養(yǎng)豬污水多級(jí)凈化系統(tǒng)底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

摘要：為探究養(yǎng)豬污水處理系統(tǒng)中多級(jí)凈化池底泥微生物群落結(jié)構(gòu)及其與底泥環(huán)境因子的相互作用，本研究構(gòu)建了污水生物處理多級(jí)凈化系統(tǒng)，即：狐尾藻（T1）、大薸（T2）、紅萍（T3）、泥鰍（T4）、紅金鯧（T5）、蓮藕（T6）等。經(jīng)6個(gè)月運(yùn)行之后，測(cè)定底泥理化因子指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，在所有凈化階段，底泥中變形菌門(mén)（Proteobacteria）始終占據(jù)主導(dǎo)地位；放線菌門(mén)（Actinobacteriota）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在初始處理階段（T1）較為豐富，而在后續(xù)處理池中大幅減少。藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）和脫硫菌門(mén)（Desulfobacterota）的相對(duì)豐度變化幅度較大。深入分析發(fā)現(xiàn)，有機(jī)質(zhì)和總磷是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子，其中有機(jī)質(zhì)含量與Syntrophales 目未分類(lèi)屬、Gaiellales 菌屬和Spirochaeta 菌屬的豐度呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性。此外，反硝化菌Candidatus Competibacter 在系統(tǒng)的氮循環(huán)中扮演著核心角色。因此，可通過(guò)篩選和利用這些特定功能菌進(jìn)行生物強(qiáng)化，提升污水處理系統(tǒng)的凈化效率。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)豬污水；凈化池；高通量測(cè)序；微生物群落；環(huán)境因子

中圖分類(lèi)號(hào)：X713 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024）11-2657-11 doi：10.11654/jaes.2024-0313

隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖場(chǎng)糞污年產(chǎn)生量超過(guò)38 億t，其中新鮮糞便6.4 億t，尿液5.7億t，污水26 億t[1]。對(duì)畜禽糞污進(jìn)行無(wú)害化與資源化處理已成為保障我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題，而相比于固體糞便，養(yǎng)殖廢水（尿液、沖洗污水及少量固體糞便）是養(yǎng)殖污染防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。養(yǎng)豬糞污的成分較為復(fù)雜，這些污水中含有較高濃度的氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有重金屬、抗生素等會(huì)造成環(huán)境及生態(tài)破壞的污染物，這些物質(zhì)若未經(jīng)妥善處理，可能引發(fā)水體富營(yíng)養(yǎng)化等嚴(yán)重的生態(tài)問(wèn)題[3]。

養(yǎng)殖糞污的處理方式主要分固體部分與液體部分，其中固體部分主要是無(wú)害化堆肥處理，而液體部分的處理主要是沼氣發(fā)酵后肥用，但是這種方式需要大量的農(nóng)田，而且受季節(jié)影響較為明顯，因此，廣大科技工作者尋找出利用植物進(jìn)行多級(jí)凈化的模式，取得較大的成功，但是，多級(jí)凈化后，會(huì)形成沉淀底泥，底泥是水體的重要組成部分，也是水體氮循環(huán)過(guò)程的重要場(chǎng)所，底泥中含有營(yíng)養(yǎng)鹽與污染物。底泥細(xì)菌是養(yǎng)殖池生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，在促進(jìn)池底有機(jī)物分解、減少有機(jī)物積累、保持良好水質(zhì)環(huán)境等方面具有重要作用。如氨氧化菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌和聚磷菌等在污水處理系統(tǒng)中扮演著氮磷元素轉(zhuǎn)化的核心角色[4]。如硝化螺旋菌屬（Nitrospira）是典型的亞硝酸鹽氧化菌，廣泛存在于污水處理系統(tǒng)中，對(duì)氮的去除起著關(guān)鍵作用[5]。如果底泥中的微生物群體平衡被破壞，就會(huì)發(fā)出惡臭，污染空氣，所以底泥中的微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性是多級(jí)生態(tài)處理效率和系統(tǒng)長(zhǎng)期運(yùn)行穩(wěn)定的關(guān)鍵因素[6]。

因此，深入研究養(yǎng)豬污水多級(jí)凈化系統(tǒng)中底泥水體的微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)于優(yōu)化處理工藝、提升處理效率和預(yù)防環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有重要的實(shí)際意義。已有研究揭示，活性污泥微生物群落具有較高的物種多樣性和豐富度[7]，但其結(jié)構(gòu)并非固定不變，而是受多種環(huán)境因素影響，如進(jìn)水質(zhì)量、成分、溫度、pH值、溶解氧水平和底物初始濃度等，這些因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生顯著影響[8-9]。本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)和16S rRNA 基因分析方法[10]，旨在深入分析養(yǎng)豬污水多級(jí)凈化池系統(tǒng)底泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因素的相互作用，以期為多級(jí)凈化系統(tǒng)的工藝優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)，從而有效提升養(yǎng)豬污水處理的效率和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 污水處理系統(tǒng)

試驗(yàn)地點(diǎn)位于福建省南平市延平區(qū)南山鎮(zhèn)，南山鎮(zhèn)屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫19.3 ℃，極端最低氣溫-3 ℃，極端最高氣溫36.2 ℃，無(wú)霜期年平均286d，年平均降水量1 660 mm。養(yǎng)豬場(chǎng)的污水處理系統(tǒng)主要通過(guò)厭氧沼氣發(fā)酵與好氧生化池對(duì)養(yǎng)豬污水進(jìn)行凈化處理，污水處理系統(tǒng)露天開(kāi)放，由沉淀池、一級(jí)生化池（T1，狐尾藻Myriophyllum verticillatum L.）、二級(jí)生化池（T2，大薸Pistia stratiotes L.）、三級(jí)凈化池（T3，紅萍Azolla pinnata）、四級(jí)凈化池（T4，泥鰍Mis?gurnus anguillicaudatus）、魚(yú)塘（T5，紅金鯧Pampus ar?genteus）、濕地（T6，藕Nelumbo nucifera Gaertn）等組成。曝氣處理后的沼液經(jīng)過(guò)狐尾藻、大薸、紅萍逐級(jí)凈化，紅萍用于淡水養(yǎng)殖，一級(jí)生化池培養(yǎng)狐尾藻，二級(jí)生化池培養(yǎng)大薸，三級(jí)生化池培養(yǎng)紅萍，而后達(dá)標(biāo)排放的水進(jìn)入魚(yú)塘，魚(yú)塘的水進(jìn)入濕地系統(tǒng)進(jìn)行蓮藕種植。每個(gè)生化池的占地面積約為100 m2，水深0.6ｍ，濕地規(guī)格100 m2，水深0.2 m，每個(gè)處理池中的水通過(guò)溢流進(jìn)入下一級(jí)處理池。

1.2 樣品采集

養(yǎng)豬污水于2022年4月1日首次進(jìn)入生化池，進(jìn)行多級(jí)凈化試驗(yàn)，分別于10月2日、11月2日、12月2日，3 次采集一級(jí)生化池（狐尾藻，T1）、二級(jí)生化池（大薸，T2）、三級(jí)凈化池（紅萍，T3）、四級(jí)凈化池（泥鰍，T4）、魚(yú)塘（紅金鯧，T5）、濕地（藕田，T6）的底泥。進(jìn)行細(xì)菌多樣性和酸堿度（pH）、有機(jī)質(zhì)（OM）、總氮（TN）、總磷（TP）、總鉀（TK）等的測(cè)定[11]。

1.3 DNA提取及高通量測(cè)序

1.3.1 DNA提取

取各級(jí)污水處理池底泥，快速加DNA保存液，用試劑盒（E.Z.N.A Soil DNA，OMEGA）提取樣品基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

菌群結(jié)構(gòu)PCR擴(kuò)增所用引物為338F_806R，即F端序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；R 端序列：GACTACHVGGGTWTCTAAT。為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性及可靠性，需滿(mǎn)足兩個(gè)條件：（1）盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增；（2）保證每個(gè)樣本擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)一致。隨機(jī)選取具有代表性的樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保在最低循環(huán)數(shù)中使絕大多數(shù)樣本能夠擴(kuò)增出合適濃度的產(chǎn)物。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart FastpfuDNA Polymerase；PCR 儀：ABI GeneAmp?，9700型。全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AX?YGEN 公司）切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris_HCl 洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3.3 熒光定量

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物用Quanti?Fluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.3.4 Illumina文庫(kù)構(gòu)建

按照以下4 個(gè)步驟構(gòu)建Illumina 文庫(kù)：（1）通過(guò)PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端；（2）使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物；（3）用Tris-HCl 緩沖液洗脫，再進(jìn)行2% 瓊脂糖電泳檢測(cè)；（4）用氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。所用試劑為T(mén)ruSeqTM DNA Sample Prep Kit。

1.3.5 Illumina測(cè)序

通過(guò)Illumina 測(cè)序獲取DNA 片段的序列。按照以下9個(gè)步驟進(jìn)行：（1）DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；（2）以DNA片段為模板，芯片上固定的堿基序列為引物進(jìn)行PCR 合成，在芯片上合成目標(biāo)待測(cè)DNA片段；（3）變性、退火后，芯片上DNA片段的另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋”；（4）PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA 簇；（5）DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；（6）加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；（7）用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類(lèi)；（8）將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；（9）統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Illumina測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析。利用美國(guó)國(guó)立生物信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI）將測(cè)序得到的相關(guān)OTUs 序列按97% 的序列相似度對(duì)有效序列進(jìn)行同源比對(duì)，并對(duì)操作分類(lèi)單元（OTUs）進(jìn)行聚類(lèi)，計(jì)算Shannon指數(shù)、Sobs指數(shù)及文庫(kù)覆蓋率（Coverage）。利用R語(yǔ)言Vegan包，Vegdist和Hclust進(jìn)行群落Heat?map圖、Bray-Curtis 距離計(jì)算和聚類(lèi)分析，提取相對(duì)豐度值最靠前的20 個(gè)屬種繪制Heatmap 圖，并進(jìn)行PCA分析。通過(guò)RDP classifier軟件將序列進(jìn)行物種分類(lèi)，選取門(mén)（phylum）、屬（genus）為分類(lèi)單位，統(tǒng)計(jì)各分類(lèi)單位對(duì)應(yīng)序列數(shù)量，繪制物種豐度圖。利用SPSS 18.0分析軟件進(jìn)行底泥理化指標(biāo)數(shù)據(jù)和α多樣性指數(shù)的方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各級(jí)處理池底泥環(huán)境條件和基本理化特性

對(duì)各級(jí)凈化池系統(tǒng)底泥樣品（T1～T6）的環(huán)境理化因子進(jìn)行檢測(cè)，包括pH、有機(jī)質(zhì)、總氮、總磷和總鉀（表1）。由表1可以看出，所有樣品的pH值為6.16～6.75，表明這些底泥呈微酸性到中性，且相互之間都無(wú)顯著性差異。從T1～T6底泥樣品的有機(jī)質(zhì)總體呈現(xiàn)從低到高的趨勢(shì)，即從T1的10.33 mg·kg-1到T6的27.13 mg·kg-1，并且初期（T1）、中期（T2、T3）、后期（T4、T5、T6）之間的差異達(dá)到了極顯著水平（Plt;0.01）。較高的有機(jī)質(zhì)濃度通常意味著更強(qiáng)的生物降解潛力，但也可能導(dǎo)致處理過(guò)程中的挑戰(zhàn)，如污泥產(chǎn)量增加?？偟呛饬克w中所有形態(tài)氮（包括有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮）的總和，其濃度與水體的富營(yíng)養(yǎng)化潛力密切相關(guān)。由表1 可知，總氮的濃度在0.51～1.11 mg·kg-1之間，其中樣品T1的總氮濃度最高，為1.11 mg·kg-1，而樣品T3 的總氮濃度最低，為0.51 mg·kg-1，與其他階段的差異達(dá)到了顯著水平（Plt;0.05）?？偭资呛饬克w中所有形態(tài)磷的總和，是水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵指標(biāo)之一，控磷對(duì)于防止水體污染至關(guān)重要。由表1可知，T1的總磷濃度1.87 mg·kg-1遠(yuǎn)高于后續(xù)各級(jí)的總磷濃度，差異達(dá)到了極顯著水平（Plt;0.01）。可見(jiàn)有2/3的磷固定在一級(jí)生化池（狐尾藻，T1）中?？傗浭呛饬克w中所有形態(tài)鉀的總和，鉀是植物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)素。由表1 可知，所有樣品的總鉀濃度在22.91～24.11 mg·kg-1之間，底泥中的總鉀濃度相對(duì)穩(wěn)定，表明底泥的鉀循環(huán)相對(duì)平衡。

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

由表2 可知，除T3 外，所有樣品Illumina 測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果表現(xiàn)序列的有效覆蓋率全部達(dá)到95％以上，測(cè)序條數(shù)達(dá)到20 000條以上（表2），表明測(cè)序數(shù)據(jù)合理，因此，該曲線能夠很好地反映微生物的組成狀態(tài)。基于95％的序列相似性，對(duì)篩選出來(lái)的細(xì)菌OTU序列結(jié)果進(jìn)行分析，得出相關(guān)α-多樣性指數(shù)（表2），對(duì)微生物群落多樣性和豐富度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，Chao 1 指數(shù)從大到小依次為T(mén)3gt;T5gt;T2gt;T6gt;T4gt;T1，T3最大為6 163，T1最小為4 153，T1與T3、T5、T2和T6 的Chao1 指數(shù)都具有顯著性差異（Plt;0.05）。Simpson指數(shù)可以定量描述區(qū)域的微生物多樣性，指數(shù)越小菌群多樣性越高；Shannon指數(shù)則是越大表示群落多樣性越高。從表2可見(jiàn)，T5的Simpson指數(shù)均顯著小于T1、T3、T6，而其Shannon指數(shù)最大，顯著大于T1、T2、T4和T6，可見(jiàn)T5的多樣性最高。

2.3 微生物群落組成分析

2.3.1 底泥樣品細(xì)菌群落門(mén)水平分析

通過(guò)分析不同樣品（T1～T6）的微生物門(mén)類(lèi)分布和變化情況（圖1、表3），可知各級(jí)凈化系統(tǒng)中最大優(yōu)勢(shì)菌均為變形菌門(mén)（Proteobacteria），綠彎菌門(mén)（Chlo?roflexi）是僅次于變形菌門(mén)（Proteobacteria）的優(yōu)勢(shì)菌，這兩個(gè)門(mén)的相對(duì)豐度都較為穩(wěn)定。放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度都在初始階段即T1中最高，豐度分別高達(dá)17.31%和15.94%，而在其后的幾個(gè)階段分別為7.91%～8.66% 和3.74%～6.02%。在各級(jí)處理池系統(tǒng)中，擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）的相對(duì)豐度較為穩(wěn)定，保持在3.93%～6.89%，其中T4 樣品中最高。而藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）的相對(duì)豐度呈現(xiàn)極大的波動(dòng)，初始階段T1 中的豐度相對(duì)較高，為9.97%，而中間階段（T2至T4），其豐度大幅下降，尤其是在T4階段，僅為0.55%，但在后期（T5、T6）又有所回升。酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）和脫硫菌門(mén)（Desulfobacterota）的相對(duì)豐度也呈現(xiàn)極大的波動(dòng)，其中酸桿菌門(mén)（Acidobac?teriota）在T5樣品中最高，達(dá)15.94%，而在T1樣品中最低，僅3.99%。脫硫菌門(mén)（Desulfobacterota）在T4樣品中最高，達(dá)14.56%，而在T1樣品中最低，僅2.60%。其他微生物門(mén)類(lèi)，包括疣微菌門(mén)（Verrucomicrobiota）、黏菌門(mén)（Myxococcota）、螺旋體門(mén)（Spirochaetota）、硝化螺旋體門(mén)（Nitrospirota）、晚成菌門(mén)（Latescibacterota）、光合菌門(mén)（Gemmatimonadota）、浮霉菌門(mén)（Planctomy?cetota）、甲烷氧化菌門(mén)（Methylomirabilota）等也有一些波動(dòng)，但相對(duì)豐度較小。

2.3.2 底泥樣品細(xì)菌屬水平細(xì)菌群落分析

從屬水平物種組成柱狀圖（圖2）可知，T1階段的主要優(yōu)勢(shì)物種為Symbiobacteraceae 科未分類(lèi)屬（占7.75%）、Anaeromyxobacte（占2.90%）、念珠藻科（Nos?tocaceae）未分類(lèi)屬（占2.68%）、硫氧化湖沉積桿菌屬（Limnobacter，占2.02%）；T2 階段的主要優(yōu)勢(shì)物種為Anaerolineaceae 科未分類(lèi)屬（占4.26%）、Anaeromyxo?bacter（占4.46%）；T3階段的主要優(yōu)勢(shì)物種為Vicina?mibacterales 目未分類(lèi)屬（占4.11%）、Anaeromyxobacte（占3.32%）；T4 階段的主要優(yōu)勢(shì)物種為CandidatusCompetibacter（占4.62%）、Anaerolineaceae科未分類(lèi)屬（占3.52%）；T5階段的主要優(yōu)勢(shì)物種為Anaerolineace?ae科未分類(lèi)屬（占4.32%）、Vicinamibacterales 目未分類(lèi)屬（占3.52%）；T6 階段的主要優(yōu)勢(shì)物種為Anaero?lineaceae 科未分類(lèi)屬（占2.65%）、Anaeromyxobacter（占3.57%）。

從物種豐度熱圖（圖3）和優(yōu)勢(shì)物種豐度在各個(gè)樣品中占比（表4）可以看出，在6個(gè)不同階段的樣品中，微生物群落組成隨污水處理過(guò)程的進(jìn)行而發(fā)生了顯著變化。T1階段中Symbiobacteraceae科未分類(lèi)屬、念珠藻科（Nostocaceae）未分類(lèi)屬、單歧藻屬（Tolypo?thrix）、動(dòng)胞囊菌（Kineosporia）分別占所有階段總量的99%、96%、98%和98%，在T1階段的相對(duì)豐度分別達(dá)到7.75%、1.22%、1.35%、1.12%，而在后續(xù)階段則大幅降低。此外，纖發(fā)鞘絲藍(lán)細(xì)菌屬（Leptolyngbya）僅在T1階段出現(xiàn)，相對(duì)豐度為1.16%。反硝化菌Candida?tus Competibacter（能夠還原NO2-N 和NO3-N）在T1、T3、T6階段含量極低，但在T2、T4、T5階段相對(duì)較高，尤其在T4階段，其比例高達(dá)53%，在T2和T5階段分別占28%和18%，其在T2、T4、T5階段的相對(duì)豐度也分別達(dá)到2.48%、4.62%、1.58%。類(lèi)諾卡氏菌屬（No?cardioides）在T1階段的比例高達(dá)84%，其相對(duì)豐度也達(dá)2.68%；能夠分解硫代硫酸鹽離子的硫氧化湖沉積桿菌屬（Limnobacter）在T1階段的比例高達(dá)79%，其相對(duì)豐度也達(dá)2.02%。這些結(jié)果表明不同處理階段微生物群落組成的動(dòng)態(tài)變化，以及特定微生物類(lèi)群在污水處理過(guò)程中的關(guān)鍵作用。

2.4 微生物群落多樣性分析

Beta多樣性分析通過(guò)對(duì)不同生境或微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。由圖4可知，T1和其他樣品距離較遠(yuǎn)，T3、T6 與其他樣品具有較大差異，而T2、T4、T5 的距離較近。PCoA 分析中PC1 和PC2可以解釋67.4%的變量，基于此算法的壓力系數(shù)為0.04（Plt;0.05），說(shuō)明圖形具有很好的代表性，表明結(jié)果具有良好的擬合度，能夠準(zhǔn)確地反映菌群的組成情況。

2.5 環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析

本研究中，由于趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（DCA）的前四軸Axis_lengths的最大值為2.25，未超過(guò)3.5，因此選擇線性模型，利用RDA分析，評(píng)估了環(huán)境變量對(duì)底泥中細(xì)菌群落的影響，并使用vif.cca函數(shù)計(jì)算了各環(huán)境變量的膨脹因子（VIF），結(jié)果顯示VIF 值分別為1.35、2.98、2.81、4.71、1.26，均低于20，意味著所有環(huán)境因素均被納入考慮。

RDA 結(jié)果顯示，第一軸和第二軸分別解釋了29.52% 和7.38% 的樣本變異（見(jiàn)圖5）。有機(jī)質(zhì)和總磷含量與排序軸具有極顯著的相關(guān)性（Plt;0.01），而總氮含量也與排序軸呈現(xiàn)顯著相關(guān)（Plt;0.05）。這表明有機(jī)質(zhì)和總磷是影響底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素，總氮也起到了一定的作用。相比之下，pH值和總鉀對(duì)底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著。

從物種與環(huán)境因子的相關(guān)性熱圖（圖6）可以看出，Sva0485未定類(lèi)群、Syntrophales目未分類(lèi)屬和Gai?ellales目未分類(lèi)屬以及Spirochaeta 菌屬的相對(duì)豐度與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)，前兩個(gè)菌屬與有機(jī)質(zhì)含量的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（Plt;0.01）。

Mantel Test網(wǎng)絡(luò)熱圖是一種在微生物組學(xué)中廣泛應(yīng)用的分析方法，用于探究環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性。由圖7可見(jiàn)，微生物群落結(jié)構(gòu)與有機(jī)質(zhì)和總磷之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r≥0.4）。具體來(lái)說(shuō)，有機(jī)質(zhì)與T1、T2、T3、T4和T6階段的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正相關(guān)，而與T5階段的群落結(jié)構(gòu)呈負(fù)相關(guān)。同樣，總磷與T2、T3、T4、T5和T6階段的群落結(jié)構(gòu)正相關(guān)，與T1階段的群落結(jié)構(gòu)負(fù)相關(guān)。然而環(huán)境因子之間的相互作用也不容忽視，尤其是總氮與總磷之間的相關(guān)性更為顯著（相關(guān)系數(shù)r≥0.6），并且達(dá)到了極顯著的水平（Plt;0.01），表明環(huán)境因子對(duì)微生物群落影響是多個(gè)因素及其相互作用的結(jié)果。

3 討論

3.1 底泥養(yǎng)分含量對(duì)養(yǎng)豬污水處理效率和生物降解過(guò)程的影響

微生物的活性和生長(zhǎng)受到pH值的顯著影響，微酸性至中性的pH值區(qū)間對(duì)大多數(shù)微生物的代謝活動(dòng)是有利的。根據(jù)曾薇等[12]的研究，適宜的pH值范圍（4.0～7.0）能夠促進(jìn)微生物群落的生長(zhǎng)，并有效進(jìn)行污染物的生物降解。本研究觀察到所有樣品的pH值均保持在這一范圍內(nèi)，這為微生物的代謝活動(dòng)提供了良好的環(huán)境條件。有機(jī)質(zhì)濃度是評(píng)估水體營(yíng)養(yǎng)水平的關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響。在本研究中，底泥樣品的有機(jī)質(zhì)濃度存在較大差異，這可能與不同凈化階段的生物降解潛力有關(guān)。隨著水生植物在各級(jí)凈化池中的生長(zhǎng)，有機(jī)質(zhì)在凈化池中逐漸積累，導(dǎo)致從T1到T6的底泥樣品中有機(jī)質(zhì)濃度呈遞增趨勢(shì)。較高的有機(jī)質(zhì)濃度為微生物提供了豐富的碳源，有利于有機(jī)物的分解，但也增加了污泥產(chǎn)量?？偟涂偭椎臐舛葘?duì)水體的富營(yíng)養(yǎng)化具有顯著影響。Yuan 等[13]的研究表明，通過(guò)生物刺激和生物增強(qiáng)作用可以改善水體微生物群落的結(jié)構(gòu)。在本研究中，多級(jí)凈化系統(tǒng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽具有一定的去除效果，特別是在一級(jí)凈化池中，總磷濃度顯著降低，顯示出一級(jí)生化池（狐尾藻，T1）在去除磷方面的高效性?？偟獫舛仍诓煌瑯悠烽g存在較大波動(dòng)，這表明需要進(jìn)一步的改進(jìn)生物處理工藝來(lái)提升氮的去除效率?？傗洕舛鹊姆€(wěn)定性對(duì)于水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡和植物生長(zhǎng)至關(guān)重要。崔海[14]的研究指出，AAO工藝-人工濕地處理城市污水系統(tǒng)能夠有效地進(jìn)行模擬與優(yōu)化調(diào)控。在本研究中，所有樣品總鉀濃度相對(duì)穩(wěn)定，這可能意味著水體和底泥中的鉀循環(huán)處于平衡狀態(tài)，對(duì)于植物生長(zhǎng)和生態(tài)系統(tǒng)的健康是有益的。

3.2 微生物群落在養(yǎng)豬污水多級(jí)凈化系統(tǒng)中的動(dòng)態(tài)變化及其生態(tài)功能

在養(yǎng)豬污水多級(jí)凈化系統(tǒng)中，微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于污染物的去除和系統(tǒng)的整體性能至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)T1～T6樣品的微生物門(mén)類(lèi)分布和變化情況進(jìn)行分析，可以觀察到不同微生物類(lèi)群在污水處理過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及其潛在的生態(tài)作用。變形菌門(mén)（Proteobacteria）在所有樣品中均表現(xiàn)為最大優(yōu)勢(shì)菌，已有研究揭示了其原因是變形菌門(mén)具有很強(qiáng)的耐鹽堿性[15]，且可以利用有機(jī)物的分解作用，產(chǎn)生氨氣和甲烷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)代謝活動(dòng)[16]，此外，自生固氮與共生固氮微生物中一大部分都屬于變形菌門(mén)，對(duì)濕地氮、磷等有機(jī)質(zhì)循環(huán)有重要作用[17]。本研究的結(jié)果表明，變形菌門(mén)（Proteobacteria）相對(duì)豐度在不同凈化階段間保持相對(duì)穩(wěn)定，這可能與其在生物脫氮過(guò)程中的關(guān)鍵作用有關(guān)[18]，其中就包含硝化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌以及大部分的反硝化細(xì)菌[19]。綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）作為第二大優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其豐度的波動(dòng)可能與光照和有機(jī)物的可用性有關(guān)，尤其是在相對(duì)豐度最低的T2和相對(duì)豐度最高的T4階段，這可能反映了光合作用微生物對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)。放線菌門(mén)（Acti?nobacteriota）能分泌纖維素分解酶，并在有機(jī)物的分解和礦化中發(fā)揮作用[20]。放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)（Fir?micutes）在初始階段T1中的高豐度表明它們可能在有機(jī)物的初始分解階段更為活躍。隨著污水處理的進(jìn)行，這些菌門(mén)的豐度逐漸降低，可能反映了它們?cè)谟袡C(jī)物降解和環(huán)境條件變化中的適應(yīng)性。擬桿菌門(mén)能有效降解幾丁質(zhì)、纖維素、果膠等有機(jī)聚合物[21]。擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）的相對(duì)豐度在各階段保持穩(wěn)定，這可能與其在幾丁質(zhì)、纖維素、果膠等有機(jī)物降解和營(yíng)養(yǎng)循環(huán)中的持續(xù)作用有關(guān)。藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacte?ria）和酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）以及脫硫菌門(mén)（De?sulfobacterota）的豐度波動(dòng)可能與它們?cè)谔囟ōh(huán)境條件下的適應(yīng)性和生態(tài)功能有關(guān)，如藍(lán)藻門(mén)利用太陽(yáng)能將無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，酸桿菌門(mén)分解小分子脂肪酸和有機(jī)酸，以及一些難以降解的化合物[22]；脫硫菌門(mén)對(duì)硫化物具有還原作用[23]等。

Vicinamibacterales 目未分類(lèi)屬和厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）未分類(lèi)屬的豐度變化可能反映了在特定條件下，這些微生物對(duì)有機(jī)物的降解能力。在污水處理的初始階段T1，Symbiobacteraceae科未分類(lèi)屬、念珠藻科未分類(lèi)屬、單歧藻屬（Tolypothrix）、動(dòng)胞囊菌（Kineosporia）、類(lèi)諾卡氏菌屬（Nocardioides）和硫氧化湖沉積桿菌屬（Limnobacter）占比分別達(dá)到99%、96%、98%、98%、84% 和79%，而在后續(xù)階段顯著降低，這表明這些微生物在初期適應(yīng)環(huán)境和啟動(dòng)生物降解過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。反硝化菌CandidatusCompetibacter 在T2、T4、T5階段的相對(duì)豐度較高，分別達(dá)到2.48%、4.62%、1.58%，這可能與它們?cè)诘h(huán)中的作用有關(guān)，特別是在脫氮過(guò)程中這些微生物通過(guò)還原NO2-N和NO3-N，有助于減少污水中的氮含量，從而減輕水體富營(yíng)養(yǎng)化的風(fēng)險(xiǎn)[24]。圖5 展示的屬水平上優(yōu)勢(shì)菌屬與各樣品的關(guān)系進(jìn)一步揭示了微生物群落組成的動(dòng)態(tài)變化。例如，細(xì)鞘絲藻能夠有效緩沖水體磷濃度，抑制了沉積物磷釋放[25]，纖發(fā)鞘絲藍(lán)細(xì)菌屬（Leptolyngbya）在T1階段的100%占比可能指示了其在初期的除磷作用。

3.3 環(huán)境因子對(duì)養(yǎng)豬污水多級(jí)凈化系統(tǒng)中微生物群落的影響

環(huán)境因子之間的相互作用對(duì)微生物群落的影響不容忽視，并且環(huán)境因子之間的相互作用可能比單一因子的影響更為顯著[26]。Mantel Test 網(wǎng)絡(luò)熱圖表明有機(jī)質(zhì)與總磷之間的相關(guān)性較強(qiáng)，這可能指示了在多級(jí)凈化系統(tǒng)中，營(yíng)養(yǎng)鹽的循環(huán)和轉(zhuǎn)化是相互關(guān)聯(lián)的過(guò)程?？偟c總磷的相關(guān)性較強(qiáng)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了氮磷循環(huán)在生態(tài)系統(tǒng)中的緊密聯(lián)系。有效的環(huán)境因子調(diào)控對(duì)于優(yōu)化微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，因此可通過(guò)調(diào)控理化因子來(lái)影響微生物群落[27]。本研究結(jié)果表明在環(huán)境管理和污水凈化處理中，可以通過(guò)多種環(huán)境因子的調(diào)控，優(yōu)化微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，提高污水處理效率和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

本研究結(jié)果表明，有機(jī)質(zhì)含量與多個(gè)微生物群落的相對(duì)豐度存在顯著正相關(guān)，包括Sva0485 未定類(lèi)群、Syntrophales 目未分類(lèi)屬和Gaiellales 目未分類(lèi)屬以及Spirochaeta 屬。具體來(lái)說(shuō)，Sva0485 與脲酶活性之間存在顯著相關(guān)，這表明它可能在氮循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮作用[28]；Syntrophales 參與丙酸的降解過(guò)程[29]，且通常與其他微生物形成共生關(guān)系，共同促進(jìn)復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)的分解，為其他微生物如甲烷菌提供可利用的基質(zhì)[30]；Gaiellales目中的微生物通過(guò)分解污水中的有機(jī)物，將其轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水，有效降低污水的生化需氧量（BOD）和化學(xué)需氧量（COD）[31]；而特定的Spi?rochaeta菌株能夠?qū)δ承┕I(yè)廢水中的有毒有害物質(zhì)進(jìn)行生物降解[31]。由此可見(jiàn)，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了有機(jī)質(zhì)在水體生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，以及不同微生物群落在有機(jī)物轉(zhuǎn)化和污染物降解過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。通過(guò)了解這些因素的相互作用，可以更好地優(yōu)化污水處理工藝。總氮是衡量水體中所有形態(tài)氮（包括有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮）的總和，其濃度與水體的富營(yíng)養(yǎng)化潛力密切相關(guān)。未分類(lèi)的Symbiobacteraceae科、念珠藻科未分類(lèi)的屬、單歧藻屬（Tolypothrix）、動(dòng)胞囊菌（Kineo?sporia）、類(lèi)諾卡氏菌屬（Nocardioides）、硫氧化湖沉積桿菌屬（Limnobacter）絕大多數(shù)集聚在T1 中。因此，這些微生物群落可能與氮、磷的循環(huán)有緊密的關(guān)系，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)分析不同處理階段底泥樣品的理化因子指標(biāo)及微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)和總磷是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素，變形菌門(mén)（Proteobac?teria）為最大優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度在不同凈化階段間保持相對(duì)穩(wěn)定，有機(jī)質(zhì)含量與Sva0485 未定類(lèi)群、Syn?trophales 目未分類(lèi)屬和Gaiellales 目未分類(lèi)屬以及Spirochaeta 屬等的相對(duì)豐度存在顯著正相關(guān)。此外，反硝化菌Candidatus Competibacter 也是影響系統(tǒng)中氮循環(huán)的重要類(lèi)群。在日后的系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程，可通過(guò)篩選和利用這些特定功能菌進(jìn)行生物強(qiáng)化，提高污水處理系統(tǒng)的凈化能力。

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（責(zé)任編輯：葉飛）