢桿菌A13、解淀粉芽孢桿菌YK3和來源于市售葡萄果實表面的季也蒙邁耶氏酵母PJ15對病原菌Q3有較強的抑制作用。來源于芒果根際土壤的非脫羧勒克菌MA2、來源于牛糞便的貝萊斯芽孢桿菌HS1以及來源于魔芋根際土壤的貝萊斯芽孢桿菌WYT9對病原菌Q3也有抑制作用，但較解淀粉芽孢桿菌A13、解淀粉芽孢桿菌YK3和季也蒙邁耶氏酵母PJ15的作用要弱。表明利用芽孢桿菌、酵母菌等拮抗微生物來防治沃柑霉腐病害，在沃柑產(chǎn)業(yè)的綠色化發(fā)展上具有巨大的潛力。

3 討論

柑橘在采收過程中容易受到機械損傷，極易遭受各種病原菌入侵而引起腐爛，由擴展青霉、意大利青霉、指狀青霉等青霉屬病原菌引起的霉腐最為嚴重，發(fā)病初期呈水漬狀病斑，長出白色菌絲體，最后中間部位變?yōu)榍嗑G色［6］。本研究從武鳴沃柑主產(chǎn)區(qū)收集的腐爛沃柑果實進行病原菌分離，通過采用稀釋涂布法和平板劃線法進行病原菌分離，通過科赫法則證明其致病性，根據(jù)菌落形態(tài)特征及現(xiàn)代分子生物技術(shù)，最終鑒定皮殼青霉Q3為沃柑霉腐的主要病原菌。皮殼青霉Q3入侵沃柑后，果皮表面腐爛，周圍產(chǎn)生水漬，并先長出白色菌絲而后長出綠色霉層，果肉腐爛，本研究與前人報道的由擴展青霉、意大利青霉、指狀青霉引起的柑橘霉腐病的癥狀類似。宋波等從腐爛柚子上分離獲得的皮殼青霉DYC1-1，能夠引起沃柑果實出現(xiàn)褐色斑漬、腐爛并長出藍綠色霉層［8］，本研究結(jié)果與之相似。有文獻報道，皮殼青霉也是引起樹莓［9］、板栗［10］、梨［11-12］、蘋果［13］、油桃［14］等腐爛的病原菌。

病原菌Q3能夠適應多種營養(yǎng)環(huán)境，生命力強，在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)表現(xiàn)出較大的差異。其中YPD培養(yǎng)基上菌落生長速率最快，其余依次是察氏培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。在有機碳源、氮源豐富的培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基）上，生長環(huán)境營養(yǎng)豐富，病原菌Q3生長速率快，主要進行營養(yǎng)生長，產(chǎn)孢較少。比較在察氏培養(yǎng)基和高氏1號培養(yǎng)基上的生長情況，可知蔗糖的添加有利于促進病原菌Q3的生長。朱祎一等的研究也表明，蔗糖是最利于致板栗腐爛的皮殼青霉的菌絲生長和產(chǎn)孢的碳源之一［10］。有機營養(yǎng)較簡單和無機營養(yǎng)的培養(yǎng)基有益于產(chǎn)生質(zhì)地絨狀兼有粉末狀的青綠色孢子層，同時也能保持較快的生長速率，有利于病原菌Q3試驗菌種的制備。在營養(yǎng)匱乏的瓊脂培養(yǎng)基上，病原菌Q3仍能生長，但菌絲伸出培養(yǎng)基生長，菌絲分支少，且每段分支較長，無色素產(chǎn)生，無孢子產(chǎn)生。病原菌Q3對酸堿環(huán)境的適應性較強，最適pH值為7，偏酸偏堿會抑制其生長，但仍能保持較快的速率生長，但環(huán)境pH值為4時其生長受到抑制。張曉宇等的研究結(jié)果也表明，皮殼青霉在pH值低于4時其生長明顯受到抑制［9］。不同溫度對病原菌Q3的生長影響差異顯著，在20～30 ℃附近的環(huán)境溫度最適合病原菌Q3生長，4 ℃ 以下的低溫和40 ℃以上的高溫均會抑制病原菌Q3的生長，這與張曉宇等的研究結(jié)果［9］相似。Stoic＇等的研究結(jié)果也表明，皮殼青霉的最適生長溫度為25 ℃，溫度高于37 ℃時皮殼青霉就無法生長［15］，本研究結(jié)果與之類似。不同鹽濃度對病原菌Q3的生長影響也有顯著性差異，低鹽濃度（0.5%）還可以保持較快的速率生長，隨著鹽濃度的增加，病原菌Q3的生長被顯著抑制。丁仁惠等的研究也表明，培養(yǎng)基鹽濃度為0.3%時，意大利青霉和指狀青霉菌均可較快生長，隨著鹽濃度的提高，生長受到抑制［16］，本研究結(jié)果與之相似；當鹽濃度達到4%時，意大利青霉生長已被完全抑制，指狀青霉生長也幾乎受到完全抑制，本研究結(jié)果與之不同，在4%的鹽濃度下，皮殼青霉雖受到抑制，但仍可以保持一定是速率生長。呂丙鈺等對擴展青霉的生物學特性進行研究，擴展青霉在10～30 ℃均能生長，當溫度達到35 ℃時，菌落不生長；在pH值為4～11時均能生長，對pH值的適應范圍較寬；蛋白胨、酵母粉等有機營養(yǎng)利于菌絲生長［17］，本研究結(jié)果與之類似。

對病原菌Q3的生防菌譜進行初步研究，證明解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、非脫羧勒克菌以及季也蒙邁耶氏酵母對病原菌Q3有抑制作用，具有開發(fā)成病原菌Q3生物防治菌劑的潛力。宋波等的研究也表明，貝萊斯芽孢桿菌可以抑制皮殼青霉的生長［18］，本研究結(jié)果與之相同。嚴圓的研究也表明，季也蒙畢赤酵母可以抑制引起梨果霉腐病的擴展青霉［7］，本研究結(jié)果與之相似。閻然等的研究表明，解淀粉芽孢桿菌可以抑制引起臍橙霉腐病的指狀青霉的生長［19］，本研究結(jié)果與之類似。

4 結(jié)論

本研究明確了武鳴沃柑霉腐的主要病原菌為皮殼青霉（Penicillium crustosum），并分析了其生物學特性和生物防治菌譜。病原菌Q3能夠適應多種營養(yǎng)環(huán)境，生命力強，對pH值的適應范圍較寬，最適pH值為7，最適生長溫度為20 ℃，高鹽濃度的環(huán)境會抑制其生長。解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、非脫羧勒克菌以及季也蒙邁耶氏酵母對病原菌Q3的生長有抑制作用，在沃柑霉腐病害的綠色防控上具有巨大的應用潛力，對促進沃柑產(chǎn)業(yè)的綠色循環(huán)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。

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