急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦熱休克蛋白基因表達(dá)及抗氧化酶活性的影響

摘要：【目的】探究急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦熱休克蛋白基因及抗氧化酶活性的影響，為實(shí)際生產(chǎn)中羅氏沼蝦的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎秒p因素試驗(yàn)，設(shè)不同溫度（20、24、28和32℃）和鹽度（0.5‰、4.0‰、8.0‰和12.0‰），共16個(gè)處理組，將羅氏沼蝦從初始溫度（24℃）和鹽度（0.5‰）環(huán)境轉(zhuǎn)移至各處理組環(huán)境中進(jìn)行急性脅迫，分別在脅迫24和48 h時(shí)采集羅氏沼蝦鰓組織及肝胰腺組織，測定熱休克蛋白70基因（HSP70）相對(duì)表達(dá)量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性?！窘Y(jié)果】脅迫24 h時(shí)，在相同溫度下，隨著鹽度的升高，羅氏沼蝦鰓組織和肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均整體呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；在0.5‰和4.0‰鹽度下，溫度為20、28和32℃時(shí)羅氏沼蝦鰓組織和肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均高于24℃，且肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量在溫度為28和32℃時(shí)顯著高于20℃（Plt;0.05，下同）。脅迫48 h后，溫度為24℃時(shí)，8.0‰和12.0‰鹽度下羅氏沼蝦鰓組織及肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于0.5‰與4.0‰鹽度。脅迫24 h時(shí)，在相同溫度下，隨著鹽度的升高，羅氏沼蝦腮組織SOD和GPX活性均整體呈上升趨勢(shì)；溫度為24℃時(shí)，隨著鹽度升高，肝胰腺組織SOD和GPX活性均無顯著變化（Pgt;0.05），而在其他溫度下出現(xiàn)明顯變化；在相同鹽度下，隨著溫度的升高，羅氏沼蝦鰓組織SOD和肝胰腺組織GPX活性均整體呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，腮組織GPX活性和肝胰腺組織SOD活性均整體呈上升趨勢(shì)。雙因素方差分析結(jié)果表明，溫度、鹽度及其交互作用對(duì)羅氏沼蝦鰓組織和肝胰腺組織HSP70基因表達(dá)與抗氧化酶（SOD和GPX）活性均有極顯著影響（Plt;0.01）?！窘Y(jié)論】急性溫度和鹽度脅迫會(huì)引起羅氏沼蝦HSP70基因相對(duì)表達(dá)量升高，且溫度驟升較溫度驟降更能誘導(dǎo)HSP70基因表達(dá)。溫度和鹽度驟變能引起羅氏沼蝦抗氧化酶活性變化，且溫度對(duì)抗氧化酶活性的影響大于鹽度。羅氏沼蝦通過調(diào)控HSP70基因相對(duì)表達(dá)量、SOD活性及GPX活性協(xié)同調(diào)節(jié)生理機(jī)能以適應(yīng)外部鹽度和溫度變化，增強(qiáng)對(duì)惡劣環(huán)境的耐受性。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦；熱休克蛋白基因；抗氧化酶活性；溫度；鹽度

中圖分類號(hào)：S968.22文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）09-2843-11

Effects of acute temperature and salinity stress on heat shockprotein gene expression and antioxidant enzyme activityin Macrobrachium rosenbergii

HE Bo1，2，DAI Xi-lin1，2*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University），Shanghai201306，China；2Shanghai Collaborative Innovation Center for Aquatic Animal Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University），Shanghai 201306，China）

Abstract：【Objective】To investigate the effects of acute temperature and salinity stress on the heat shock protein gene and antioxidant enzyme activity of Macrobrachium rosenbergii，which could provide reference basis for the healthy aqua-culture of M.rosenbergii in actual production.【Method】Using two-factor test with different temperatures（20，24，28 and 32℃）and salinity（0.5‰，4.0‰，8.0‰and 12.0‰），16 treatment groups in total，transferred M.rosenbergii fromthe initial temperature（24℃）and salinity（0.5‰）to the environment of each treatment group for acute stress.At 24 and 48 hof stress，the gill and hepatopancreas tissues of M.rosenbergii were taken for measurement of the expression level of heat shock proteins 70 gene（HSP70）and the activities of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GPX）.【Result】At 24 hof stress，with the increase of salinity，the relative expression of HSP70 gene in gills and hepato‐pancreas increased first and then decrease；at 0.5‰and 4.0‰salinity，the relative expression of HSP70 gene in gills and hepatopancreas of M.rosenbergii at 28 and 32℃was higher than 24℃，moreover，the relative expression of HSP70 gene in hepatopancreas at 28 and 32℃was significantly higher than 20℃（Plt;0.05，the same below）.After 48 h ofstress，the relative expression of HSP70 gene at 8.0‰and 4.0‰salinity at 24℃of gill and hepatopancreas tissues in M.rosenbergii was higher than 0.5‰and 4.0‰salinity.Under the same temperature at 24 h of stress，the activities of SOD and GPX in gill tissue of M.rosenbergii increased with the increase of salinity.When temperature was 24℃，SOD and GPX activities in hepatopancreas tissue had no significant changes with the increase of salinity（Pgt;0.05），but had ob-vious changes at other temperatures.Under the same salinity，SOD activity in gill tissue and GPX activity in hepatopancreastissue decreased first and then increased with the increase of temperature，GPX activity in gill tissue and SOD activity in hepatopancreas tissue increased as a whole.The results of two-factor ANOVA showed that temperature，salinity and theirinteraction had extremely significant effects on HSP70 gene expression and antioxidant enzyme（SOD and GPX）activityin gills and hepatopancreas of M.rosenbergii（Plt;0.01）.【Conclusion】Acute temperature and salinity stress can increasethe relative expression of HSP70 gene in M.rosenbergii，and sudden rise of temperature can induce HSP70 gene expres‐sion more than sudden fall of temperature.Temperature and salinity can cause the change of antioxidant enzyme activity of M.rosenbergii，and the influence of temperature on antioxidant enzyme activity is greater than salinity.By regulatingthe relative expression of HSP70 gene，SOD activity and GPX activity，M.rosenbergii synergously regulated its physio-logical function to adapt to external salinity and temperature changes，and enhanced its tolerance to harsh environment.

Key words：Macrobrachium rosenbergii；heat shock protein gene；antioxidant enzymes activity；temperature；sali-nity

Foundation items：Shanghai Science and Technology Agriculture Promotion Project（2021-02-08-00-12-F00784）；Shanghai Modern Agricultural Industry Technology System Project（HNKCZ〔2016〕5）

0引言

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenber-gii）隸屬長臂蝦科（Palaemonidae），自然分布于泰國和馬來西亞等東南亞國家，因其生長速度快、養(yǎng)殖周期短、營養(yǎng)價(jià)值高和經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn)被世界各地引種養(yǎng)殖（周勁松等，2006）。羅氏沼蝦在不同生長階段對(duì)溫度及鹽度要求不同，羅氏沼蝦溞狀幼體在發(fā)育過程中必須生活在一定鹽度的半咸水中，且過高或過低的溫度均會(huì)導(dǎo)致其存活率大幅下降（陳文靜等，2001）。且鹽度變化對(duì)羅氏沼蝦的性別分化及生長蛻皮周期有顯著影響?？梢?，溫度和鹽度是影響水生生物存活的重要環(huán)境因子，直接影響蝦類生長、代謝和繁殖等一系列生命活動(dòng)。因此，通過探究羅氏沼蝦在溫度和鹽度變化時(shí)的機(jī)體生理響應(yīng)機(jī)制對(duì)羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鹽度和溫度作為蝦類生長的重要環(huán)境因子，影響蝦類的生長、代謝和抗氧化功能等一系列生理活動(dòng)（王興強(qiáng)等，2022）。有研究表明蝦類鰓與肝胰腺的琥珀酸脫氫酶（SDH）和丙酮酸激酶（PK）能有效反映羅氏沼蝦有氧代謝水平及糖酵解能力，與蝦類生長速度有關(guān)（黎蘭詩和戴習(xí)林，2022）。水生動(dòng)物的抗氧化系統(tǒng)對(duì)清除代謝過程產(chǎn)生的活性氧有重要作用，當(dāng)生物體受環(huán)境脅迫時(shí)，氧化系統(tǒng)的平衡被打破，體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致機(jī)體損傷。在眾多抗氧化酶中，超氧化物歧化酶（SOD）可將機(jī)體產(chǎn)生的毒性O(shè)2-轉(zhuǎn)化為H2O2，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）可催化H2O2以維持體內(nèi)氧化平衡（吳志昊等，2011）。胡潤豪（2022）研究發(fā)現(xiàn)，溫度和鹽度驟變后葛氏長臂蝦（Palaemon gravieri）SOD及GPX活性均顯著增加；張高偉等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，溫度和鹽度升高或降低均會(huì)導(dǎo)致紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）體內(nèi)抗氧化酶活性變化。熱休克蛋白70（HSP70）作為熱休克蛋白家族的重要成員，在免疫應(yīng)答過程中參與蛋白的合成定位和折疊運(yùn)轉(zhuǎn)，促使不穩(wěn)定蛋白降解及錯(cuò)誤折疊蛋白修復(fù)，能重新激活酶活性使其具有抗氧化的作用。當(dāng)生物體受環(huán)境因子刺激后，熱休克蛋白的表達(dá)水平急速增加，起應(yīng)激保護(hù)作用（陳瓊?cè)甑龋?024）。司凱歌等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，溫度變化會(huì)誘導(dǎo)中華鱘（Acipenser sinensis）的熱休克蛋白大量合成，高溫脅迫期間HSP70基因的表達(dá)量顯著增加，且誘導(dǎo)程度取決于脅迫時(shí)間和脅迫強(qiáng)度；翟書華等（2022）研究高溫脅迫對(duì)日本沼蝦（Macrobra-chium nipponense）鰓和肝胰腺的影響，發(fā)現(xiàn)溫度升高激活了抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)熱休克蛋白基因表達(dá)上升。此外，熱休克蛋白不僅能被環(huán)境溫度誘導(dǎo)，還可能被其他因子誘導(dǎo)。鮑雪寧等（2013）研究鹽度對(duì)三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）熱休克蛋白基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)低鹽脅迫下HSP70基因在肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長整體呈先下降再上升的變化趨勢(shì)。目前，關(guān)于羅氏沼蝦在環(huán)境因子脅迫下的生理機(jī)能響應(yīng)機(jī)制研究主要集中于單一條件脅迫，如亞硝酸鹽（冼健安等，2016）、重金屬（郭慧等，2017）和氨氮（董學(xué)興，2019）等。近年來，部分學(xué)者開始聚焦于雙因素脅迫下水生生物的免疫應(yīng)答，李佳（2016）研究溫度和鹽度對(duì)菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）熱休克蛋白基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)低鹽、高溫和低溫均可誘導(dǎo)熱休克蛋白基因的表達(dá)；胡益鳴等（2020）研究發(fā)現(xiàn)溫度和鹽度驟變對(duì)巖牡蠣（Crassostrea nippona）SOD活性、過氧化氫酶（CAT）活性及存活率均產(chǎn)生顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】羅氏沼蝦不同發(fā)育階段對(duì)水體溫度和鹽度有特殊要求，而我國南方養(yǎng)殖地區(qū)近年極端高溫和低溫寒潮等惡劣天氣頻發(fā)，溫度和鹽度已成為羅氏沼蝦親蝦越冬及良種繁育的主要限制因素，但溫度和鹽度聯(lián)合急性脅迫對(duì)羅氏沼蝦生理的影響鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用雙因素試驗(yàn)，設(shè)不同溫度（20、24、28和32℃）和鹽度（0.5‰、4.0‰、8.0‰和12.0‰），共16個(gè)處理組，將羅氏沼蝦從初始溫度（24℃）和鹽度（0.5‰）環(huán)境轉(zhuǎn)移至各處理組環(huán)境中進(jìn)行急性脅迫，分別在脅迫24和48h時(shí)采集羅氏沼蝦鰓組織及肝胰腺組織，測定HSP70基因相對(duì)表達(dá)量、SOD活性和GPX活性。探究急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦熱休克蛋白基因表達(dá)及抗氧化酶活性的影響，為實(shí)際生產(chǎn)中羅氏沼蝦的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用1月齡羅氏沼蝦（體質(zhì)量1.50±0.25 g）均為上海申漕特種水產(chǎn)品公司培育的專門化生長品系雙列雜交子F11代，選取健康狀況良好、體表無明顯外傷且規(guī)格相近的羅氏沼蝦暫養(yǎng)于鹵蟲池。暫養(yǎng)條件：水溫為24℃，鹽度為0.5‰，每2 d換水1次，暫養(yǎng)7 d，期間不間斷持續(xù)曝氣，以保持水體溶解氧含量充足。每日于7：00、12：00和17：00投喂至飽食狀態(tài)，飼料為羅氏沼蝦配合飼料，試驗(yàn)開始前1 d停止投喂。動(dòng)物試驗(yàn)由上海海洋大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)SHOU-DW-2024-102。

1.2試驗(yàn)方法

根據(jù)羅氏沼蝦對(duì)溫度及鹽度的耐受范圍，設(shè)計(jì)雙因素試驗(yàn)，以24℃為初始溫度，設(shè)20、24、28和32℃4個(gè)溫度梯度，以0.5‰為初始鹽度，設(shè)0.5‰、4.0‰、8.0‰和12.0‰4個(gè)鹽度梯度，共16個(gè)處理組。使用藍(lán)色塑料箱（50 cm×60 cm×70 cm）進(jìn)行試驗(yàn)，按照設(shè)定鹽度計(jì)算并稱取所需鹽量，逐步加入水中并攪拌至完全溶解，使用鹽度計(jì)檢測水體鹽度；使用可調(diào)節(jié)溫度的加熱棒加熱水體，采用溫度計(jì)進(jìn)行檢測水溫。待溫度和鹽度達(dá)設(shè)定值時(shí)，將羅氏沼蝦從暫養(yǎng)環(huán)境直接投入各處理組環(huán)境中，進(jìn)行急性溫度和鹽度脅迫，持續(xù)脅迫48h。每隔4h使用鹽度計(jì)檢測鹽度，確保鹽度波動(dòng)不超過±0.2‰；使用溫度計(jì)檢測水溫，確保溫度波動(dòng)不超過±0.5℃。每個(gè)處理組投放30尾羅氏沼蝦，設(shè)3個(gè)平行。

1.3樣品采集

分別在溫度和鹽度脅迫24和48h時(shí)進(jìn)行采樣，采樣時(shí)每個(gè)平行隨機(jī)選取15尾羅氏沼蝦，在冰盤上迅速解剖，采集羅氏沼蝦完整的鰓組織和肝胰腺組織，選取3份置于1.5 mL離心管中混樣，液氮速凍后-80℃保存，用于分析HSP70基因表達(dá)情況及測定SOD和GPX活性。

1.4抗氧化酶活性測定

稱量采集的肝胰腺組織和鰓組織樣品質(zhì)量，按1∶9（w∶v）加入PBS（0.1 mol/L），冰上研磨制成10%組織勻漿，采用5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppen-dorf公司）4℃下3000 r/min離心10 min，取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。參照BCA蛋白濃度測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書處理樣品溶液，使用NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度計(jì)（美國ThermoFisher Scientific公司）在562 nm波長處測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度計(jì)算樣品蛋白濃度，用于酶活性計(jì)算。采用SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定SOD活性，使用GPX測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定GPX活性。

1.5 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

參照TRNzol Universal Reagent［天根生化科技（北京）有限公司］說明書提取鰓組織和肝胰腺組織總RNA，利用超微量紫外分光光度計(jì)檢測總RNA純度和濃度，當(dāng)OD260 nm/OD 280 nm為1.8～2.0視為合格，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)NCBI已公布的羅氏沼蝦HSP70基因序列，以羅氏沼蝦18S rRNA為內(nèi)參基因。使用Primer Premier 5.0和Primer-BLAST設(shè)計(jì)特異性引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20.0μL：2×FastFire qPCR PreMix 10.0μL，500 ng/μL cDNA模板0.5μL，10μmol/L正、反向引物各0.6μL，ddH2O 8.3μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃5 s，60℃10 s，72℃15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。設(shè)3次重復(fù)，通過熔解曲線分析檢測引物特異性。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 27.0分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以鹽度和溫度為主要因素進(jìn)行雙因素方差分析（Two-way ANOVA），采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。使用GraphPad Prism 9.5.1作圖。

2結(jié)果與分析

2.1急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦HSP70基因表達(dá)的影響

2.1.1急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦鰓組織HSP70基因表達(dá)的影響如圖1所示，脅迫24h時(shí)，在相同溫度下，羅氏沼蝦鰓組織HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量隨著鹽度升高整體呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，溫度為28℃且鹽度為4.0‰時(shí)羅氏沼蝦鰓組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值，高于其他處理組；在0.5‰、4.0‰和12.0‰鹽度下，溫度為20、28和32℃時(shí)羅氏沼蝦鰓組織HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量均高于24℃，表明溫度驟變會(huì)引起HSP70基因相對(duì)表達(dá)量的升高，且溫度為28℃時(shí)HSP70基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于20℃，說明溫度驟升較溫度驟降更易引起HSP70基因表達(dá)上調(diào)。脅迫48h后，溫度為24和32℃時(shí)，在8.0‰和12.0‰鹽度下羅氏沼蝦鰓組織HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量較脅迫24 h時(shí)明顯上升，且8.0‰和12.0‰鹽度下HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于0.5‰與4.0‰鹽度（Plt;0.05，下同）。雙因素方差分析結(jié)果（表2）顯示，溫度、鹽度及其交互作用對(duì)羅氏沼蝦鰓組織HSP70基因表達(dá)均有極顯著影響（Plt;0.01，下同），進(jìn)一步證實(shí)溫度和鹽度對(duì)HSP70基因表達(dá)的共同影響。

2.1.2急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺組織HSP70基因表達(dá)的影響如圖2所示，脅迫24 h時(shí)，在相同溫度下，羅氏沼蝦肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量隨著鹽度升高呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在溫度32℃且鹽度為4.0‰時(shí)，羅氏沼蝦肝胰腺組織HSP70基因表達(dá)量達(dá)最高值，高于其他處理組；在0.5‰、4.0‰和8.0‰鹽度下，溫度為20、28和32℃時(shí)羅氏沼蝦肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均高于24℃，且溫度為28和32℃時(shí)HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于20℃。脅迫48h后，溫度為28和32℃或鹽度為8.0‰與12.0‰時(shí)，HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均較脅迫24h時(shí)明顯增加；溫度為24和28℃時(shí)，8.0‰和12.0‰鹽度下HSP70基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于0.5‰與4.0‰鹽度。雙因素方差分析結(jié)果（表3）表明，溫度、鹽度及其交互作用對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺組織HSP70基因表達(dá)均有極顯著影響。

2.2急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦抗氧化酶活性的影響

2.2.1急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦鰓組織抗氧化酶活性的影響如圖3所示，脅迫24h時(shí)，在相同溫度下，羅氏沼蝦鰓組織SOD活性隨著鹽度升高整體呈上升趨勢(shì)，并在鹽度為12.0‰時(shí)達(dá)最大值（除溫度為32℃時(shí)），在鹽度為0.5‰時(shí)為最小值；在相同鹽度下，羅氏沼蝦鰓組織SOD活性隨著溫度升高整體呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，溫度為20、28和32℃時(shí)羅氏沼蝦鰓組織SOD活性均較24℃明顯升高，且溫度為28和32℃時(shí)SOD活性均顯著高于20℃，表明溫度驟升較溫度驟降更能引起羅氏沼蝦SOD活性升高；脅迫48h后，溫度為28和32℃且鹽度為0.5‰或4.0‰時(shí)，羅氏沼蝦腮組織SOD活性較脅迫24 h時(shí)明顯升高，而溫度為28和32℃且鹽度為8.0‰或12.0‰時(shí)，羅氏沼蝦腮組織SOD活性較脅迫24h時(shí)明顯降低。由圖4可知，脅迫24h時(shí)，在溫度為28℃且鹽度為8.0‰時(shí)羅氏沼蝦鰓組織GPX活性達(dá)最大值，高于其他處理組；在相同鹽度下，隨著溫度的升高，羅氏沼蝦腮組織GPX活性整體呈上升趨勢(shì)；在相同溫度下，羅氏沼蝦腮組織GPX活性隨著鹽度升高整體呈上升趨勢(shì)，除溫度為32℃時(shí)，其余溫度下GPX活性最大值均出現(xiàn)在鹽度為8.0‰和12.0‰時(shí)。脅迫48h后，隨著鹽度和溫度的升高，羅氏沼蝦腮組織GPX活性變化趨勢(shì)與脅迫24 h時(shí)相同，且相同鹽度下，溫度為24、28和32℃時(shí)GPX活性均高于脅迫24 h時(shí)。由雙因素方差分析結(jié)果（表4）可知，溫度、鹽度及其交互作用對(duì)羅氏沼蝦鰓組織的SOD和GPX活性均有極顯著影響。

2.2.2急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺組織抗氧化酶活性的影響如圖5所示，脅迫24h時(shí)，在相同鹽度下，羅氏沼蝦肝胰腺組織SOD活性隨溫度升高整體呈上升趨勢(shì)，溫度為32℃且鹽度為8.0‰時(shí)，羅氏沼蝦肝胰腺組織SOD活性明顯高于其他處理組；在溫度為24℃時(shí)，隨著鹽度升高，羅氏沼蝦肝胰腺組織SOD活性無顯著變化（Pgt;0.05，下同），溫度為20和28℃時(shí)SOD活性隨著鹽度升高先下降后上升，溫度為32℃時(shí)SOD活性隨著鹽度升高先下降后上升再下降。脅迫48h后，溫度為28和32℃且鹽度為0.5‰或4.0‰時(shí)，羅氏沼蝦肝胰腺組織SOD活性較脅迫24 h時(shí)明顯升高。由圖6可知，脅迫24 h時(shí)，溫度為32℃且鹽度為4.0‰時(shí)羅氏沼蝦肝胰腺組織GPX活性達(dá)最大值，高于其他處理組；在溫度為24℃時(shí)，隨著鹽度升高，羅氏沼蝦肝胰腺組織GPX活性無顯著變化，在其他溫度下，羅氏沼蝦肝胰腺組織GPX活性隨著鹽度升高呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；當(dāng)鹽度相同時(shí)，羅氏沼蝦肝胰腺組織GPX活性隨著溫度升高呈先下降后上升的變化趨勢(shì)。脅迫48 h后，溫度為28和32℃且鹽度為0.5‰或4.0‰時(shí)，羅氏沼蝦肝胰腺組織GPX活性較脅迫24h時(shí)明顯升高；隨著溫度和鹽度的變化，羅氏沼蝦肝胰腺組織GPX活性的變化趨勢(shì)整體與脅迫24 h時(shí)相同；在相同鹽度下，溫度為28和32℃時(shí)羅氏沼蝦肝胰腺組織GPX活性均顯著高于20和24℃。雙因素方差分析結(jié)果（表5）表明，溫度、鹽度以及其交互作用對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺SOD和GPX活性均有極顯著影響。

3討論

3.1急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦熱休克蛋白基因表達(dá)的影響

HSP70是熱休克蛋白家族中最主要的一類蛋白，其表達(dá)量受生物體抗逆性的影響（王亞男等，2012）。水體溫度是影響水生生物生理活動(dòng)與行為的主要因素，當(dāng)水體溫度發(fā)生持續(xù)或劇烈變化時(shí)，水生生物體內(nèi)HSP70基因的表達(dá)量也隨之增加，使其能更好地適應(yīng)外部環(huán)境變化，避免自身機(jī)體受損（王夢(mèng)潔等，2021）。本研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)羅氏沼蝦HSP70基因相對(duì)表達(dá)具有極顯著影響，脅迫24h時(shí)，在0.5‰和4.0‰鹽度下，低溫（20℃）和高溫（28和32℃）時(shí)羅氏沼蝦鰓組織和肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均高于初始溫度（24℃）。在對(duì)其他水生生物的研究中，翟書華等（2022）發(fā)現(xiàn)日本沼蝦熱休克同源蛋白70-3基因表達(dá)量在高溫脅迫24h時(shí)達(dá)最大值，隨后降低又再升高；張晨光等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，翹嘴鱖（Sinipercachuatsi）幼魚HSP70α基因表達(dá)受急性高溫脅迫后持續(xù)上調(diào)，于脅迫12 h時(shí)達(dá)最高值，隨后快速下調(diào)，HSP70基因相對(duì)表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長整體呈先升高后下降的變化趨勢(shì)。有研究表明，鹽度脅迫能誘導(dǎo)水生生物熱休克蛋白基因的表達(dá)（蔣雨露，2020）。徐群等（2017）研究結(jié)果表明，鼠尾藻（Sargassum thunbergii）HSP70基因的表達(dá)受鹽度脅迫影響。于姍姍（2012）研究發(fā)現(xiàn)，刺參（Apostichopus japonicus）生長最適鹽度為25‰～30‰，隨著鹽度從30‰持續(xù)下降，刺參HSP70基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)鹽度下降至20‰時(shí)刺參HSP70基因表達(dá)量較30‰鹽度顯著升高，表明低鹽環(huán)境可能更強(qiáng)烈地刺激HSP70基因表達(dá)，從而幫助刺參更有效地應(yīng)對(duì)鹽度變化。此外，在對(duì)脊尾白蝦（Exopal-aemon carinicauda）（沈盎綠等，2014）、三疣梭子蟹（覃燁和許強(qiáng)華，2012）、金烏賊（Sepia esculenta）（王興強(qiáng)等，2020）等水生生物的研究中也發(fā)現(xiàn)，鹽度的升高或降低會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)正常調(diào)節(jié)平衡被打破，在脅迫初期HSP70基因表達(dá)量上升，隨著鹽度脅迫時(shí)間的延長HSP70基因表達(dá)量下降。本研究發(fā)現(xiàn)，脅迫24 h時(shí)，在相同溫度下，隨著鹽度的升高，羅氏沼蝦鰓組織和肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均整體呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；當(dāng)水溫為初始溫度（24℃）時(shí)，鹽度脅迫48 h后，高鹽（8.0‰和12.0‰）下羅氏沼蝦鰓組織和肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于低鹽（0.5‰和4.0‰）。表明當(dāng)水中鹽度發(fā)生變化，HSP70基因在機(jī)體應(yīng)激時(shí)在生物細(xì)胞中充當(dāng)分子伴侶的角色，通過對(duì)變性蛋白的降解促使新生多肽鏈折疊合成，幫助生物體加速自身細(xì)胞修復(fù)（徐群等，2017），從而使羅氏沼蝦能適應(yīng)變化后的鹽度，提高了對(duì)環(huán)境的耐受性。

此外，亢玉靜等（2015）研究表明，西藏?cái)M溞（Daphniopsis tibetana）HSP70基因在不同溫度下對(duì)鹽度變化的響應(yīng)有較大差異，在高溫條件下（25和28℃），HSP70基因表達(dá)量顯著高于低溫條件（16℃）。在低溫時(shí)，HSP70基因表達(dá)量隨著鹽度升高變化不明顯，而在高溫時(shí)，高鹽（12.0‰）下HSP70基因表達(dá)量顯著高于低鹽（0.5‰和4.0‰），表明高溫放大了鹽度對(duì)HSP70基因表達(dá)的調(diào)控作用，可能是由于高溫與高鹽聯(lián)合脅迫對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了更強(qiáng)的應(yīng)激壓力。與單因素脅迫試驗(yàn)相比，雙因素脅迫試驗(yàn)更能考察因素間交互作用的影響。本研究雙因素方差分析結(jié)果表明，溫度和鹽度的交互作用對(duì)羅氏沼蝦HSP70基因表達(dá)量有極顯著影響；脅迫48h后，在低溫（20℃）下，隨著鹽度的升高，羅氏沼蝦鰓組織和肝胰腺組織HSP70基因相對(duì)表達(dá)量的變化較小，而在溫度為24和32℃時(shí)，高鹽（8.0‰和12.0‰）下羅氏沼蝦鰓組織HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于低鹽（0.5‰與4.0‰），在溫度為24和28℃時(shí)，高鹽（8.0‰和12.0‰）下羅氏沼蝦肝胰腺組織HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于低鹽（0.5‰與4.0‰）；脅迫24 h時(shí)，0.5‰和4.0‰鹽度下，高溫（28或32℃）時(shí)羅氏沼蝦HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均高于低溫（20℃），表明溫度驟升較溫度驟降更能誘導(dǎo)羅氏沼蝦HSP70基因表達(dá)，與亢玉靜等（2015）的研究結(jié)果相似，可能是由于20℃是羅氏沼蝦耐受溫度臨界值，低溫抑制了相關(guān)mRNA合成。在溫度和鹽度急性脅迫對(duì)刺參影響的研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，鹽度變化后，與低溫處理相比，高溫處理下刺參腔液滲透壓變化速度更快，且相較鹽度脅迫，溫度脅迫對(duì)熱休克蛋白表達(dá)的影響更為顯著（Wang et al.，2014）。王亞男等（2012）研究馬氏珠母貝（Pinctada martensii）外套膜HSP70基因在不同溫度和鹽度下的表達(dá)情況，結(jié)果表明溫度和鹽度均能引起馬氏珠母貝外套膜HSP70基因的過量表達(dá)，且溫度效應(yīng)大于鹽度效應(yīng)。本研究結(jié)果與上述前人研究結(jié)果相似，溫度變化能影響鹽度脅迫下羅氏沼蝦HSP70基因的表達(dá)，而鹽度變化也能影響溫度脅迫下羅氏沼蝦HSP70基因的表達(dá)。

3.2急性溫度和鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦抗氧化酶作用的影響

溫度和鹽度等環(huán)境因素直接影響水生生物的生長發(fā)育。當(dāng)水體溫度發(fā)生變化時(shí)，生物機(jī)體的自由基代謝會(huì)發(fā)生紊亂，使自由基在機(jī)體中大量積累，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和正常生理機(jī)能受損，并引起其他理化指標(biāo)的變化，加劇機(jī)體受損（吳倉倉等，2019）。SOD在生物體中參與新陳代謝，對(duì)清除機(jī)體自由基具有重要作用。機(jī)體中的O2-受SOD催化轉(zhuǎn)化為H2O2，但H2O2的生成也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體遭受一定氧化損傷，故機(jī)體還需依靠GPX將體內(nèi)多余或過量的H2O2予以清除（趙文和王巧晗，2005）。有研究表明，GPX和CAT以相互補(bǔ)充和競爭的關(guān)系共同在抗氧化酶系統(tǒng)中發(fā)揮作用（楊福元等，2022）。本研究結(jié)果表明，脅迫24 h時(shí)，在相同鹽度下，隨著溫度的升高，羅氏沼蝦鰓組織SOD活性整體呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，腮組織GPX活性整體呈上升趨勢(shì)，肝胰腺組織SOD活性整體呈上升趨勢(shì)，肝胰腺組織GPX活性呈先下降后上升的變化趨勢(shì)；且在低鹽（0.5‰和4.0‰）下，高溫（28和32℃）脅迫48 h后，羅氏沼蝦鰓組織和肝胰腺組織SOD及GPX活性均高于脅迫24 h時(shí)。與黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）（陳自強(qiáng)等，2020）、翹嘴鱖（張晨光等，2021）等魚類的相關(guān)研究結(jié)果稍有差異，但均能表明SOD和GPX等抗氧化酶活性隨著溫度升高或降低存在一定協(xié)同作用?？梢?，當(dāng)溫度升高時(shí)，羅氏沼蝦產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，隨著機(jī)體受逆境脅迫程度的增加，體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧增多，為使體內(nèi)自由基保持平衡，羅氏沼蝦會(huì)通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的抗氧化酶活性，提高清除活性氧自由基的能力。鹽度對(duì)水生生物的影響主要體現(xiàn)在生物體對(duì)體內(nèi)滲透壓與離子濃度的調(diào)節(jié)方面（邢錢錢，2022）。羅氏沼蝦是一種能進(jìn)行低滲調(diào)節(jié)的淡水蝦，調(diào)節(jié)機(jī)制較為簡單。李江濤等（2021）研究不同鹽度（0‰、4‰、8‰和12‰）下羅氏沼蝦能量代謝與運(yùn)動(dòng)能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦個(gè)體耗氧率、丙酮酸脫氫酶活性和細(xì)胞色素C氧化酶活性均隨著鹽度的升高而增加，表明鹽度升高時(shí)羅氏沼蝦的呼吸代謝隨之增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，初始溫度（24℃）下鹽度脅迫24 h時(shí)，隨著鹽度的升高，羅氏沼蝦肝胰腺組織SOD和GPX活性均無顯著變化，而在其他溫度下，SOD和GPX活性隨著鹽度升高出現(xiàn)明顯變化，說明溫度的改變能影響抗氧化酶對(duì)鹽度的敏感性，且溫度對(duì)抗氧化酶活性的影響大于鹽度。

4結(jié)論

急性溫度和鹽度脅迫會(huì)引起羅氏沼蝦HSP70基因相對(duì)表達(dá)量升高，且溫度驟升較溫度驟降更能誘導(dǎo)HSP70基因表達(dá)。溫度和鹽度驟變能引起羅氏沼蝦抗氧化酶活性變化，且溫度對(duì)抗氧化酶活性的影響大于鹽度。羅氏沼蝦通過調(diào)控HSP70基因相對(duì)表達(dá)量、SOD活性及GPX活性協(xié)同調(diào)節(jié)生理機(jī)能以適應(yīng)外部鹽度和溫度變化，增強(qiáng)對(duì)惡劣環(huán)境的耐受性。

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（責(zé)任編輯 劉可丹）