【摘要】目的" 探討過表達miR-486-5p小鼠骨髓間充質干細胞(BMSC)來源外泌體(Exo)對缺氧損傷心肌細胞的影響及機制。方法" 通過慢病毒轉染來構建過表達miR-486-5p的小鼠BMSC。提取轉染成功的BMSC所分泌的Exo,包括空載體BMSC分泌的Exo(Exo-NC)、miR-486-5p過表達BMSC分泌的Exo(Exo-miR-486)及未處理BMSC分泌的Exo(Exo-Control)。取12~18 d胎鼠原代心肌細胞,將其分為常氧培養(yǎng)組(Normoxia組)、缺氧培養(yǎng)組(Hypoxia組)、Hypoxia+Exo-NC組及Hypoxia+Exo-miR-486組,并給予不同時間的缺氧處理來模擬心肌細胞缺氧狀態(tài),檢測細胞增殖狀態(tài)、凋亡率,以及活性氧(ROS)、核苷酸結合結構域富含亮氨酸重復序列和含熱蛋白結構域受體3(NLRP3)和裂解的胱天蛋白酶-1(cleaved caspase-1)的表達水平。結果" Hypoxia組心肌細胞增殖能力低于Normoxia組,而凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平均高于Normoxia組(P<0.05);Hypoxia+Exo-NC組心肌細胞增殖能力高于Hypoxia組,凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平低于Hypoxia組(P<0.05);Hypoxia+Exo-miR-486組心肌細胞增殖能力高于Hypoxia+Exo-NC組,凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1表達水平低于Hypoxia+Exo-NC組(P<0.05)。結論" 來自miR-486-5p過表達BMSC的Exo能減少缺氧導致的ROS的產生及其引起的心肌細胞凋亡,并改善缺氧引起的心肌細胞增殖緩慢的問題。
【關鍵詞】骨髓間充質干細胞;外泌體;心肌缺氧;miR-486-5p;凋亡
基金項目:國家自然科學基金(81970312)
通信作者:安松濤,E-mail:ansongtao2010@zzu.edu.cn
【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.09.019
Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Overexpressing miR-486-5p Protect Hypoxic-Injured Cardiomyocytes via Exosomes
YAO Siyu1,ZHANG Tingting2,AN Songtao1
(1.Central China Fuwai Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,Henan,China; 2.Center for Clinical Single-Cell Biomedicine,Henan Provincial People’s Hospital,Zhengzhou 450003,Henan,China)
【Abstract】Objective" To investigate the effects and mechanisms of exosomes (Exo) derived from bone marrow mesenchymal stem cell(BMSC) in mice overexpressing miR-486-5p on hypoxic-injured cardiomyocytes.Methods" Mouse BMSC overexpressing miR-486-5p was constructed by lentivirus transfection.Exo secreted by successfully transfected BMSC were extracted,including Exo secreted by empty carrier BMSC(Exo-NC),Exo secreted by BMSC overexpressing miR-486-5p (Exo-miR-486),and Exo secreted by untreated BMSC(Exo-Control).Primary cardiomyocytes from 12~18 d fetal rats were divided into normal oxygen culture group(Normoxia group),hypoxia culture group(Hypoxia group),Hypoxia+Exo-NC group and Hypoxia+Exo-miR-486 group,and were given hypoxia treatments for different times to stimulate the hypoxic state of cardiomyocytes.Cell proliferation,apoptosis rate,and the expression levels of reactive oxygen species(ROS),
nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing receptor 3(NLRP3),and cleaved caspase-1 were examined.Results" The proliferation of cardiomyocytes in Hypoxia group was lower than that in Normoxia group,while the apoptosis rate and the expression levels of ROS,NLRP3 and cleaved caspase-1 in Hypoxia group were higher than those in Normoxia group(P<0.05);Myocardial cell proliferation capacity in Hypoxia+Exo-NC group was higher than that in Hypoxia group,the apoptosis rate and the expression levels of ROS,NLRP3 and cleaved caspase-1 were lower than those in Hypoxia group(P<0.05);The proliferation ability of myocardial cells in Hypoxia+Exo-miR-486 group was higher than that in Hypoxia+Exo-NC group,and the apoptosis rate and the expression levels of ROS,NLRP3 and cleaved caspase-1 were lower than those in Hypoxia+Exo-NC group(P<0.05).Conclusion" Exo from BMSC overexpressing with miR-486-5p can reduce hypoxic-induced ROS production and apoptosis of cardiomyocytes,and ameliorate hypoxic-induced slow proliferation of cardiomyocytes.
【Keywords】Bone marrow mesenchymal stem cell;Exosome;Myocardial hypoxia;miR-486-5p;Apoptosis
冠狀動脈性心臟病作為全球范圍內高發(fā)病率和高死亡率的主要疾病之一,迫切需創(chuàng)新的缺血后修復和再生的治療藥物。近年來,骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)迅速成為一種廣泛應用的實驗模型,以BMSC為基礎的治療正在成為一種修復缺血性心肌損傷的新方法[1]。盡管基于BMSC的研究已取得了一些進展,但該治療方法尚無法使心臟功能完全恢復到正常水平[2]。因此,進一步尋求提高BMSC治療效果的手段十分必要。BMSC參與缺血性心臟修復的部分機制可能是旁分泌效應。最近的研究[3]表明,BMSC可通過分泌外泌體(exosome,Exo)在體內和體外對心肌細胞產生抗凋亡作用,保護缺血缺氧誘發(fā)的心臟損傷。其中,微小RNA(microRNA,miRNA)在心肌缺血性損傷中扮演著重要的調控作用[4-8]。miR-486-5p是一種顯著富集于BMSC-Exo中的miRNA分子,可通過靶向調控血管生成、細胞的凋亡及炎癥反應,從而對心血管疾病發(fā)揮著重要調控作用[9]。然而,來自BMSC-Exo的miR-486-5p對心肌細胞的調控作用尚不清楚。因此,本研究構建了miR-486-5p慢病毒過表達載體轉染BMSC,收集其分泌的Exo并與缺氧損傷的原代心肌細胞共培養(yǎng),以探討miR-486-5p聯合BMSC對缺血性心臟病的治療作用。
1" 材料與方法
1.1" 材料與試劑
miR-486-5p過表達慢病毒及其空載慢病毒均購自吉凱基因生物公司,miRNA引物由上海生工生物工程公司合成。主要實驗試劑和設備包括:TRIzol試劑盒(諾唯贊Q111-02/03)、CCK-8試劑盒(碧云天C0037)、細胞凋亡試劑盒(索萊寶CA1030-20T)、胎牛血清(Gibco 12484028)、胰蛋白酶(索萊寶T1350)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶PC0020-50T)、BMSC培養(yǎng)基(STEM CELL Technologies 05514)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco A4192001)、互補DNA(complementary DNA,cDNA)合成試劑盒(諾唯贊R312-01/02)、無血清培養(yǎng)基(中喬新舟ZQ-1320)、β-actin一抗(碧云天 AF5003)、核苷酸結合結構域富含亮氨酸重復序列和含熱蛋白結構域受體3(nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing receptor 3,NLRP3)一抗(碧云天 AF2155)、裂解的胱天蛋白酶-1(cleaved caspase-1)一抗(碧云天 AF1681),以及熒光顯微鏡(Olympus)。
1.2" 實驗動物
選取8周齡無特定病原體級成年雄性C57BL/6J小鼠10只,雌性C57BL/6J孕鼠(孕12~18 d)3只,體重(20±3)g。小鼠均購于北京維通利華實驗動物中心,分籠飼養(yǎng)于鄭州大學實驗動物中心,并經鄭州大學動物倫理委員會審批通過(ZZU-LAC20200828[06])。
1.3" BMSC的分離培養(yǎng)與鑒定
無菌條件下脫頸處死小鼠,分離后肢皮膚肌肉,取出股骨。剔除股骨附著肌肉及筋膜,剪去兩端干骺端,開放骨髓腔。200 μL槍頭剪短后置于1.5 mL的EP管內,股骨放入槍頭內,800×g離心5 min,得骨髓細胞沉淀。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞沉淀,合適濃度種入六孔板內,放入培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。細胞融合至80%以上進行傳代,傳代3次后的細胞用作轉染實驗。流式細胞術檢測第3代BMSC細胞表面標志物(CD29、CD44、CD105和Sca-1)的表達。而后參照已發(fā)表的研究方法[10],完成小鼠BMSC成脂、成骨和成軟骨三系分化的檢測。
1.4" 慢病毒載體的構建
將構建成功的miR-486-5p基因插入慢病毒包裹質粒GV492中,元件順序為Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,克隆位點為BamHI/Agel,對照編號為CON335,病毒保存于-80 ℃冰箱。
1.5" 慢病毒轉染BMSC
取生長狀態(tài)良好的BMSC進行慢病毒轉染。細胞分為未轉染慢病毒的空白對照組(Control組)、轉染慢病毒空載體組(NC組)和轉染過表達miR-486-5p的慢病毒組(miR-486-5p組)。在慢病毒轉染BMSC 16 h后,更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),至72 h后,熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。轉染成功后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達的細胞株。
1.6" Exo分離鑒定
對穩(wěn)定表達細胞株進行擴大培養(yǎng),待細胞密度達80%以上時,更換為無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后搜集上清液用于Exo分離。采用常規(guī)超高速離心法分離Exo:首先2 000×g 10 min離心2次去除死細胞和細胞碎片,然后10 000×g離心10 min去除細胞器,100 000×g 離心60 min得到Exo。根據不同的細胞來源,Exo分為空載體BMSC分泌的Exo(Exo-NC)、miR-486-5p過表達BMSC分泌的Exo(Exo-miR-486)及未處理BMSC分泌的Exo(Exo-Control)。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定Exo蛋白濃度,透射電鏡來觀察Exo的形態(tài),納米顆粒跟蹤分析技術檢測Exo粒徑。
1.7" 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測Exo中miR-486-5p的表達水平
使用TRIzol試劑并按照說明書提取各組BMSC所釋放Exo的總RNA,并將總RNA逆轉錄為cDNA,并以cDNA為模版進行實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應擴增。以U6作為內參,通過相對標準曲線法(2-ΔΔCt)來計算相對表達量。引物序列miR-486-5p正向引物5’-GCGCGCCGACGAGCGC-3’,反向引物5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’,U6正向引物5’- CT CGCTTGGCACA-3’,反向引物5’-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3’。
1.8" 心肌細胞分離與培養(yǎng)
從妊娠12~18 d C57BL/6J小鼠胚胎中取20~30顆胎鼠心臟,并用0.06%胰蛋白酶進行消化,加入相同體積培養(yǎng)基終止消化。消化后心臟勻漿通過100 μm的細胞濾網進行過濾。將過濾所得的液體放入離心機中,1 000 r/min離心5 min,離心完成后用DMEM培養(yǎng)基進行重懸,接種于細胞培養(yǎng)皿內,放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。30 min后成纖維細胞貼壁生長,而心肌細胞不貼壁,吸出尚未貼壁細胞懸液并重新鋪板。將合適濃度心肌細胞接種入24孔板中,處理組使用含有400 μg/mL Exo的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),24 h后細胞貼壁密度達到60%,置于缺氧小室內通氣(95%N2+5%CO2)。
1.9" 心肌細胞實驗分組
對不同處理心肌細胞進行分組,包括常氧培養(yǎng)組(Normoxia組)、缺氧培養(yǎng)組(Hypoxia組)、缺氧+空載體BMSC分泌的Exo組(Hypoxia+Exo-NC組)及缺氧+miR-486-5p過表達BMSC分泌的Exo組(Hypoxia+Exo-miR-486組)。
1.10" CCK-8與Ki67染色檢測細胞增殖
將2×103個/孔接種在96孔板的心肌細胞分組后培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,分別在不同時間點(0、24、48和72 h)向不同組別的心肌細胞中加入100 μL CCK-8溶液處理2 h,并使用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度。將培養(yǎng)至合適密度的心肌細胞用4%多聚甲醛進行固定,1%Triton X-100行細胞膜滲透,1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌3次,每次5 min,用含5%的牛血清白蛋白溶液室溫下封閉30 min,Ki67抗體孵育,4 ℃過夜。PBS洗滌以除去未結合抗體。加入免疫熒光二抗,37 ℃孵育2 h,PBS沖洗,細胞核染色劑進行核染色,最后熒光顯微鏡進行觀察。
1.11" 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡
取不同組別的心肌細胞用胰酶消化處理后,收集細胞沉淀并用PBS洗滌,190 μL細胞懸液中加入5 μL 異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V,在異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V結合緩沖液中重懸,細胞懸液中加入5 μL碘化丙啶溶液。將細胞在室溫下避光孵育15 min,然后使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。
1.12" 活性氧檢測
使用無血清培養(yǎng)基稀釋2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯 (2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA),使最終濃度為10 μmol/L。將稀釋好的DCFH-DA加入培養(yǎng)皿中,37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育30 min。孵育完成后PBS進行洗滌,然后用細胞核染色劑染色細胞核,熒光顯微鏡進行觀察。
1.13" 蛋白表達量的檢測
取各組心肌細胞,使用組織蛋白裂解液進行細胞裂解,并提取細胞總蛋白,用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳使不同分子量的蛋白質分離。分離完成后進行轉膜,脫脂奶粉封閉、而后進行β-actin、NLRP3和cleaved caspase-1一抗4 ℃孵育過夜。一抗孵育完成,二抗孵育1 h。最后使用凝膠成像系統進行拍照,對蛋白質表達水平進行定量分析。
1.14" 統計學方法
所有數據采用SPSS 24.0統計軟件包進行統計學分析,均進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,各組間總的趨勢比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗法,以±s表示。P<0.05為差異有統計學意義。
2" 結果
2.1" BMSC的分離與鑒定
倒置顯微鏡觀察BMSC形態(tài)發(fā)現,BMSC貼壁生長,細胞大小均勻,呈魚群狀生長(圖1A)。流式細胞術檢測結果表明,幾乎所有的細胞均表達CD29、CD44、CD105和Sca-1,但幾乎沒有細胞表達CD34、CD45和CD11b(圖1B)。多向分化結果表明,BMSC具有成骨、成脂和成軟骨的分化能力(圖1C)。
2.2" miR-486-5p過表達慢病毒轉染效率驗證
與Control組相比,NC組和miR-486-5p組出現明顯綠色熒光,表明轉染成功(圖2)。
2.3" BMSC上清液Exo鑒定
從BMSC培養(yǎng)的上清液中分離Exo,并通過透射電鏡觀察到,Exo以圓形顆粒的形式均勻地分布于視野中,并呈雙層囊泡結構,見圖3A。納米顆粒跟蹤分析了Exo的直徑大小為50~100 nm,符合Exo特征,表明上清液Exo提取成功,見圖3B。通過實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應來驗證Exo內miR-486-5p表達情況,結果發(fā)現,與Exo-Control和Exo-NC組相比,Exo-miR-486-5p組中miR-486-5p表達顯著升高(P<0.05),表明miR-486-5p過表達模型構建成功,見圖3C。
2.4" miR-486-5p過表達促進缺氧處理后心肌細胞的增殖
與Normoxia組相比,缺氧24、48和72 h后,Hypoxia組心肌細胞增殖活性均顯著下降(P<0.05);與Hypoxia+Exo-NC組相比,缺氧24、48和72 h后,Hypoxia+Exo-miR-486組心肌細胞增殖活性均明顯升高(P<0.05),見表1。通過對缺氧24 h心肌細胞進行Ki67熒光染色同樣驗證了與其他組相比,過表達miRNA-486-5p的BMSC所分泌的Exo能更有效地促進缺氧狀態(tài)下心肌細胞的增殖(P<0.05),見表2。
2.5" miR-486-5p過表達減少缺氧處理后心肌細胞活性氧的產生及細胞的凋亡
與Normoxia組相比,Hypoxia組心肌細胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表達量及細胞的凋亡率顯著增加(P<0.05),而Exo可顯著減少細胞ROS的產生及細胞的凋亡,而與Hypoxia+Exo-NC組比較,Hypoxia+Exo-miR-486組效果更佳(Plt;0.05),見表2。
2.6" miR-486-5p過表達對缺氧心肌細胞中NLRP3/cleaved caspase-1通路的影響
與Normoxia組相比,Hypoxia組心肌細胞NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平顯著增高(P<0.05);與Hypoxia組相比,Hypoxia+Exo-NC組心肌細胞NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平降低(P<0.05);與Hypoxia+Exo-NC組比較,Hypoxia+Exo-miR-486組心肌細胞NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平降低(P<0.05)。見圖4。
3" 討論
冠狀動脈性心臟病是全球范圍內最常見的疾病之一,也是導致死亡的主要原因之一[11]。冠狀動脈供血不足會導致心肌缺氧,進而引發(fā)一系列的病理生理改變,最終可能導致心肌細胞死亡,嚴重影響心臟功能。目前,臨床上常用的治療手段包括藥物治療、冠狀動脈介入治療等。然而以上方案僅起到延緩心力衰竭的作用,并不能從根本上防治心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。因此,尋找一種更有效的治療方法來保護缺血心肌細胞、改善其不良預后具有重要的臨床意義。
BMSC是一種起源于骨髓的成體干細胞,因其具有自我更新能力及多向分化的潛能,成為干細胞治療心肌損傷的最佳“種子細胞”。近年來的研究[12-14]表明,BMSC所釋放的Exo對多種疾病具有保護作用,包括缺氧缺血性腦病、腫瘤性疾病、順鉑誘導的耳毒性及慢性腎臟病的血管鈣化等。在冠狀動脈性心臟病中,BMSC-Exo在誘導心肌細胞增殖、增強毛細血管密度、抑制心肌纖維化等方面表現出色[15]。在Exo所包含的多種分子中,miRNA因其對體內的細胞生物學過程具有廣泛的調節(jié)作用而備受關注[16]。作為細胞通信的中介分子,Exo來源的miRNA可降低心肌缺血再灌注損傷程度,改善心力衰竭后的心臟功能,并調節(jié)心肌梗死后的炎癥反應,從而發(fā)揮其心臟保護作用[17]。
miR-486-5p被認為是在細胞存活中扮演重要角色的miRNA。研究[9]表明,含有miR-486-5p的Exo可促進小鼠心肌梗死后血管的形成。此外,miR-486-5p還可通過p53介導的Bcl-2相關線粒體凋亡通路來調控心肌細胞凋亡[18]。這一發(fā)現提供了miR-486-5p作為潛在心臟疾病治療靶點的新線索,也為深入研究miR-486-5p在心臟健康和疾病中的作用機制提供了重要的啟示。在本研究中,通過慢病毒轉染構建miR-486-5p過表達的BMSC,提取分泌的Exo來驗證缺氧條件下不同來源Exo對損傷心肌的修復作用。
在缺氧條件下,心肌細胞內能量代謝紊亂、線粒體功能受損、ATP合成減少,導致細胞增殖所需的能量供應不足。此外,缺氧會導致細胞核DNA損傷,影響細胞DNA合成和修復,細胞周期調控受阻,特別是在G1/S和G2/M期的轉變受到影響,從而影響細胞的增殖[19]。本研究同樣證實了在缺氧條件下,心肌細胞的增殖受到了顯著的抑制,而Exo的治療可顯著改善這一現象,尤其是Exo-miR-486效果更為顯著。
缺氧狀態(tài)下細胞內氧化應激反應增加,大量的自由基和氧化物質的堆積將顯著影響細胞正常功能,細胞內一系列信號通路會被激活,包括線粒體途徑、細胞凋亡受體途徑和內質網應激等。這些信號通路會引發(fā)一系列凋亡相關蛋白的表達和活化,并最終導致細胞凋亡與壞死[20]。其中,ROS已被確定為心臟疾病中重要的NLRP3炎性小體激活劑,ROS過量產生可在心臟毒性中通過NLRP3炎性小體引起大量心肌細胞凋亡[21-22]。本研究結果顯示,在缺氧條件下心肌細胞ROS水平增加,這與先前的研究[23]結果相一致。
NLRP3炎癥小體是由固有免疫受體蛋白NLRP3、銜接蛋白和炎癥蛋白酶cleaved caspase-1組成的胞質多蛋白復合體,能對微生物感染、內源性危險信號和環(huán)境刺激做出反應[24-25]。既往與NLRP3炎癥小體相關的研究主要集中在免疫反應,近年來,越來越多的證據發(fā)現NLRP3炎癥小體在心血管疾病中發(fā)揮關鍵作用[26]。研究[27-28]表明,NLRP3炎癥小體在心臟缺血再灌注損傷、心肌梗死和動脈粥樣硬化的病理過程中發(fā)揮重要作用。異丙酚可通過PPARγ/HMGB1/NLRP3軸抑制炎癥和凋亡,改善內毒素誘導的心肌細胞損傷[29]。糖原合成酶激酶-3β可介導NLRP3炎癥小體激活,導致大鼠心肌細胞和成纖維細胞發(fā)生凋亡[30]。這些研究都表明NLRP3/cleaved caspase-1通路在心肌細胞的凋亡中具有重要的作用。在本研究中,通過蛋白質印跡法檢測各組心肌細胞中NLRP3和cleaved caspase-1的表達量,流式細胞儀觀察心肌細胞的凋亡。結果表明,Exo-miR-486干預可顯著減少缺氧心肌細胞中NLRP3和cleaved caspase-1的表達,這與其可減少心肌細胞中的ROS相對應,并可能通過該途徑減少心肌細胞的凋亡。
綜上所述,過表達miR-486-5p的BMSC所釋放的Exo可促進心肌細胞的增殖,并抑制心肌細胞ROS的產生,其中NLRP3/cleaved caspase-1通路在心肌細胞生理和病理過程中起著重要調節(jié)作用。
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收稿日期:2024-01-15