基于SCAR分子標記和倍性鑒定蘭屬花卉的研究

摘要：基于特異性片段擴增（SCAR）和倍性鑒定蘭屬花卉，為雜交育種親本選配奠定基礎，以蘭屬花卉的27個大花蕙蘭和31個國蘭品種為試材，通過SCAR分子標記和流式細胞儀進行親緣關系和倍性檢測，構建系統(tǒng)進化樹。SCAR分子標記構建的系統(tǒng)進化樹結果顯示：58個品種聚為3支，第1支包括8個大花蕙蘭品種（福娘、523、紅袍等）和16個國蘭品種（碧龍紅素、汗血寶馬、出水芙蓉等），第2支為11個大花蕙蘭品種（金玉滿堂、日本香蘭、紅雙喜等）和6個國蘭品種（一代天驕、春蘭麻殼素、如意素荷等），第3支包括8個大花蕙蘭品種（616、黃金歲月、楊貴妃等）和9個國蘭品種（碧龍奇蓮、西蜀道光、大雪素等）；倍性鑒定結果顯示：27個大花蕙蘭品種中有7個二倍體（日本櫻花、綠翡翠、夢境等）、16個三倍體（黃金歲月、蝶影、日本香蘭等）、4個四倍體（英雄、523、福娘等）。部分大花蕙蘭和國蘭品種親緣關系較近，可用作雜交育種親本，但由于大花蕙蘭倍性較為豐富。因此，大花蕙蘭作為雜交育種親本，選配時需進行倍性鑒定。綜上，SCAR分子標記能高效、全面和精準鑒別蘭屬花卉間的親緣關系，結合倍性鑒定，可為高效雜交育種奠定基礎。

關鍵詞：蘭屬花卉；SCAR分子標記；倍性鑒定；親本選配；大花蕙蘭

中圖分類號：S682.310.3" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0031-08

蘭花在我國擁有著2 000多年的栽培歷史，作為中國的十大名花之一，不僅擁有著重要的觀賞價值，還具有很高的藥用價值。蘭屬（Cymbidium）花卉包括地生蘭、附生蘭和腐生蘭，為草本植物。是蘭科下的一個屬。傳統(tǒng)意義上的中國蘭花僅指地生蘭，主要包括蘭屬中建蘭（C. ensifolium）、春蘭（C. goeringii） 、墨蘭（C. sinense）、寒蘭（C. kanran）、蕙蘭（C. faberi）、春劍（C. longibracteaturn）和蓮瓣蘭（C. lianpan），這7個品系的共同特點為株型矮小、緊湊，花清香、淡雅，花型花色豐富。大花蕙蘭（C. hybridum）作為近幾年熱銷的花卉之一，不僅用作鮮切花，還用于裝點室內(nèi)環(huán)境、饋贈親朋好友的禮儀盆花。其為蘭屬中以小花垂生種和大花附生種以及一些地生蘭為父母本，通過1個世紀的人工雜交，培育出色澤艷麗、植株強健、花朵碩大、花期較長的一類品種的統(tǒng)稱，即為品種群的統(tǒng)稱［1］。目前，在我國市場上大花蕙蘭的主要用途是做盆花和切花［2］。由于蘭屬植物原生種間遠緣雜交較易成功，在英國皇家園藝學會（RHS）上已經(jīng)注冊了許多雜交種，包括春蘭、墨蘭、建蘭和紋瓣蘭等4個品系的蘭花。前人研究發(fā)現(xiàn)，利用春蘭、墨蘭、寒蘭等地生小花類與大花蕙蘭進行雜交，可以改良大花蕙蘭的花香、花色、葉色、葉寬、株高、株形、冠幅等性狀［3-4］。

特定序列擴增（sequence characterized amplified regions，SCAR）分子標記是一種單基因位點多態(tài)性標記技術。由于其具有分析快速準確、操作簡單、方便、價格低廉、單位點多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、特異性及重復性較高等特點，因此，該技術已被廣泛應用于各種分子育種之中，包括輔助育種、種質(zhì)鑒定、抗病基因連鎖定位、高密度遺傳圖譜構建。近年來，SCAR分子標記技術已經(jīng)在天麻、石斛、白芨中得到應用［5-7］。除此之外，SCAR分子標記在蘭花上也有一定的應用，如蝴蝶蘭、大花蕙蘭和國蘭［8-11］。

多倍體是指具有2套以上完整染色體組的生物個體，其廣泛存在于動植物及微生物中［12-14］。多倍體植物在外形上主要具有花朵大、葉片顏色較深、葉厚、果實大、莖稈相對粗壯等特征；在生理上具有較強的適應性和抗性［15-17］。常見的多倍體有三倍體、四倍體、五倍體、六倍體以及八倍體等。大花蕙蘭是天然的雜合體，具有不同的倍性（二倍體、三倍體、四倍體、五倍體及六倍體）且以三倍體居多，其品種具有類型繁多、花朵大、顏色豐富、花期較長等特點［18］。國蘭作為我國十大名花之一，傳承著我國悠久而璀璨的蘭文化，其主要特征是花色素雅、花小而奇特、花香清而不濁，無論是株型、花型還是葉藝都具有很高的觀賞價值。蘭屬花卉中的國蘭、大花蕙蘭品種資源豐富，但其株型、花色花型及花香差異較大，用于新種質(zhì)創(chuàng)制的親本，可極大滿足市場需要。目前，利用SCAR分子標記及倍性檢測共同對物種進行研究的方法已經(jīng)在梨、柑橘和水稻等物種中有過運用［19-21］。然而尚未見對蘭屬進行過分子標記和大花蕙蘭植株倍性系統(tǒng)研究。因此，本研究以27個大花蕙蘭品種和31個國蘭品種為試材（表1），通過SCAR分子標記技術與倍性檢測，擬將為蘭屬花卉育種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的大花蕙蘭采集于云南省昆明市嵩明縣，國蘭采集于云南省大理州。試驗與2022年11月至2023年3月在云南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院實驗室進行。栽培環(huán)境條件：溫度范圍為5～30 ℃，空氣濕度為50%～80%，水pH值范圍為5.8～6.5，微酸性水（大花蕙蘭）；適宜光照度為7 000～15 000 lx，避免直射強光，最佳溫度為15～25 ℃，最佳空氣相對濕度為65%～85%，具有通風設備（國蘭）。

1.2 試驗方法

1.2.1 27個大花蕙蘭和31個國蘭DNA提取

以27個大花蕙蘭和31個國蘭無病蟲害的新鮮植物葉片為材料，采用武漢納磁生物科技有限公司DNA提取試劑盒提取樣品DNA，取5 μL DNA樣品和 2 μL 凝膠加樣緩沖液（10×Loading Buffer）混勻后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳緩沖液是由三羥甲基氨基甲烷（Tris Base）、乙酸（Acetic Acid）和乙二胺四乙酸（EDTA）組成的緩沖液（1×TAE），電泳條件為120 V，25 min；電泳結束后將凝膠放入IQuant capture凝膠成像系統(tǒng)中，進行拍照觀察，根據(jù)所用marker估測樣品DNA的濃度和分子量，并將待檢測樣品DNA保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 SCAR分子標記的特異性條帶擴增

以提取的所有蘭花資源的DNA為模板進行PCR擴增，擴增的引物序列為SF： 5′-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3′，SW： 5′-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3′［22］。在美國MJ Research 公司的 PTC-200 型 PCR儀上進行特異性條帶擴增，擴增體系總體積為25 μL，其中，1.0 μL DNA模板，0.25 μL TaqDNA聚合酶［5 U/μL，寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司）］，1.5 μL 0.002 5 mol/L dNTPs，2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），1.0 μL SF（0.01 mol/μL），1.0 μL SW（0.01 mol/μL），17.75 μL ddH2O。擴增程序為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，產(chǎn)物送北京擎科生物科技股份有限公司完成測序。

1.2.3 構建系統(tǒng)進化樹

序列用BioEdit軟件的CLUSTAL W程序進行對位排列后，再進行手工校正。在MEGA 4.0軟件中，采用Kimura 2-參數(shù)距離方法，計算出國蘭和大花蕙蘭不同品種的遺傳距離［23］。分別用MEGA 4.0中的鄰接法（neighbor-joining method）構建rDNA ITS系統(tǒng)進化樹［24］。

1.2.4 倍性檢測

使用流式細胞儀（Partec CyFlow Space）及倍性分析試劑盒（Partec CyStain UV Precise P）對27個大花蕙蘭和31個國蘭樣本進行分析，由樣本的平均熒光強度判斷倍性。取待測蘭花新鮮植株葉片0.5 cm2置于培養(yǎng)皿中，取細胞核裂解液400 μL加于植物葉片之上并將葉片切碎：先橫向充分切碎后再縱向切碎，用裂解液提取1 min后，將液體用30 μm濾網(wǎng)過濾至樣品管中，加入1 500 μL染色液，避光染色1 min后用流式細胞儀進行檢測，確定植株倍性。

2 結果與分析

2.1 SCAR分子標記的特異性條帶擴增

檢測結果見圖1，從檢測的結果來看，每個品種提取的條帶清晰。說明用該試劑盒提取方法來提取蘭花基因組DNA是可行的。SCAR標記的引物PCR擴增結果見圖2，能夠清晰地看到蘭屬樣本中擴增出約為1 070 bp的特異性條帶，說明本試驗設計的擴增程序是可行的［25］。

2.2 SCAR分子標記序列系統(tǒng)進化樹

由圖3可知，從群體上看，所有樣本聚為3支。130、天之驕子、福娘、火炬、523、紅袍、碧龍紅素、中華奇珍、紅海棠、汗血寶馬、紫熹荷、冠神、紅玫瑰、荷之冠、出水芙蓉、大富貴、玉棠春、大元寶、鳳羽峽觀、奧迪牡丹、紅滿天、桃花、大鳳、紅河紅等24個品種聚為第1支（A1），包括8個大花蕙蘭品種和16個國蘭品種；紅酒之戀、金玉滿堂、日本櫻花、紅雙喜、紅酒、日本香蘭、一代天驕、春蘭麻殼素、肖梅、寬葉蓮瓣、如意素荷、領帶花、愛神、金光、福星、紅霞、繡球等17個品種聚為第2支（A2），包括11個大花蕙蘭品種和6個國蘭品種；616、夢境、蝶影、黃金歲月、英雄、光彩、楊貴妃、綠翡翠、寶晶、碧龍奇蓮、西蜀道光、太極圣梅、如意素、心心相印、大雪素、素牡丹、黃花素心等17個品種聚為第3支（B），包括8個大花蕙蘭品種和9個國蘭品種，說明部分大花蕙蘭和國蘭品種親緣關系較近。

2.3 大花蕙蘭倍性檢測結果

由圖4可知，由樣本的平均熒光強度確定材料的倍性，主峰表示相對核DNA含量， 因標樣主峰表示2C相對核DNA含量，且主峰峰值遠大于側峰的值，出現(xiàn)在92，則三倍體主峰在138，表示3C相對核DNA含量，四倍體主峰在184，表示4C相對核DNA含量。其中二倍體有616、桃花、紅雙喜、大鳳、日本櫻花、綠翡翠、夢境7個品種，三倍體有紅袍、火炬、紅酒之戀、繡球、天之驕子、紅酒、紅霞、楊貴妃、金玉滿堂、130、黃金歲月、蝶影、日本香蘭、福星、愛神、金光16個品種，四倍體有英雄、523、福娘、光彩4個品種。27個大花蕙蘭品種倍性的確定為雜交親本選育奠定了基礎。

3 討論與結論

蘭屬（Cymbidium）隸屬于蘭科（Orchidaceae）花卉植物，具有重要文化和觀賞價值，其包括附生蘭或地生蘭，罕有腐生蘭。蘭屬類群受外界的環(huán)境變化、生長時期，以及人工引種馴化、雜交等綜合因素的影響，每年都有大量的新品種產(chǎn)生，其中人工選育的大花蕙蘭目前已有上萬個新品種［26］。大花蕙蘭品種繁多，區(qū)分的標準也較多，可根據(jù)花色、花朵大小、花期早晚區(qū)分，根據(jù)花朵顏色來區(qū)分，可分為粉色類、綠色類、白色類和黃色類。多倍體植物具有花大色艷、根莖粗壯、葉厚而寬、抗性良好等特點［27］。大花蕙蘭品種多倍體有助于保護育種者權益，目前市場上受歡迎的大花蕙蘭品種以多倍體居多。因此，本研究基于SCAR分子標記和倍性鑒定開展蘭屬花卉的研究，擬為大花蕙蘭新品種選育提供科學指導。

目前，相關蘭屬花卉種間雜交報道較多。大花蕙蘭倍性復雜，在進行雜交育種時，一般不會選用三倍體的大花蕙蘭作為親本，因為三倍體的大花蕙蘭品種育性較差，用于雜交育種成功率極低［28］。陳和明等的研究表明，蝴蝶蘭與近緣屬雜交，雜交組合成功率不高，但可以成功，而與墨蘭（C. sinense）和碧玉蘭（C. Lowianum）等非蝴蝶蘭近緣屬雜交，則難以成功［29-30］。綜上，在進行雜交育種工作時，不僅需要確定父母本的倍性，而且雜交父母本之間親緣關系的遠近同樣是影響成功率的重要因素。如今，由于商業(yè)型的大花蕙蘭品種具有不同的倍性（二倍體、三倍體、四倍體、五倍體及六倍體）且三倍體居多，但將其用作母本進行雜交育種時成功率極低［31-32］。不同倍性的父母本在進行雜交時，若受精情況不良、合子胚發(fā)育不正常及正常胚極少等都會導致果實敗育。除此之外生殖隔離及不同倍性父母本雜交導致不能產(chǎn)生正常配子也會對雜交果實的結莢率產(chǎn)生很大影響［33］。前人研究發(fā)現(xiàn)，蘭科植物同一屬中不僅存在多種染色體基數(shù)的情況，而且時常伴隨著倍性的變化而發(fā)生改變［34-35］。

SCAR分子標記技術是一種單基因位點多態(tài)性標記技術。其原理是對基因作RAPD（隨機擴增多態(tài)性DNA）分析后，對目的DNA片段進行克隆和末端測序，根據(jù)目的基因前后兩端序列設計引物。再以此引物對目的DNA片段進行特異PCR擴增，可以鑒別與原RAPD片段相對應的單一位點［36］。目前SCAR分子標記技術已經(jīng)成功地運用在植物育種方面。張子君等在番茄抗病基因Ty-3的SCAR標記及檢測中表示SCAR分子標記是與抗病基因 Ty-3 緊密連鎖的共顯性標記，可用于番茄抗病基因Ty-3的鑒定與抗病材料的篩選［37］。李敏等利用SCAR分子鑒定標記中藥白術的篩選和克?。?8］。本研究供試的27個商業(yè)化大花蕙蘭，部分品種的形態(tài)特征上明顯表現(xiàn)出花朵有中小型花，部分有香味的特點，SCAR分子標記顯示27個品種分別與不同國蘭品種同處于一個數(shù)系圖分支，聚為3支。同時，大花蕙蘭是由多國選育的蘭屬中的不同花色、不同花型和不同冠幅大小等經(jīng)過1個多世紀的人工雜交、選育形成的雜種群，推測這些品種有國蘭血統(tǒng)，它們是經(jīng)過數(shù)代與國蘭雜交后形成的新品種［39］。

倍性圖的主峰表示相對核DNA含量，且主峰峰值遠大于側峰，其側峰相對核DNA含量的峰可能有3個來源，第一是細胞染色體復制時期的G2期細胞；第二是可能存在內(nèi)源多倍體；第三在樣品制備過程中沒有形成單細胞狀態(tài)，存在細胞粘連現(xiàn)象［40］。Arditti多年研究蘭科植物的雜交栽培種，并認為大部分蘭科植物應為四倍體［41］。但本研究發(fā)現(xiàn)，大花蕙蘭品種大多為三倍體，這與朱根發(fā)等的研究結果［42］是一致的。眾所周知，用三倍體大花蕙蘭品種作為母本進行雜交育種時成功率極低［43］。因此，建議在蘭屬花卉親本選配時，可將商業(yè)化價值高的三倍體大花蕙蘭作為父本，可能會獲得種子。

參考文獻：

［1］徐曉薇，柴明良，林紹生，等. 溫州市花卉產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及科技發(fā)展戰(zhàn)略［J］. 農(nóng)業(yè)網(wǎng)絡信息，2009（1）：130-133.

［2］李艷梅. 大眾花卉消費習慣與需求變化：2021—2022年花卉消費意向調(diào)查結果分析［J］. 中國花卉園藝，2022（1）：45-49.

［3］盧思聰. 中國蘭與洋蘭［M］. 北京：金盾出版社，1994：10-16.

［4］吳應祥. 中國蘭花［M］. 北京：中國林業(yè)出版社，1991：141.

［5］陳祖云，王曉麗，宋聚先. 貴州天麻遺傳多態(tài)性的ISSR初步分析［J］. 中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（7）：436-439.

［6］任 羽，尹俊梅，楊光穗. 海南石斛屬植物親緣關系的SRAP分析［J］. 熱帶作物學報，2008，29（6）：767-770.

［7］和志嬌，呂麗芬，楊麗云，等. 白芨種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析［J］. 西南農(nóng)業(yè)學報，2008，21（4）：1081-1085.

［8］蘇宇靜，姚文敏，陳兆貴. 利用ISSR分子標記鑒定蝴蝶蘭不同種資源的遺傳多樣性［J］. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2021（12）：62-67.

［9］沈竑哲，李春楠，傅巧娟，等. 大花蕙蘭種質(zhì)資源的簡單重復序列標記分析［J］. 浙江大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2022，48（1）：21-28.

［10］馬紅勃，賴鋆英，許旭明，等. 基于SRAP標記的大花蕙蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性分析［J］. 植物遺傳資源學報，2011，12（4）：551-556.

［11］魯 迪. 春劍和大花蕙蘭種間雜交種子無菌萌發(fā)及雜交后代的RAPD分析［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2010.

［12］Chen Z J，Ni Z F. Mechanisms of genomic rearrangements and gene expression changes in plant polyploids［J］. BioEssays，2006，28（3）：240-252.

［13］Gregory T R，Mable B K. Polyploidy in animals［M］//The evolution of the genome. Amsterdam：Elsevier，2005：427-517.

［14］Albertin W，Marullo P. Polyploidy in fungi：evolution after whole-genome duplication［J］. Proceedings of the Royal Society B，2012，279（1738）：2497-2509.

［15］張曉曼，周懷軍，張啟翔，等. 花卉多倍體育種研究［J］. 河北林果研究，2004，19（3）：288-294.

［16］張丞慧，李凱銘，趙 琪，等. 新疆野蘋果多倍體誘導及葉片特征分析［J］. 天津農(nóng)學院學報，2021，28（4）：6-10.

［17］馮亞言. 百合體細胞加倍種質(zhì)的獲得及其擴繁體系的建立［D］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2017.

［18］謝佩吾，李早文，伍愛萍，等. 17個雜交蘭及3個大花蕙蘭品種的染色體研究［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2015，42（8）：26-28.

［19］齊 丹，田路明，董星光，等. 梨多倍體種質(zhì)資源的鑒定［J］. 中國果樹，2023（6）：10-15.

［20］韓國輝. 基于EST-SSR、Genomic-SSR和SCoT標記的柑橘連鎖圖譜構建及雜種和多倍體遺傳分析［D］. 重慶：西南大學，2012.

［21］彭 琴，陳建國，蔡得田，等. 高結實率多倍體水稻雜種F2代分子標記的分離分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（11）：4437-4438.

［22］程少麗，李枝林，張俊祥，等. 利用RAPD技術分析云南蘭屬部分種的種間關系［J］. 云南植物研究，2006，28（6）：565-569.

［23］Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences［J］. Journal of Molecular Evolution，1980，16（2）：111-120.

［24］Nei M，Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics［M］. New York：Oxford University Press，2000.

［25］王玉英，李枝林. 快速鑒定蘭屬植物的方法：CN105112557B［P］. 2018-03-16.

［26］Wang Y T. Impact of salinity and media on growth and flowering of a hybrid Phalaenopsis orchid［J］. HortScience，1998，33（2）：247-250.

［27］劉仲健，陳心啟，茹正忠. 中國蘭屬植物［M］. 北京：科學出版社，2006：10-280.

［28］劉玉珊. 大花蕙蘭雜交育種及其后代的表現(xiàn)［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2015.

［29］陳和明，呂復兵，李 佐，等. 蝴蝶蘭屬間雜交育種研究進展［J］. 中國農(nóng)業(yè)大學學報，2022，27（9）：125-135.

［30］李枝林，王玉英，王卜瓊，等. 蘭花遠緣雜交育種技術研究［J］. 中國野生植物資源，2007，26（4）：52-56.

［31］李玉萍，羅鳳霞，薛婷婷. 蘭屬植物種間雜交育種探討［J］. 金陵科技學院學報，2017，33（4）：80-83.

［32］陳心啟，吉占和.中國蘭花全書［M］. 2版. 北京：中國林業(yè)出版社，2003.

［33］楊小丹，李枝林，王 京，等. 花粉活力與柱頭可授性對蘭花雜交結莢率的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（10）：166-172.

［34］Goldblatt P.Polyploidy in angiosperms：monocotyledons［M］//Lewis W H. Polyploidy：biological relevance. New York：Springer，1980：219-239.

［35］Ehrendorfer F.Polyploidy and distribution［M］//Lewis W H. Polyploidy：biological relevance. New York：Springer，1980：45-60.

［36］劉 廣，黃曉云，徐錦華，等. 西瓜枯萎病抗性分子標記篩選與應用［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2022，50（18）：279-283.

［37］張子君，劉文奇，李海濤，等. 番茄抗病基因Ty-3的SCAR標記及檢測［J］. 園藝與種苗，2014，34（4）：26-28.

［38］李 敏，陳 強，茅學群. 中藥白術SCAR分子鑒定標記的篩選和克?。跩］. 浙江工業(yè)大學學報，2015，43（2）：148-153.

［39］盧思聰，石 雷. 大花蕙蘭［M］." 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：15-18.

［40］柳青慕，王赟文，王小山. 流式細胞儀快速檢測鴨茅與多花黑麥草染色體倍性的研究［J］. 草業(yè)科學，2012，29（3）：403-410.

［41］Arditti J. Fundamentals of orchid biology［M］. New York：Wiley，1992.

［42］朱根發(fā)，王碧青，陳明莉，等. 大花蕙蘭與蘭屬植物種間雜交研究［J］. 植物學通報，2005，40（4）：445-448.

［43］Cruden R W. Pollen-ovule ratios：a conservative indicator of breeding systems in flowering plants［J］. Evolution，1977，31（1）：32-46.