Bacillus cabrialesii BCH除臭功能分析及在豬糞堆肥中應(yīng)用

摘要：為了緩解畜禽糞便堆肥過程中產(chǎn)生的惡臭氣體導(dǎo)致的環(huán)境污染，本研究以課題組前期在豬糞中分離篩選得到的一株具有除臭效果的芽孢桿菌為對象，測定其NH3和H2S的去除能力等。將菌株BCH進(jìn)行全基因組測序后，對其氮硫代謝相關(guān)基因進(jìn)行挖掘。以豬糞為堆肥原料，探究菌株BCH在堆肥中的除臭能力以及菌株對于畜禽糞便堆肥的效果。研究發(fā)現(xiàn)，該菌株為卡氏芽孢桿菌（Bacillus cabrialesii），其最適生長溫度范圍為30～60 ℃，最適pH范圍為4.0～9.0；通過測定發(fā)現(xiàn)菌株對于氨氮的利用率最高為45%，在室內(nèi)豬糞試驗中，該菌株對于氨氣、硫化氫的去除率分別為27%、26%。酶活測定發(fā)現(xiàn)該菌株表現(xiàn)出了多種降解酶的活性，其中脂肪酶活性為23.99 U·mL-1，蛋白酶活性為36.44 U·mL-1，羧甲基纖維素酶活最高，為36.52 U·mL-1。三代全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)其具有氮、硫代謝相關(guān)基因hao、soxB。將菌株BCH應(yīng)用于豬糞堆肥發(fā)酵中，BCH組的有機(jī)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、總養(yǎng)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、種子發(fā)芽指數(shù)分別為64.35%、4.66%、151.64%，均高于CK組，并且接菌組的臭氣釋放量明顯低于CK組。對堆肥樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析表明，在屬水平上，鞘脂桿菌屬（Sphingobium）是兩組堆肥發(fā)酵早期的主要細(xì)菌群，隨著堆肥的進(jìn)行，具有硝化能力的細(xì)菌（如Ureibacillus）和具有硫氧化能力的細(xì)菌（如Pseudoxanthomonas）的豐度在實驗組中有所上升。本研究為提高畜禽糞便堆肥產(chǎn)品質(zhì)量提供了依據(jù)和菌種資源。

關(guān)鍵詞：除臭微生物；堆肥發(fā)酵；微生物群落；卡氏芽孢桿菌；基因

中圖分類號：S141.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）11-2701-11 doi：10.11654/jaes.2024-0440

隨著社會和經(jīng)濟(jì)的不斷進(jìn)步，我國的畜牧養(yǎng)殖業(yè)也在飛速發(fā)展，據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的相關(guān)統(tǒng)計，我國2022年生豬、肉牛、羊和家禽的出欄量分別達(dá)到了6.99億頭、4 840萬頭、3.36億只和161.4億只，但同時也伴隨著大量畜禽糞便等畜禽廢棄物的產(chǎn)生。畜禽糞便含有大量農(nóng)作物生長所需的氮、磷、鉀等元素，是資源化再利用的好原料[1]，但這些糞便除了具有資源化特點的同時還容易產(chǎn)生大量含氮、硫化物的惡臭氣體，這些惡臭氣體不僅會污染大氣，甚至?xí)θ祟惤】翟斐晌：?，如何有效處理這些畜禽糞便等廢棄物成了大眾所關(guān)注的問題。

堆肥是處理畜禽糞便等有機(jī)廢棄物的一種常用且有效的方法，傳統(tǒng)的堆肥法依靠自然存在的微生物進(jìn)行發(fā)酵，不僅發(fā)酵周期長，同時還會產(chǎn)生大量刺激性氣味，這些氣味成分主要以NH3、H2S 為主，會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，危害人類的身體健康，如何減少堆肥過程中產(chǎn)生的臭味則成了畜禽糞便堆肥的難題[2]。

國內(nèi)外常用的除臭方法有物理法、化學(xué)法和生物法。有研究表明，化學(xué)、物理的除臭方式有一定的效果，但存在缺點，比如處理費(fèi)用較高、可能造成二次污染等，而生物除臭法不僅具有操作簡單、成本低廉的特點，處理效果顯著，其也成為了堆肥除臭的有效方法和研究熱點[3]，選育微生物除臭菌劑是國內(nèi)外主要研究方向，利用篩選的高效微生物發(fā)酵菌劑來處理畜禽糞便，是減少臭味氣體排放，提升發(fā)酵效果最有效的方法之一。為了挖掘新的除臭微生物資源，本研究以從畜禽糞便堆肥中分離篩選獲得的一株具有高效除臭效果的芽孢桿菌為對象，研究其除臭產(chǎn)酶特征，通過全基因組測序分析其除臭產(chǎn)酶相關(guān)的基因特征，將其應(yīng)用于豬糞發(fā)酵中以探究其作用效果，旨在為畜禽糞便等有機(jī)廢棄物的資源化提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源于本課題組前期從高溫發(fā)酵豬糞中分離篩選得到的一株具有除臭能力的芽孢桿菌。TSA、TSB培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基、淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基、CMCase發(fā)酵培養(yǎng)基、脲酶發(fā)酵培養(yǎng)基[4-5]由實驗室自行配備。

1.2 方法

1.2.1 菌株的鑒定

將獲得的除臭菌株進(jìn)行革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)學(xué)特征。采用16S rRNA測序進(jìn)行菌株的分子生物學(xué)鑒定，對菌株進(jìn)行DNA 提取后，采用16S rRNA 通用引物27F（5′ - AGAGTTTGATCCTG?GCTCAG - 3′）和1492R（5′ - CGGTTACCTTGTTAC?GACTT-3′）進(jìn)行擴(kuò)增，送至有康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。根據(jù)菌株的測序結(jié)果，在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，選取菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育[6]。

1.2.2 生長溫度范圍測定

將菌株接種于TSA 平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)將單菌落接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h 制備成母液。吸取母液1 mL 接種于100 mL的TSB中，在30～65 ℃之間每隔5 ℃設(shè)置溫度梯度分組，放置接種有菌液的培養(yǎng)基于對應(yīng)溫度的搖床中，每組放3 個重復(fù)。每隔2 h 用分光光度計在600 nm處以空白培養(yǎng)基為校準(zhǔn)測定其吸光度，繪制成生長曲線[7]。

1.2.3 生長pH范圍測定

將菌株接種于TSA 平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后將單菌落接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h制備成母液。在pH 3.0～10.0之間每隔1.0設(shè)置梯度分組，用0.1 mol·L-1的稀鹽酸和0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)TSB的pH，吸取母液1 mL接種于100 mL的TSB于37 ℃搖床培養(yǎng)，每組3個重復(fù)。每隔2 h用分光光度計在600 nm 處以空白培養(yǎng)基為校準(zhǔn)測定其吸光度，繪制成生長曲線[7]。

1.2.4 氨氮利用率測定

將活化后的芽孢桿菌接種至TSB培養(yǎng)基中制作成種子液，以5%的接種量接種至氨氮利用培養(yǎng)基中[8]，測定其1～5 d的氨氮含量變化，氨氮利用率用加菌培養(yǎng)液氨氮含量與空白培養(yǎng)液氨氮含量的百分比表示。

1.2.5 除臭能力檢測

將活化后的芽孢桿菌BCH接種到TSB液體培養(yǎng)基中，在40 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。采集的豬糞（經(jīng)過豬場處理）100 g裝入燒杯中接種10 mL種子液，混合均勻，氨氣和硫化氫測定各3個重復(fù)，同時一組堆肥只加無菌水作空白對照。在大燒杯中分別放入裝有豬糞的小燒杯，在氨氣的組中放入裝有20 mL氨氣吸收液的小燒杯，在測定硫化氫的大燒杯中，放入裝有20 mL鋅氨絡(luò)合液的小燒杯。氨氣用納氏分光法測定[9]，硫化氫用碘量法測定[10]。

1.2.6 BCH全基因組測序與功能注釋

將BCH單菌落調(diào)至TSB培養(yǎng)液中于37 ℃振蕩培養(yǎng)后制備成菌液，選用TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒提取細(xì)菌DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性以及純度后送至北京諾禾致源科技股份有限公司，利用PacBio平臺進(jìn)行三代全基因組測序。利用生物信息學(xué)的方法對基因組進(jìn)行分析，基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫對不同的編碼基因序列進(jìn)行功能注釋。

1.2.7 菌株產(chǎn)酶酶活測定

將菌株制成種子懸浮液，按10% 的接種量接種于特定發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，40 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，設(shè)置3 個重復(fù)，參照徐明亮等[11]方法測定菌株1～5 d的脂肪酶活力。參照鄭思揚(yáng)[12]方法測定菌株1～5 d的淀粉酶活力。參照陳明霞等[13]方法測定菌株1～5 d的蛋白酶活力。參照Guillermo等[14]方法測定菌株1～5 d的纖維素酶活力。參照Qin等[15]方法測定菌株1～5 d的脲酶活力。

1.2.8 豬糞堆肥實驗

實驗設(shè)為兩個處理組，兩個處理組均以豬糞與鋸末（輔料）的混合物為原料，調(diào)節(jié)堆料初始C/N為25∶1，豬糞與鋸末比為1∶1.2，初始含水量調(diào)節(jié)至60%。以不加菌劑的堆體作為空白對照組，以添加菌劑的處理組為實驗組，按物料濕質(zhì)量1.5%接種量使堆體初始菌劑濃度達(dá)到108 CFU·g-1，將各組堆料混合均勻。在空地上放置覆膜，在覆膜上放置干燥的苜蓿草等雜草作為墊料，在墊料空隙中插入通氣管道（外部連通電機(jī)）以便堆肥過程中對堆體充氧，將混合好的堆料以條垛形放置于墊料上，底部長4 m，寬2 m，堆體高2m。堆肥過程中，以300 W（250 L·min-1）持續(xù)充氧（速率0.05 m3·min-1·m-3）。

實驗期為60 d，每天測定各組堆體溫度，間隔3 d測定惡臭氣體釋放情況，參照武靜蓉[16]的方法采集惡臭氣體，將大漏斗放于堆體內(nèi)部，與裝有吸收液的集氣瓶中長玻璃管連接，而集氣瓶短玻璃管則與大氣采樣器相連。每天收集各堆體堆肥樣品，每次采集3組平行樣品，采集樣品低溫避光儲藏以便后續(xù)指標(biāo)測定。

1.2.9 堆肥發(fā)酵指標(biāo)測定

用工業(yè)溫度計測堆體溫度；用pH計測堆肥樣品pH；用烘干法測含水率[17]。氮、磷、鉀、有機(jī)質(zhì)含量，種子發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)測定參照有機(jī)肥料NY 525—2021的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。參照環(huán)境保護(hù)HJ 533—2009中納氏試劑比色法測定NH3含量，H2S的測量采用碘量法。

1.2.10 堆肥樣品高通量測序

根據(jù)試劑盒要求提取堆肥樣品基因組DNA 后，利用分光光度計測定提取DNA的純度和濃度，用引物對細(xì)菌16S rRNA 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增使用Agen?court AMPure XP磁珠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化后的PCR產(chǎn)物溶于Elution Buffer，貼上標(biāo)簽構(gòu)建建庫后，利用HiSeq平臺進(jìn)行測序，文庫構(gòu)建與測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾，保留高質(zhì)量的Clean data用于后期分析，將reads拼接成Tags后聚類成OTU并與數(shù)據(jù)庫比對、物種注釋；基于OTU 和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析，組間物種差異分析以及關(guān)聯(lián)分析等。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2020和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Graphpad Prism 9.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

通過實驗室前期的定性試驗確定該菌株具有除臭能力，將該菌株編號為BCH。BCH 在平板上菌落形態(tài)呈圓形邊緣粉粒狀，白色，表面粗糙，濕潤有褶皺，革蘭氏染色后在顯微鏡下菌體紫色、形態(tài)呈長桿狀，將BCH提取DNA進(jìn)行16S rRNA分子測序后進(jìn)行比對，鑒定該菌株為卡氏芽孢桿菌（B. cabrialesii）。

2.2 BCH生長溫度及pH范圍

通過測定發(fā)現(xiàn)BCH菌株的生長溫度范圍在30～60 ℃之間，菌株的最適生長溫度在40 ℃左右。繪制在不同pH條件下的生長曲線后發(fā)現(xiàn)BCH在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)可以生長，最適生長pH為6.0。

2.3 BCH的氨氮利用率

對培養(yǎng)液中的氨氮消耗量測定如圖1所示，實驗組培養(yǎng)液中的氨氮消耗量在1～3 d呈上升趨勢，氨氮消耗量最高在第3 天，達(dá)到了（22.81±1.34）μg，6 d內(nèi)，培養(yǎng)液中的氨氮消耗量總共達(dá)到73.58 μg。菌株對氨氮的利用率在1～6 d 呈逐漸上升的趨勢，在2～5 d菌株的氨氮利用率由8.97%升至40%，在第6天時，氨氮利用率達(dá)到最高為45.75%。

2.4 BCH的豬糞模擬除臭

通過在室內(nèi)進(jìn)行豬糞模擬發(fā)酵測定發(fā)現(xiàn)，實驗組的氨氣與硫化氫釋放量均低于對照組（圖2a），說明BCH有降低臭氣濃度的效果。從圖2b可以看出實驗組對于氨氣的去除率在第4天最高，可達(dá)到27%，對于硫化氫的去除率在第6 天最高，為26%，表明了BCH對氨氣、硫化氫的釋放有很好的抑制效果。

2.5 BCH的產(chǎn)酶能力

通過對BCH 的產(chǎn)酶能力進(jìn)行定量定性測定發(fā)現(xiàn)，菌株BCH具有產(chǎn)脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、脲酶以及羧甲基纖維素酶的能力，其中羧甲基纖維素酶活性最高，可達(dá)（36.52±0.22）U·mL-1，淀粉酶活性最小，為（2.52±0.11）U·mL-1，具體見表1。

2.6 基因功能分析

2.6.1 KEGG功能基因注釋

通過KEGG 對BCH 菌株的代行功能進(jìn)行分析。BCH中共2 822個基因參與到6類（一級）生物代謝通路，其中最多的通路類別為新陳代謝。

在二級功能層上，BCH 中參與的主要幾大類群包括有氨基酸和核苷酸代謝（36個基因），丙酮酸代謝（26個基因），糖酵解/糖異生（25個基因）、淀粉和蔗糖代謝（32個基因），果糖和甘露醇代謝（28個基因），丁酸代謝（25 個基因），氮代謝（17 個基因），硫代謝（20個基因）。

2.6.2 氮、硫代謝相關(guān)基因分析

在KEGG 通路中，菌株BCH 的基因組中與無機(jī)氮代謝相關(guān)的通路為氮代謝（ko00910），通過基因組測序分析，共篩選得到13種基因被匹配至氮代謝通路中（通路參考https：//www. genome. jp / pathway /map00910）。在代謝通路中有17種基因參與異化硝酸鹽還原過程（Dissmilatory nirtrate reduction），同化硝酸鹽還原過程、反硝化過程、固氮作用、硝化作用、厭氧氨氧化。其中與硝化作用相關(guān)的基因為nxrAB和hao；nxrAB 負(fù)責(zé)編碼硝酸還原酶，hao 基因負(fù)責(zé)編碼羥胺脫氫酶。

硝化作用是目前減少糞便中氨氣揮發(fā)的一條有效途徑，hao 是異養(yǎng)硝化菌硝化過程的關(guān)鍵酶之一，同時hao 和amoA 的共表達(dá)有利于加強(qiáng)硝化作用[18]，BCH菌株的硝化過程基因參與情況見圖3。

經(jīng)KEGG 注釋分析，菌株BCH 中的基因組共有20個基因被匹配至硫代謝通路中，硫代謝的通路為ko00920（www.genome.jp/pathway/map00920），用工具OmicStudio tools將基因與各通路匹配，得到菌株BCH的硫代謝通路，主要包含了同化硫酸鹽還原、二酰氨基硫酸鹽還原和氧化、硫氧化途徑。其中，與H2S去除相關(guān)的過程為硫氧化途徑。在菌株BCH基因組中與H2S代謝有關(guān)的基因為sox 系列酶，soxX 起主要的催化氧化作用，soxCD 也起著催化作用，其不影響整個氧化進(jìn)程，而soxB 是一種水解酶，能夠水解soxX 上的絡(luò)合物釋放出SO24-，soxB在H2S氧化反應(yīng)過程中起著重要作用。

在硫氧化過程中，H2S等硫化物作為細(xì)菌的初始底物，為細(xì)菌的酶促反應(yīng)提供能源，細(xì)菌通過sox 酶復(fù)合物將H2S轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硫，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為亞硫酸鹽和硫酸鹽，BCH菌株對H2S的氧化過程及參與基因見圖4。

2.7 豬糞堆肥發(fā)酵

2.7.1 BCH菌劑接種對堆肥過程的影響

由圖5a可知，兩組堆體從第2天開始快速升溫，整體溫度都是呈先上升后下降的趨勢，CK 組在第4天達(dá)到整個時間線最高溫度57.6 ℃，而實驗組在第5天升至堆體溫度最高，達(dá)到了65.9 ℃，兩組堆體溫度從第15天后均呈下降趨勢，但實驗組總體溫度均高于CK組。由圖5b可知，CK組和實驗組pH均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并且在1～40 d，實驗組pH均低于CK 組，說明BCH 具有降低堆肥pH 的作用。由圖5c可知，CK組和實驗組的含水率整體呈下降趨勢，堆肥過程中兩組堆體含水率差異較小，堆肥結(jié)束時CK組含水率為45.47%，下降了38個百分點，實驗組含水率為46.78%，下降了36個百分點。

2.7.2 堆肥樣品理化性質(zhì)分析

種子發(fā)芽指數(shù)是判斷有機(jī)肥是否腐熟的重要指標(biāo)。由圖6可知，堆肥樣品的種子發(fā)芽指數(shù)隨著堆肥時間推移總體呈現(xiàn)上升趨勢，并且種子發(fā)芽指數(shù)總體維持在80%以上，滿足有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2021要求。

從圖7可以看出堆肥有機(jī)質(zhì)含量總體呈逐漸降低的趨勢，在1～30 d，實驗組的有機(jī)質(zhì)含量由70.3%降至66.71%，CK 組由70.2% 降至68.02%，伴隨堆肥溫度快速下降，CK組的有機(jī)質(zhì)含量在第30～60 天快速下降，而實驗組維持相對平緩的下降速度，實驗組和CK組的有機(jī)質(zhì)含量分別為64.35%和59.20%。

堆肥產(chǎn)物的養(yǎng)分含量包括全氮、全磷、全鉀，如圖8所示。在堆肥過程中，兩組堆體的養(yǎng)分含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，實驗組的氮磷鉀含量總體高于CK組，堆肥結(jié)束后實驗組全氮、全磷、全鉀含量分別為1.16%、2.29%、1.15%，總養(yǎng)分含量達(dá)到4.6%，而CK組的全氮、全磷、全鉀含量分別為1.08%、2.06%、1.03%，總養(yǎng)分含量為4.17%，說明BCH菌劑能夠更好地固定堆肥養(yǎng)分，減少營養(yǎng)元素流失，有利于提高堆肥品質(zhì)。

2.7.3 堆肥的除臭效果

堆肥NH3和H2S的釋放情況如圖9所示。NH3排放的高峰期存在于堆肥的高溫階段（圖9a），在第9～15 天實驗組的NH3排放量高于CK組，兩組堆體NH3的排放量在第9天達(dá)到最高，分別為54.06 mg·L-1和41.23 mg·L-1，而在第15天時，兩組堆體NH3的排放量分別降至26.22 mg·L-1和27.71 mg·L-1，實驗組NH3排放量下降趨勢較CK組更為明顯。隨著堆肥時間的推移，堆肥NH3排放量逐漸下降并在堆肥腐熟期趨于平緩，此時實驗組的NH3排放量普遍低于CK組，在堆肥結(jié)束時，實驗組和CK 組的NH3排放量分別為10.24、10.54 mg·L-1。而堆肥的H2S排放量在堆肥過程中呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢（圖9b），在堆肥第9～12天，實驗組和CK 組的H2S 排放量分別由0.41、0.37mg·L-1下降至0.26、0.06 mg·L-1，而在12～15 d兩組堆體的H2S排放量開始呈現(xiàn)上升的趨勢，實驗組的H2S排放量升高至0.51 mg·L-1，CK組為0.37 mg·L-1，在堆肥溫度開始下降后，實驗組的H2S 排放量持續(xù)低于CK 組，直至堆肥結(jié)束時，實驗組和CK 組的H2S排放量分別為0.01、0.09 mg·L-1，說明添加BCH菌劑對于去除堆肥惡臭氣體有良好的效果。

2.8 堆肥微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化

2.8.1 堆肥微生物的Alpha多樣性指數(shù)

通過Alpha 多樣性差異分析對堆肥的兩組樣品的物種多樣性進(jìn)行觀察，包括Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，它們分別度量物種的豐度和物種的多樣性，具體數(shù)據(jù)見表2。

由表2可知，隨著發(fā)酵時間的推進(jìn)，兩組堆肥的Shannon指數(shù)呈現(xiàn)下降后再逐步上升的趨勢，這可能是堆體升溫后導(dǎo)致某些細(xì)菌在高溫環(huán)境下難以生存，從而減少了細(xì)菌的多樣性，在堆肥的初期，加菌組的Shannon 指數(shù)較CK 組更高，說明加入BCH 菌劑提高了堆肥細(xì)菌的多樣性。兩組堆肥的Chao1指數(shù)隨著堆肥發(fā)酵時間推進(jìn)而逐漸降低，兩組堆肥Chao1指數(shù)均在堆肥初期達(dá)到最高。

2.8.2 堆肥微生物的群落結(jié)構(gòu)

堆肥門水平上前10的細(xì)菌豐度如圖10所示，其中變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroido?ta）、厚壁菌門（Firmicutes）是堆肥過程中主要的門水平類。堆肥剛開始時，變形菌門占主導(dǎo)地位，豐度為48%，其次是擬桿菌門（17%）和厚壁菌門（16%），而隨著堆肥時間的推進(jìn)，在第9天也就是堆肥的高溫階段時，CK組的變形菌門豐度略微降低，放線菌門（Acti?nobacteria）豐度上升至16%，而實驗組的厚壁菌門豐度上升較大，成為實驗組的主導(dǎo)門類，豐度為53%。在堆肥的腐熟階段，CK組的厚壁菌門豐度降低，其他門類細(xì)菌豐度上升，變形菌門以及擬桿菌門依然是優(yōu)勢菌門，在實驗組中堆肥的微生物結(jié)構(gòu)更為多樣化，變形菌門豐度較堆肥前期降低，綠彎菌門（Chloro?flexi）、黏菌門（Myxococcota）以及其他門類細(xì)菌豐度有所提升，說明添加BCH 菌劑對堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成有所影響。

堆肥屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖11所示。在堆肥發(fā)酵初期，CK組和實驗組的優(yōu)勢菌群均為鞘脂桿菌屬（Sphingobium）。而在堆肥升溫階段，CK組中假黃單孢菌（Pseudoxanthomonas）、熱單孢菌屬（Ther?momonospora）、嗜熱菌屬（Symbiobacterium）的豐度大幅上升，分別由2%、1%、1% 上升至9%、13%、11%。實驗組除了假黃單孢菌（Pseudoxanthomonas）及嗜熱菌屬（Symbiobacterium）外，乳酸菌屬（Caldicoprobac?ter）的豐度上升也十分明顯，由堆肥前期的1% 上升至3%。隨著堆肥時間的推移，CK 組中假單胞屬（Pseudomonas）、UBA6140、甲烷菌屬（Methanosaeta）的豐度較堆肥前期都有所上升，在實驗組中梭菌屬（Clostridium）、纖維堆囊菌屬（Sorangium）以及熱單孢菌屬等的菌群豐度上升較為明顯。

3 討論

畜禽糞便堆肥中營養(yǎng)豐富能夠為微生物提供很好的生長環(huán)境，因此其中的微生物種類較多，雖然畜禽糞便堆肥會產(chǎn)生氨、吲哚等有害氣體，但從中也可能孕育出具有去除惡臭氣體能力的微生物[19]。本研究通過從糞便堆肥中篩選得到的一株具有除臭效果的BCH菌株，鑒定其為卡氏芽孢桿菌（B.cabrialesii），是一種能夠有效去除H2S、NH3等惡臭氣體主要成分的細(xì)菌。通過室內(nèi)除臭模擬實驗發(fā)現(xiàn)BCH菌劑對于NH3的去除率最高可達(dá)到27%，對于H2S的去除率最高可達(dá)到26%，BCH菌劑能夠有效降低糞便堆肥過程中產(chǎn)生的臭氣。此外，卡氏芽孢桿菌表現(xiàn)出多種分解酶活性，其中纖維素酶活最高可達(dá)到（36.52±0.22）U·mL-1。黃旺洲[20]將具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌劑用于豬糞堆肥實驗中發(fā)現(xiàn)，該菌劑能夠有效分解糞便中的有機(jī)質(zhì)以及粗纖維，從而抑制了堆肥中H2S、NH3等惡臭氣體的釋放。沈琦等[21]將從豬糞樣品中分離得到的具有纖維素降解能力的芽孢桿菌用于豬糞除臭實驗，發(fā)現(xiàn)其具有較高的臭氣去除能力。徐杰等[22]將從土壤、秸稈、牛糞等樣品中分離篩選得到具有纖維素分解能力的細(xì)菌用于雞糞堆肥，發(fā)現(xiàn)其不僅能夠使堆肥快速升溫，還具有有效除臭的潛力?？梢姡瑢w維素有分解能力的微生物在糞便堆肥除臭方面有很好的應(yīng)用前景。BCH菌株還具有較高的產(chǎn)脂肪酶和蛋白酶活性，微生物分泌的蛋白酶和脂肪酶不僅可以加速堆體有機(jī)物分解促進(jìn)堆肥腐熟，還能減少堆體中惡臭物質(zhì)積累，蛋白酶分解蛋白質(zhì)的過程中，生成的氨基酸和小肽可以被微生物進(jìn)一步利用，從而減少氨直接釋放，而脂肪酶通過和蛋白酶協(xié)同作用可以減少有機(jī)物在厭氧環(huán)境下的腐敗，降低硫化氫等硫化物的產(chǎn)生[23]。

堆肥中氮硫類化合物轉(zhuǎn)化所發(fā)生的氨化作用、硝化作用、反硝化作用以及硫酸鹽還原作用等是惡臭氣體生成轉(zhuǎn)化的主要途徑，而硝化和硫氧化是減少堆肥中NH3和H2S的有效途徑。本研究基于KEGG對BCH菌株基因注釋及代謝功能分析發(fā)現(xiàn)，BCH 菌株具有hao 和soxB 等與除臭相關(guān)基因，而hao 和soxB 分別為硝化和H2S氧化為SO24-過程中的關(guān)鍵基因[24]，代表著BCH菌株能夠進(jìn)行硝化作用和硫氧化作用，hao 基因編碼的氫氧胺氧化還原酶催化氫氧胺的氧化，將其轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，對于防止氨的積累至關(guān)重要，而soxB蛋白作為硫酸化酶，確保硫化合物的氧化反應(yīng)順利進(jìn)行，生成穩(wěn)定的硫酸鹽，促進(jìn)環(huán)境中的硫循環(huán)、減少有毒硫化合物的積累，這從基因?qū)用嬲f明了菌株對NH3和H2S的去除能力。BCH菌株在二級功能層上主要以碳水化合物代謝、氨基酸代謝為主要代謝途徑，有研究表明碳水化合物代謝在細(xì)菌降解纖維素中起著非常重要的作用[25]，而細(xì)菌通過氨基酸代謝將堆肥中的銨態(tài)氮等無機(jī)態(tài)氮合成為氨基酸，從而減少了堆肥中的氮素?fù)p失，這不僅有效減少氨氣的揮發(fā)，同時能夠很好地固定堆肥的營養(yǎng)成分，提高堆肥品質(zhì)[26]。

本研究表明在堆肥中接種BCH菌劑不僅能夠有效減少惡臭氣體釋放并且能夠促進(jìn)堆肥的腐熟。在豬糞堆肥中，實驗組的溫度總體高于空白組，并且實驗組最高溫度可升至65.9 ℃，遠(yuǎn)高于空白組，這可能是接種微生物菌劑刺激了堆肥中微生物對有機(jī)物的降解作用，表明接種BCH菌劑可提高堆肥的溫度，促進(jìn)堆肥的腐熟過程。有研究表明低pH能夠減少氮損失，從而減少氨氣的揮發(fā)[27]，而在堆肥的時間線中，實驗組的pH 整體低于CK 組，表明接種BCH 菌劑能夠降低堆肥pH。本研究發(fā)現(xiàn)添加BCH菌劑能夠一定程度提高堆肥的養(yǎng)分，例如有機(jī)質(zhì)含量、氮磷鉀含量等，這也表明BCH 菌劑具有在堆肥過程中固定營養(yǎng)元素，減少氮的揮發(fā)損失的作用。

本研究通過16S rRNA高通量測序觀察堆肥樣品微生物群落結(jié)構(gòu)變化。厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門是堆肥各階段的主要門類，厚壁菌門來源于畜禽腸道，它的主要功能是能夠分解多種碳水化合物[28-29]，本研究中厚壁菌門廣泛存在于堆肥的各階段，表明碳水化合物分解貫穿堆肥的整個過程，而變形菌門則在氮元素及硫元素的循環(huán)中起著重要作用[30]。在屬水平上，鞘脂桿菌屬（Sphingobium）是兩組堆體的優(yōu)勢菌屬，接種BCH菌劑提高了Ureibacillus、Bacillus、Ste?rolibacterium、Tepidimicrobium、Pseudomonas、Pseudox?anthomonas 等的豐度，有研究表明，Bacillus 屬因具有耐熱的特點廣泛存在于堆肥的各階段中，并且在堆肥系統(tǒng)中起著重要作用，Bacillus 除了具有產(chǎn)各種生物酶的能力外，還具有一定的除臭功能[31-32]，而Ureiba?cillus 具有分泌淀粉酶及脂肪酶的能力，有利于促進(jìn)堆肥中的有機(jī)質(zhì)分解[33]。在堆肥的高溫期，實驗組中Pseudoxanthomonas 的豐度上升，Pseudoxanthomonas屬細(xì)菌在硫氧化過程中起著重要的作用，可以提高硫酸根的含量，減少H2S 的揮發(fā)[34]，由此表明添加BCH菌劑有助于減少H2S的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

（1）本研究以篩選出的具有除臭效果的BCH 菌株為對象，通過16S rRNA分子測序后比對鑒定其為卡氏芽孢桿菌（B. cabrialesii）。測定其生理特性發(fā)現(xiàn)其具有產(chǎn)多種分解酶能力，通過全基因組測序并基于KEGG分析其代謝通路和相關(guān)功能基因，hao、soxB分別為氨氮、硫氧化過程中的關(guān)鍵基因。

（2）在除臭模擬實驗中加入菌劑后發(fā)現(xiàn)，NH3、N2S的去除率達(dá)到27%、26%。在豬糞堆肥中加入菌劑減少了NH3、N2S的釋放，不僅改善了堆肥的品質(zhì)，還提高了堆肥的微生物多樣性，促進(jìn)了微生物群落結(jié)構(gòu)的演替。

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（責(zé)任編輯：葉飛）