穩(wěn)定表達Cas9蛋白的C2C12細胞株構建

摘要：【目的】優(yōu)化慢病毒包裝體系并建立能穩(wěn)定表達Cas9蛋白的小鼠成肌細胞系（C2C12），為基因編輯技術研究提供細胞模型和理論參考。【方法】以C2C12細胞為研究對象，設對照組和試驗組，調(diào)整三質(zhì)粒（pmd2.g、pspax2和Cas9）用量配比以優(yōu)化慢病毒包裝體系。利用優(yōu)化后的慢病毒包裝體系將表達Cas9蛋白的質(zhì)粒（lenti-Cas9-puro和lenti-Cas9-Blast）包裝成慢病毒感染C2C12細胞。采用藥物篩選富集和單克隆分選獲得穩(wěn)定表達Cas9蛋白的C2C12單克隆細胞株。利用基因組鑒定、免疫熒光染色、sgRNA檢測等試驗驗證細胞株構建情況?！窘Y果】慢病毒包裝體系優(yōu)化后，試驗組質(zhì)粒轉染效率達90%以上，極顯著高于對照組（80%）（Plt;0.01）；試驗組慢病毒滴度提高至1.8×107 TU/mL，極顯著高于對照組（6.2×106 TU/mL）（Plt;0.001）。PCR結果顯示，C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株成功擴增出Cas9、puro和BSD序列，外源Cas9序列成功整合到C2C12細胞基因組中，而野生型的C2C12細胞不存在Cas9序列。免疫熒光染色結果表明，C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株能表達Cas9蛋白。T7E1酶切和Sanger測序結果表明，整合的Cas9蛋白具有切割活性。【結論】通過調(diào)整三質(zhì)粒用量配比成功優(yōu)化慢病毒包裝體系，提高質(zhì)粒轉染效率和慢病毒滴度。成功構建能穩(wěn)定表達Cas9蛋白的C2C12細胞株，建立了構建穩(wěn)轉細胞株的相對成熟體系。

關鍵詞：CRISPR/Cas9；C2C12細胞株；慢病毒包裝體系；基因編輯

中圖分類號：S865.13文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）10-3169-10

Constructing a C2C12 cell line that stably expresses Cas9 protein

LIU Wei-wei1，2，WANG Wei2，YANG Xiao-gan1*，TANG Zhong-lin1，2*

（1College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China；2Agricultural Genomics Institute at Shenzhen，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Shenzhen，Guangdong 518000，China）

Abstract：【Objective】To optimize the lentiviral packaging system and establish a mouse myoblast cell line（C2C12）that stably expressed Cas9 protein，providing a cellular model and theoretical reference for gene editing technology re-search.【Method】Using C2C12 cells as the research subject，control and experimental groups were set up.The dosage ra-tio of three plasmids was adjusted to optimize the lentiviral packaging system，and the plasmid expressing Cas9（lenti-Cas9-puro and lenti-Cas9-Blast）was packaged into lentivirus using the optimized system and infected C2C12 cells.C2C12 monoclonal cell lines with stable Cas9 expression were obtained by drug screening enrichment and monoclonal sorting.Genomic identification，cell immunofluorescence and sgRNA detection were conducted to verify the construction of the cell line.【Result】After optimization of the lentiviral packaging system，the plasmid transfection efficiency of the experimental group reached over 90%，which was extremely significantly higher than the control group（80%）（Plt;0.01）；the lentiviral titer of the experimental group increased to 1.8×107 TU/mL，which was extremely significantly higher than the control group（6.2×106 TU/mL）（Plt;0.001）.PCR results showed that the C2C12-Cas9 stable cell line suc-cessfully amplified Cas9，puro，and BSD sequences，indicating that the exogenous Cas9 sequence was successfully inte-grated into the C2C12 cell genome，while wild-type C2C12 cells did not contain the Cas9 sequence.Immunofluorescence staining results indicated that the C2C12-Cas9 stable cell line could express Cas9 protein.T7E1 enzyme digestion and Sanger sequencing results indicated that the integrated Cas9 protein had cutting activity.【Conclusion】By adjusting the ra-tiosof the three plasmids，the lentiviral packaging system is successfully optimized，improving plasmid transfection effi-ciency and lentiviral titer.C2C12 cell line that stably expresses Cas9 protein is successfully constructed，establishing a relatively mature system for constructing stable cell lines.

Key words：CRISPR/Cas9；C2C12 cell line；lentiviral packaging system；gene editing

Foundation items：National Key Scientific Research Program of China（2023YFF1001100）；National Natural Science Foundation of China（U23A20229）；Project of Bama for Talents in Science and Technology（20220027）

0引言

【研究意義】CRISPR/Cas9是生物學和醫(yī)學領域重要的基因編輯技術（Lander，2016），利用CRISPR/Cas9技術能有目的地改變生物基因組，可用來培育動植物新品種并縮短育種年限（陳璟州等，2022），也為人類疾病治療提供了新思路（郝靜然和王少峽，2021；馬孟丹等，2021；史夢然等，2021）。慢病毒載體具有高效的感染能力、廣泛的宿主適應性和基因長期穩(wěn)定表達特性（房恩岳等，2023），是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的理想傳遞工具。優(yōu)化慢病毒包裝體系可提高基因編輯的準確性，減少非特異性整合和基因毒性。構建穩(wěn)定表達Cas9蛋白的C2C12細胞株，能為骨骼肌發(fā)育和基因編輯相關研究提供穩(wěn)定的細胞模型及技術參考?！厩叭搜芯窟M展】慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎開發(fā)的基因治療載體，與常見的逆轉錄病毒載體不同，慢病毒載體能感染分裂細胞和非分裂細胞，還能將外源基因有效整合到宿主染色體上，進而實現(xiàn)基因的穩(wěn)定表達（Tandon et al.，2018；Moreira et al.，2021）。研究表明，慢病毒能有效感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞和干細胞等多種類型細胞，具有廣闊的應用前景（Kiem et al.，2014；Fan et al.，2019；Lamsfus-Calle et al.，2020）?；蚓庉嫾夹g在動物育種和疾病防治中的應用前景廣闊（Kalds et al.，2019）。利用CRISPR/Cas9技術敲除myostatin基因，能提高羊、牛和豬中等家畜的肌肉質(zhì)量（Han et al.，2014；Lv et al.，2016；Su et al.，2018；Gim et al.，2022）；利用CRISPR/Cas9技術敲除CD163后，豬對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）表現(xiàn)出完全抗性（Whitworth et al.，2014；Yang et al.，2018）；利用慢病毒介導的CRISPR/Cas9基因編輯技術，能成功構建靶向梅花鹿TGF-β1基因敲除載體pBOBI-gRNA2，證明TGF-β1基因缺失能抑制鹿茸軟骨細胞的體外增殖（劉明曉等，2019）；通過基因編輯敲除ANPEP的豬能抵抗豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）感染（Whitworth et al.，2019；Stoian et al.，2020）；通過慢病毒感染DF-1細胞篩選穩(wěn)轉Cas9蛋白的陽性細胞，能成功構建具有切割活性的穩(wěn)定表達Cas9蛋白的DF-1細胞系，有效提高雞DF-1細胞轉染效率（李曉嬌等，2023）。【本研究切入點】慢病毒作為基因編輯載體系統(tǒng)展現(xiàn)了巨大潛力，相比于轉座子系統(tǒng)和腺病毒系統(tǒng)，慢病毒具有更高的感染效率和穩(wěn)定性，但也存在包裝滴度不高和細胞系構建方法不穩(wěn)定等問題，但鮮見優(yōu)化慢病毒包裝體系并構建穩(wěn)定表達Cas9蛋白的小鼠成肌細胞系（C2C12）的研究報道。【擬解決的關鍵問題】選用C2C12細胞，通過優(yōu)化慢病毒包裝體系，提高慢病毒感染效率，將外源基因敲入C2C12細胞基因組中，構建能穩(wěn)定表達Cas9蛋白的C2C12細胞株，為基因編輯技術研究提供細胞模型和理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

人胚胎腎細胞系（Human embryonic kidneys 293T，HEK293T）和C2C12細胞購自中國科學院細胞庫。慢病毒質(zhì)粒lenti-Cas9-puro、lenti-Cas9-Blast和輔助質(zhì)粒pmd2.g、pspax2購自云舟生物科技（廣州）股份有限公司；DMED基礎培養(yǎng)基、胎牛血清FBS和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；細胞轉染試劑Jetprime購自法國Polyplus公司；慢病毒助染試劑polybrene購自美國Sigma公司；基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Cas9蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；T7E1核酸酶購自紐英倫生物技術（北京）有限公司；抗生素Blasticidin S（BSD）和Puromycin（puro）購自美國ThermoFisher Scientific公司。主要儀器設備：PCR儀購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；化學發(fā)光成像儀購自廣州博鷺騰生物科技有限公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；流式細胞儀和超速離心機購自美國Beckman Coulter公司；克隆環(huán)Corning PYREX 6×8mm Cloning Cylinders購自康寧（上海）管理有限公司；超速離心管購自美國Beck-man公司。

1.2引物序列及質(zhì)粒圖譜

細胞株驗證所用引物序列信息見表1，慢病毒包裝所用輔助質(zhì)粒和目的質(zhì)粒圖譜見圖1。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，質(zhì)粒圖譜信息來源于Addgene網(wǎng)站（https：//www.addgene.org/）。

1.3試驗方法

1.3.1慢病毒包裝體系優(yōu)化慢病毒包裝體系優(yōu)化步驟：（1）復蘇代數(shù)靠前且生長狀態(tài)良好的HEK293T細胞，細胞匯合度達90%左右時進行質(zhì)粒轉染（即慢病毒包裝），轉染前棄培養(yǎng)基，緩慢加入含2%FBS的無抗生素新鮮培養(yǎng)基。（2）基于預試驗慢病毒包裝三質(zhì)粒用量配比摸索及參照Sano等（2019）和Simpson等（2020）的研究結果，將試驗組和對照組慢病毒包裝三質(zhì)粒的用量比例分別設為1∶2∶3和1∶3∶4。其中，試驗組6孔細胞培養(yǎng)板中各孔轉染體系如下：向200μL Jetprime Buffer中按pmd2.g：pspax2∶Cas9=1∶2∶3（pmd2.g質(zhì)粒0.7μg，pspax2質(zhì)粒1.4μg，Cas9質(zhì)粒2.1μg）的比例依次加入對應的去內(nèi)毒素質(zhì)粒，輕輕吹打混勻，加入10μL Jetprime regent，再次吹打混勻，室溫避光孵育10 min，接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，輕輕搖勻放回培養(yǎng)箱。該體系包裝的慢病毒上清液可直接感染細胞。試驗組100 mm細胞培養(yǎng)皿中轉染體系：向500μL Jetprime Buffer中按pmd2.g∶pspax2∶Cas9質(zhì)粒=1∶2∶3（pmd2.g質(zhì)粒4.0μg，pspax2質(zhì)粒8.0μg，Cas9質(zhì)粒12.0μg）的比例依次加入對應的去內(nèi)毒素質(zhì)粒，輕輕吹打混勻，加入40μL Jetprime regent，再次吹打混勻，室溫避光孵育10min，接種至100 mm細胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻放回培養(yǎng)箱。該體系包裝的慢病毒經(jīng)過濃縮后可感染細胞。對照組轉染體系：向200μL Jetprime Buffer中按pmd2.g∶pspax2∶Cas9=1∶3∶4（pmd2.g質(zhì)粒2.5μg，pspax2質(zhì)粒7.5μg，Cas9質(zhì)粒10.0μg）的比例依次加入對應的去內(nèi)毒素質(zhì)粒，輕輕吹打混勻，加入10μL Jetprime regent，進行慢病毒包裝，其余條件不變。（3）慢病毒包裝6 h后，6孔細胞培養(yǎng)板各孔和100 mm細胞培養(yǎng)皿分別補加1.0和5.0 mL含1%雙抗和2%FBS的培養(yǎng)基，第一次換液24h后觀察細胞狀態(tài)，6孔細胞培養(yǎng)板各孔和100 mm細胞培養(yǎng)皿分別補加1.5和10.0 mL含1%青鏈霉素和2%FBS的培養(yǎng)基，混勻后放回培養(yǎng)箱。病毒包裝后60h時觀察細胞狀態(tài)，顯微鏡下采集圖像。（4）收集上清液（即病毒液），封口膜密封，4℃下3000 r/min離心10 min，0.45μm濾器過濾。6孔細胞培養(yǎng)板中包裝的慢病毒于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?00 mm細胞培養(yǎng)皿中包裝的慢病毒在4℃下30000r/min超高速離心3h，沉淀重懸后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2質(zhì)粒轉染效率及慢病毒感染效率檢測慢病毒質(zhì)粒lenti-Cas9-puro和lenti-Cas9-Blast不攜帶熒光標簽，以表達綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒sgRNA質(zhì)粒lenti-sgRNA-GFP為參照，分析試驗組和對照組慢病毒包裝體系的優(yōu)劣。質(zhì)粒轉染效率檢測：質(zhì)粒轉染24h后收集細胞，通過流式細胞儀統(tǒng)計轉染效率。慢病毒感染效率檢測：將包裝好的慢病毒濃縮液感染C2C12細胞，3 d后收集細胞，通過流式細胞儀測定慢病毒的感染效率并計算慢病毒滴度，計算公式如下：

滴度（TU/mL）=細胞數(shù)×熒光百分比/病毒體積

式中，病毒體積以mL為單位。

1.3.3 Cas9慢病毒感染C2C12細胞慢病毒濃縮液滴度高，且本研究選用的是易感的C2C12細胞，因此，后續(xù)試驗僅使用慢病毒上清液進行細胞株構建。C2C12細胞匯合度達30%～50%時進行感染，6孔細胞培養(yǎng)板每孔加入1.5 mL慢病毒上清液、1.5 mL 2%無青鏈霉素培養(yǎng)基和10.0μg/mL助染試劑poly-brene，充分混勻，每間隔24h更換1次含1%青鏈霉素和2%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～5 d。

1.3.4藥物篩選及單克隆分選最適藥篩濃度摸索：將C2C12細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞匯合度達70%～80%時，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，加入含不同濃度梯度puro（0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0μg/mL）和BSD（0、4.0、8.0、12.0、16.0和20.0μg/mL）的10%FBS培養(yǎng)基；培養(yǎng)7 d左右，當出現(xiàn)某個濃度的細胞全部死亡，且小一個濃度的細胞大多數(shù)存活時，選擇該濃度為最佳致死濃度，用于藥篩試驗。最終獲得puro和BSD的濃度分別為3.0和16.0μg/mL。陽性細胞的藥物篩選：藥物篩選持續(xù)4～7 d仍存活的細胞即為穩(wěn)定表達Cas9的多克隆C2C12細胞。單克隆分選：采用有限稀釋法稀釋藥物篩選后存活的陽性細胞，通過細胞計數(shù)在100mm細胞培養(yǎng)皿中接種50個細胞，待單個細胞生長成細胞團后，利用克隆環(huán)和胰蛋白酶消化單克隆細胞團并進行分選擴繁，最終獲得穩(wěn)定表達Cas9的單克隆C2C12細胞，命名為C2C12-Cas9。

1.3.5 C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株驗證（1）提取C2C12-Cas9細胞基因組DNA，使用Cas9、puro和BSD引物進行PCR擴增，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。（2）免疫熒光染色檢測Cas9蛋白是否在C2C12-Cas9細胞內(nèi)表達。（3）將已驗證具有sgRNA活性的sgRNA質(zhì)粒轉染C2C12-Cas9細胞，培養(yǎng)3 d后提取細胞基因組DNA，使用Cas9-KO-test引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)Sanger測序和T7E1核酸內(nèi)切酶檢測sgRNA靶標位置是否出現(xiàn)編輯。

1.3.6細胞株構建流程圖將表達Cas9的質(zhì)粒和pmd2.g、pspax2轉染HEK293T細胞，培養(yǎng)60 h后收集慢病毒上清液并感染C2C12細胞。藥物篩選陽性細胞后，經(jīng)單克隆分選和擴繁后利用免疫熒光染色、Sanger測序、PCR擴增和T7E1酶切試驗獲得穩(wěn)定表達Cas9蛋白的C2C12細胞株（圖2）。

2結果與分析

2.1質(zhì)粒轉染效率及慢病毒感染效率檢測結果

質(zhì)粒轉染效率檢測結果如圖3和圖4所示，試驗組轉染效率達90%以上，極顯著高于對照組（85%左右）（rlt;0.01）。慢病毒感染效率檢測結果如圖5所示，試驗組陽性細胞率極顯著高于對照組（rlt;0.001），試驗組和對照組慢病毒滴度分別為1.8×107和6.2×106 TU/mL。

2.2 C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株驗證結果

結果如圖6所示，C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株成功擴增出Cas9、puro和BSD序列，而野生型的C2C12不存在Cas9序列。表明成功將Cas9序列整合至C2C12細胞基因組中。

2.3 C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株免疫熒光檢測結果

C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株免疫熒光檢測結果如圖7所示，胞質(zhì)中Cas9呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光，且綠色和藍色一一對應。表明C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株能穩(wěn)定表達Cas9蛋白，成功分選出單克隆C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株。

2.4 Cas9編輯活性驗證

酶切后的sgRNA表達載體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確認質(zhì)粒已被線性化（圖8）。隨后進行sgRNA引物和酶切載體的酶連反應，Sanger測序結果表明，3條sgRNA序列均已成功構建至sgRNA表達載體上（圖9）。將構建好的sgRNA表達載體轉染C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株，提取細胞基因組并進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序驗證基因編輯位點出現(xiàn)雜峰，表明該位置發(fā)生了基因編輯導致的細胞基因型改變（圖10）。同時，擴增產(chǎn)物經(jīng)T7E1酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)部分PCR產(chǎn)物被切割成了2個較短的條帶，表明該位置發(fā)生了編輯（圖11）。以上結果表明，Cas9蛋白發(fā)揮了切割作用，利用優(yōu)化后的慢病毒包裝體系成功構建了具有切割活性的C2C12-Cas9穩(wěn)轉細胞株。

3討論

基因編輯技術能縮短生物育種的年限，同時對疾病的研究具有指導意義（房元杰等，2021；鄒菊紅等，2021；莊重等，2022）。CRISPR/Cas9技術具有設計簡便、易操作、效率高等優(yōu)勢，已成為應用最廣泛的基因編輯技術（Knott and Doudna，2018；Anza-lone et al.，2020；Przybyla and Gilbert，2022）。CRISPR/Cas9技術應可用于功能缺失（Loss-of-Function）（如CRISPR KO，CRISPRi）（Gilbert et al.，2014；Zheng et al.，2018）和功能獲得（Gain-of-Function）（如CRISPRa）的篩選研究（Chavez et al.，2015）。C2C12細胞是畜禽骨骼肌發(fā)育研究中使用最多的細胞系，在該細胞系上進行基因編輯對于了解骨骼肌發(fā)育的調(diào)控具有重要意義。

與通過轉座子系統(tǒng)構建穩(wěn)轉細胞株（Di Matteo et al.，2012；Fonseca et al.，2020）相比，慢病毒包裝體系具有許多優(yōu)勢。在外源基因整合到宿主細胞基因組時，轉座子系統(tǒng)中的轉座酶會造成宿主DNA斷裂，給基因組的穩(wěn)定性帶來一定風險（Sandoval-Villegas et al.，2021），而慢病毒系統(tǒng)在整合外源基因時不會出現(xiàn)該現(xiàn)象；轉座子系統(tǒng)的成功與否很大程度上取決于系統(tǒng)內(nèi)2個表達質(zhì)粒的轉染效率，對于原代細胞等難轉染的細胞而言，轉座子系統(tǒng)的整合效率會大大降低（Holstein et al.，2018；Bishop et al.，2020），而慢病毒包裝體系的滴度是可以提升的，使慢病毒幾乎可以感染所有細胞（Lundstrom，2018）；此外，轉座子系統(tǒng)構建的細胞系，外源基因的表達豐度不高，而慢病毒包裝體系的整合效率較高，可實現(xiàn)宿主細胞內(nèi)的外源基因過表達（林馨倩等，2024）；CRISPR敲入系統(tǒng)成本較高、方案繁瑣、周期長、需設計sgRNA和提供DNA donor等，同時還依賴于Cas9的編輯效率及sgRNA的活性，適用于對外源基因有定點整合需求的細胞系構建（盧媛媛和安艷茹，2023；孫佳鑫，2023），與慢病毒包裝體系相比，其適用范圍較小?；诼《景b體系的優(yōu)越性，本研究優(yōu)化了慢病毒包裝體系，結果表明，調(diào)整pmd2.g∶pspax2∶Cas9配比為1∶2∶3后，慢病毒質(zhì)粒的轉染效率和滴度明顯升高。

慢病毒構建穩(wěn)轉細胞株體系也存在不足，如多克隆細胞株隨著傳代次數(shù)的增丟會失Cas9序列（McCarron etal.，2016），這可能是因為慢病毒整合的細胞相對于野生型細胞在生長活力上無優(yōu)勢，隨著傳代次數(shù)的增加，陽性細胞數(shù)目逐漸減少，最終導致Cas9序列丟失；此外，慢病毒細胞株構建過程中還可能產(chǎn)生細胞毒性和免疫反應等問題（B?ker et al.，2018；Chavez et al.，2023；Wilk et al.，2024）。本研究通過優(yōu)化慢病毒包裝體系，提高慢病毒滴度，成功構建了能穩(wěn)定表達Cas9蛋白的C2C12細胞株，為開展外源基因整合至宿主細胞基因組的研究提供了細胞模型。

4結論

通過調(diào)整三質(zhì)粒用量配比成功優(yōu)化慢病毒包裝體系，提高質(zhì)粒轉染效率和慢病毒滴度。成功構建能穩(wěn)定表達Cas9蛋白的C2C12細胞株，建立了構建穩(wěn)轉細胞株的相對成熟體系。

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（責任編輯蘭宗寶）