AU富集元件結(jié)合因子1（AUF1）在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后評估價(jià)值

通信作者：陳香梅，xm_chen6176@bjmu.edu.cn（ORCID：0000-0003-0302-6866）；王競州，neil_wjz@163.com（ORCID：0000-0002-7490-8076）

摘要：目的探究AU富集元件RNA結(jié)合蛋白1（AUF1）對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力的影響及可能機(jī)制，闡明AUF1在肝細(xì)胞癌（HCC）進(jìn)展中發(fā)揮的作用及分子機(jī)制。方法利用UALCAN和TCGA-HCC數(shù)據(jù)庫分析AUF1在泛癌中的表達(dá)以及AUF1表達(dá)水平與HCC患者臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的相關(guān)性；利用CCK-8、細(xì)胞凋亡、Transwell小室遷移等實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平探究AUF1的功能；利用RNA-seq分析AUF1敲減后肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)評估生存率差異。結(jié)果相較于正常組織，AUF1的mRNA和蛋白水平在多種腫瘤組織中呈異常表達(dá)（P值均lt;0.05）。AUF1的mRNA水平與HCC惡性程度以及早期肝癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)（P值均lt;0.05）。與對照組相比，過表達(dá)外源AUF1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、抑制肝癌細(xì)胞的凋亡及遷移。而AUF1敲減則抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡及遷移。RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，AUF1敲減主要影響Wnt/β-cateinin通路，并下調(diào)β-catenin蛋白水平。結(jié)論AUF1的異常表達(dá)與早期肝癌的預(yù)后有關(guān)，AUF1的促癌作用可能與其激活Wnt信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：癌，肝細(xì)胞；核不均一核糖核蛋白D；Wnt信號通路

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81572366）；石河子大學(xué)青年創(chuàng)新培育人才項(xiàng)目（CXPY202311）

Expression of AU-rich element RNA-binding factor 1 in hepatocellular carcinoma and its value in prognosticevaluation

DUAN Yuan1，ZHANG Ting2，ZHANG Jing3，GUAN Guiwen2，WANG Jingzhou1，CHEN Xiangmei1，2.（1.Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003，China；2.Department of Medical Microbiology and Parasitology，School of Basic Medical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China；3.Department of Laboratory Medicine，Beijing Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China）

Corresponding authors：CHEN Xiangmei，xm_chen6176@bjmu.edu.cn（ORCID：0000-0003-0302-6866）；WANG Jingzhou，neil_wjz@163.com（ORCID：0000-0002-7490-8076）

Abstract：Objective To investigate the effect of AU-rich element RNA-binding factor 1（AUF1）on the proliferation，apoptosis，and migration abilities of hepatocellular carcinoma（HCC）cells and possible mechanisms，and to clarify the role and molecular mechanism of AUF1 in the progression of HCC.Methods The UALCAN and TCGA-HCC databases were used to analyze the expression of AUF1 in pan-cancer and investigate the association of the expression level of AUF1 with the clinicopathological features and prognosis of HCC patients.CCK-8 assay，cell apoptosis assay，and Transwell chamber assay were used to investigate the function of AUF1 at the cellular level，and RNA-seq assay was used to investigate transcriptome changes in HCC cells after AUF1 knockdown.The t-test was used for comparison of continuous data between two groups；the Kaplan-Meier method was used toplot survival curves，and the log-rank test was used for comparison of survival rates.Results There were abnormal mRNA and protein expression levels of AUF1 in various tumor tissues compared with normal tissue（Plt;0.05）.The mRNA expression level of AUF1 was positively correlated with the degree of HCC malignancy and the poor prognosis of early-stage HCC（Plt;0.05）.Compared with the control group，the overexpression of exogenous AUF1 in HCC cells promoted the proliferation of HCC cells and inhibited the apoptosis and migration of HCC cells，while AUF1 knockdown inhibited HCC cell proliferation and promoted the apoptosis and migration of HCC cells.The RNA-seq analysis showed that AUF1 knockdown mainly affected the Wnt/β-catenin pathway and downregulated the protein expression level ofβ-catenin.Conclusion The abnormal expression of AUF1 is associated with the prognosis of early-stage HCC，and AUF1 may exert an oncogenic effect by activating the Wnt signaling pathway.

Key words：Carcinoma，Hepatocellular；Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein D；Wnt Signaling Pathway

Research funding：National Natural Science Foundation of China（General Program）（81572366）；Youth Innovation and Talent Cultivation Project of Shihezi University（CXPY202311）

原發(fā)性肝癌是目前全球第六大常見癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大常見原因［1］，其中肝細(xì)胞癌（HCC）占75%～85%。由于HCC發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，高達(dá)80%的HCC患者在首次診斷時(shí)已處于中晚期，5年生存率不足15%［2］。因此，亟需探明HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為HCC早期診斷和精準(zhǔn)治療提供靶點(diǎn)。AU富集元件結(jié)合因子1（AU-rich element RNA-binding factor 1，AUF1）是真核細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子［3］。AUF1通過與mRNA的AU元件富集區(qū)結(jié)合，調(diào)控多種mRNA的穩(wěn)定性及翻譯，其異常表達(dá)與炎癥、衰老、發(fā)育異常和心血管疾病等密切相關(guān)［4-6］。AUF1也是一種潛在的致癌因子，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［7-8］，但AUF1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究利用UALCAN和TCGA-HCC數(shù)據(jù)庫分析AUF1在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤組織中的表達(dá)以及AUF1表達(dá)與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，并分析AUF1對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力的影響及可能機(jī)制，以期為闡明AUF1在HCC進(jìn)展中發(fā)揮的作用及分子機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑siAUF1和對照siNC購自廣州銳博生物；pCDH-AUF1及對照質(zhì)粒（pCDH）為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent、LipofectamineTM 2000試劑購自美國Invitrogen公司；鼠抗E-cadherin購自美國BD transduction laboratories公司；鼠抗N-cadherin購自美國Santa Cruz公司；兔抗AUF1抗體和兔抗β-cateinin購自英國Abcam公司；鼠抗人β-tubulin抗體和蛋白定量試劑購自北京普利萊公司；兔抗β-actin購自美國CST公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.2肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，Huh7和Huh1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。使用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)約80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取生長至對數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3生物信息學(xué)分析采用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析AUF1在泛癌中的表達(dá)［9-10］；采用TCGA-HCC數(shù)據(jù)庫分析AUF1表達(dá)與HCC患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染前24 h進(jìn)行細(xì)胞傳代并計(jì)數(shù)，按照3.5×105個(gè)/孔將細(xì)胞接種于6孔板中。按照Lipo fectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent的說明書，將siAUF1或?qū)φ誷iNC轉(zhuǎn)染至HepG2、Huh7或Huh1細(xì)胞中。pCDH-AUF1和對照質(zhì)粒按照LipofectamineTM 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4～6 h后，更換為新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.5 Western Blot檢測收集細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，使用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，4℃孵育一抗過夜。室溫孵育二抗1 h。用美國LI-COR公司Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)采集圖像，使用β-tubulin或β-actin作為內(nèi)參。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)在96孔板上以8×103細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0、1、2、3、4、5天在每孔加入含有10μL CCK-8的100μL培養(yǎng)基，37℃孵育1 h。在450 nm波長下測量吸光度，根據(jù)吸光度繪制生長曲線。

1.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)取得轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞懸液，PBS清洗去除血清，再用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將其均勻加入小室中（5×103/200μL）。在24孔板中加入600μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，鑷子夾取小室平穩(wěn)放入其中，培養(yǎng)36 h。PBS清洗小室及24孔板，經(jīng)固定、染色后，去除小室中殘留的水分及未穿過小室聚碳酸酯膜的細(xì)胞。風(fēng)干，顯微鏡下拍照。

1.8細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將4×105個(gè)細(xì)胞/孔置于6孔板中培養(yǎng)48 h，消化離心后棄上清，使用PBS沖洗細(xì)胞沉淀2遍，加入300μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，室溫避光孵育15 min，并使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 RNA測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)分析本文數(shù)據(jù)下載自GEO數(shù)據(jù)庫GSE162706數(shù)據(jù)集［11］。Hisat2［12］和featureCounts［13］用于讀圖和基因計(jì)數(shù)計(jì)算。edgeR軟件［14］用于基因差異表達(dá)分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用FPKM（fragmenls per kilobasemillion）法對TCCA轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最終納入預(yù)后分析的HCC樣本來自于370例不同病因的HCC患者。使用R語言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier繪圖儀數(shù)據(jù)庫（http：//www.kmplot.com）評估肝癌患者AUF1表達(dá)與無復(fù)發(fā)生存率之間的關(guān)系，并使用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存率比較。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 AUF1在多種腫瘤組織中異常表達(dá)利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析AUF1在24種腫瘤和相對應(yīng)正常組織中的mRNA表達(dá)情況（圖1a）。與正常組織相比，AUF1 mRNA水平在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、結(jié)腸癌（COAD）、食管癌（ESCA）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞細(xì)胞瘤（GBM）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、HCC、肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）、胃癌（STAD）中高表達(dá)（P值均lt;0.05），但在腎嫌色細(xì)胞癌（KICH）和甲狀腺癌（THCA）中則呈低表達(dá)（P值均lt;0.05）。除此之外，本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析AUF1蛋白在10種腫瘤組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，AUF1蛋白在9種腫瘤組織中表達(dá)升高（圖1b），包括BRCA、COAD、卵巢癌（OV）、腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）、子宮內(nèi)膜樣癌（UCEC）、肺癌（LUNG）、HNSC、GBM、HCC（P值均lt;0.05），而在胰腺癌（PAAD）中AUF1蛋白水平降低（P值均lt;0.05）。綜上結(jié)果顯示，AUF1的mRNA和蛋白水平在HCC、BRCA、COAD、GBM、HNSC中均顯著上調(diào)，提示AUF1可能在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用。

2.2 AUF1高表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)為進(jìn)一步探究AUF1與肝癌的關(guān)系，本研究分析TCGA-HCC數(shù)據(jù)庫中AUF1表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，AUF1與腫瘤惡性標(biāo)志物MKI67的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.552 2，Plt;0.000 1）（圖2a）。在不同肝癌Edmondson-Steiner分級中，AUF1 mRNA水平在3級腫瘤中的表達(dá)高于1級和2級（P值均lt;0.000 1）（圖2b）。在臨床不同TNM分期患者中，AUF1在TNM-Ⅲ期腫瘤組織中的表達(dá)水平高于TNM-Ⅰ（Plt;0.000 1）（圖2c）。但無論是Edmondson-Steiner分級還是TNM分期中，4級或TNM-Ⅳ期肝癌組織中AUF1的表達(dá)均未見升高。本研究進(jìn)一步根據(jù)TNM分期分別對AUF1表達(dá)水平在HCC中的預(yù)后能力進(jìn)行評估。Kaplan-Meier生存分析顯示，在早期（Ⅰ～Ⅱ期）肝癌中，AUF1高表達(dá)患者的半數(shù)生存期僅為30.1個(gè)月，顯著低于AUF1低表達(dá)患者的半數(shù)生存期55.87個(gè)月（P=0.048）（圖2d）。AUF1表達(dá)水平與中晚期肝癌（Ⅲ～Ⅳ期）的半數(shù)生存期無相關(guān)性（Pgt;0.05）。上述結(jié)果提示，AUF1的異常表達(dá)可能參與HCC的發(fā)生和發(fā)展，是早期肝癌診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

2.3 AUF1促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖為探究AUF1對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究在肝癌細(xì)胞系中分別敲減或過表達(dá)AUF1，并通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，與siNC對照組相比，轉(zhuǎn)染AUF1 siRNA后，HepG2和Huh1細(xì)胞中AUF1蛋白水平明顯降低（圖3a），且敲減AUF1后HepG2和Huh1細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組（圖3b）。與敲減結(jié)果一致，過表達(dá)AUF1的HepG2和Huh7（圖3c）細(xì)胞增殖能力明顯高于pCDH對照組（圖3d）。

2.4 AUF1抑制肝癌細(xì)胞的凋亡本研究進(jìn)一步使用Annexin V/PI雙染色法評價(jià)AUF1對肝癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與對照siNC組相比，敲減AUF1后HepG2細(xì)胞和Huh1細(xì)胞中Annexin V單陽性和Annexin V/PI雙陽性細(xì)胞比例明顯上調(diào)，表明細(xì)胞的早期和晚期凋亡率增加（圖4a）。而在過表達(dá)AUF1的HepG2和Huh7細(xì)胞中，細(xì)胞的早期和晚期凋亡率較pCDH對照組則顯著降低（圖4b）。

2.5 AUF1抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力本研究隨后檢測AUF1對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照siNC組相比，AUF1敲減可增強(qiáng)HepG2和Huh1細(xì)胞的遷移能力（圖5a）。Western Blot檢測結(jié)果顯示，AUF1敲減后E-cadherin水平降低、N-cadherin水平升高（圖5b）。與此結(jié)果一致，過表達(dá)AUF1后Huh7細(xì)胞的遷移能力較對照質(zhì)粒pCDH組降低（圖5c），細(xì)胞內(nèi)的E-cadherin蛋白水平升高、N-cadherin蛋白水平降低（圖5d）。2.6 AUF1通過激活Wnt信號通路發(fā)揮促癌作用為探究AUF1促癌的潛在機(jī)制，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析AUF1敲減對HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響。利用cuffdiff分析模塊進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，并根據(jù)差異倍數(shù)和P值進(jìn)行篩選，共獲得467個(gè)差異基因。其中162個(gè)基因在AUF1敲減后表達(dá)上調(diào)，305個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)（圖6a）。進(jìn)一步對這些AUF1相關(guān)差異基因進(jìn)行KEGG pathway分析，如結(jié)果所示，主要富集在Wnt信號通路、細(xì)胞黏附因子、5-羥色氨酸突觸、花生四烯酸代謝等多種通路上，其中Wnt信號通路富集到的差異基因數(shù)排在前列（圖6b）。

β-catenin蛋白上調(diào)是Wnt通路活化的重要標(biāo)志。本研究進(jìn)一步通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平。結(jié)果顯示，敲減AUF1后HepG2中的β-catenin蛋白下調(diào)。而過表達(dá)AUF1后β-catenin蛋白上調(diào)（圖6c）。上述結(jié)果提示AUF1可以通過上調(diào)β-catenin激活肝癌細(xì)胞中的Wnt信號通路。

3討論

AUF1的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但多數(shù)相關(guān)研究均基于RNA水平檢測，缺少AUF1蛋白水平檢測。本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)分析了泛癌轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中AUF1 mRNA和蛋白在多種腫瘤中的表達(dá)情況。本研究發(fā)現(xiàn)，與AUF1 mRNA水平一致，AUF1蛋白水平在多種腫瘤組織中亦呈高表達(dá)，提示其在這些腫瘤中發(fā)揮促癌作用。但在PAAD中，AUF1的mRNA或蛋白水平均降低，提示AUF1的異常表達(dá)與不同腫瘤類型有關(guān)。

前期通過檢測配對的HBV肝癌組織與癌旁組織發(fā)現(xiàn)，AUF1在肝癌組織中高表達(dá)，并與患者的預(yù)后不良有關(guān)［15］。本研究利用TCGA-HCC數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步證實(shí)AUF1在肝癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與MKI67、Edmondson-Steiner分級、TNM分期等多項(xiàng)腫瘤惡性病理學(xué)指標(biāo)正相關(guān)。更為重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)AUF1表達(dá)水平隨著肝癌分期逐步上調(diào)，但在晚期（Ⅳ期）不再繼續(xù)升高。生存分析結(jié)果也顯示AUF1對肝癌早期（Ⅰ～Ⅱ期）更有預(yù)后價(jià)值。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)AUF1能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、抑制肝癌細(xì)胞凋亡和遷移。有報(bào)道［16］AKR1B10、c-Myc等癌基因在肝癌早期發(fā)揮促癌作用，且具有抑制細(xì)胞遷移的能力。因此，筆者推測AUF1異常表達(dá)可能與肝癌的早期進(jìn)展有關(guān)，是肝癌早期診斷和預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

Wnt/β-catenin通路是一種高度保守且嚴(yán)格控制的信號通路，可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化。越來越多證據(jù)表明Wnt信號通路的異常激活促進(jìn)肝癌增殖［17］。據(jù)報(bào)道［18］，在約49%的HCC病例中可檢測到β-catenin的活化。β-catenin已經(jīng)被公認(rèn)為原發(fā)性肝癌中最常見的突變基因之一。本研究在HepG2細(xì)胞系中敲減AUF1后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，將差異基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因功能富集最顯著的是Wnt信號通路，并進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明AUF1激活Wnt通路。本研究發(fā)現(xiàn)AUF1敲減后差異基因富集在Wnt通路，Western Blot檢測也證實(shí)AUF1能夠上調(diào)β-catenin蛋白水平，提示AUF1通過激活Wnt/β-catenin通路發(fā)揮促癌作用。但AUF1激活Wnt通路的具體機(jī)制目前尚未明確。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，AUF1也可以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控AKR1B10、AFP表達(dá)。有文獻(xiàn)［19］報(bào)道AKR1B10在乳腺癌中高表達(dá)，并通過激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。但在肝細(xì)胞癌中，AUF1是否也可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控AKR1B10表達(dá)進(jìn)而激活Wnt/β-catenin通路，尚需更多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)AUF1在多種腫瘤組織中呈異常表達(dá)；AUF1在肝癌組織中的表達(dá)水平與肝癌惡性程度以及早期肝癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)；AUF1具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、抑制肝癌細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移的作用，可能與其激活Wnt信號通路有關(guān)。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：段愿、張婷、張婧、關(guān)貴文、陳香梅等負(fù)責(zé)提出研究選題，設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，采集整理數(shù)據(jù)；段愿、張婷等負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)論文框架，起草論文，修訂論文，終審論文；陳香梅、王競州等負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分析，獲取研究經(jīng)費(fèi)，技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)性支持。

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收稿日期：2024-01-24；錄用日期：2024-03-25

本文編輯：邢翔宇

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