UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析清肺湯抗肺炎活性作用機(jī)制

〔摘要〕 目的 采用UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清肺湯抗肺炎的作用機(jī)制。方法 通過UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS法進(jìn)行分析，鑒定清肺湯的主要化學(xué)成分，結(jié)合Swisstarget收集清肺湯主要化學(xué)成分的作用靶點(diǎn);利用OMIM、DrugBank及GeneCards等數(shù)據(jù)庫獲取“肺炎”的相關(guān)靶點(diǎn)，并與清肺湯化學(xué)成分靶點(diǎn)取交集篩選出共同靶點(diǎn)，通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及GO、WikiPathways通路富集分析確定清肺湯治療肺炎的重要信號(hào)通路。結(jié)果 通過UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS從清肺湯中鑒別出142種活性成分，獲得200個(gè)清肺湯成分與肺炎交集靶點(diǎn)，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)后獲取了44個(gè)潛在有效成分和131個(gè)肺炎關(guān)鍵靶點(diǎn)。KEGG通路富集分析表明，清肺湯通過MAPK3信號(hào)通路、EGFR信號(hào)通路、LCK信號(hào)通路等多種信號(hào)通路以及白細(xì)胞介素-5（interleukin-5， IL-5）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2， IL-2）和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）等多靶點(diǎn)發(fā)揮抗肺炎的作用。結(jié)論 清肺湯中的活性成分可通過多通路、多靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抗病毒感染和改善肺纖維化的作用，從而起到治療肺炎的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS;清肺湯;肺炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制

〔中圖分類號(hào)〕R284.1" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.019

Analysis of the mechanism of action of Qingfei Decoction's"anti-pneumonia activity by UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS"combined with network pharmacology

WANG Junshuai1，2， WANG Xueyi1，2， WANG Xueying1，2， LIU Zhenyin1，2， ZHAO Zhenxia2，"LIU Yongli2*， LI Hui2*

1. School of Pharmacy， Henan University， Kaifeng， Henan 475000， China; 2. Hebei Institute for Drug and Medical Device Inspection， Shijiazhuang， Hebei 050227， China

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of action of Qingfei Decoction's anti-pneumonia activity using UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS and network pharmacology. Methods The major chemical components of Qingfei Decoction were analyzed and identified by UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS. Targets of the identified components were collected using Swisstarget; pneumonia-related targets were retrieved from OMIM， DrugBank， and GeneCards databases. Common targets between the identified components of Qingfei Decoction and pneumonia were screened by taking their intersection. Protein-protein interaction （PPI） network construction and GO/WikiPathways enrichment analyses were performed to identify key signaling pathways involved in Qingfei Decoction's treatment of pneumonia. Results A total of 142 active ingredients were identified from Qingfei Decoction by UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS， yielding 200 intersecting targets between the ingredients and pneumonia. Network construction identified 44 potential effective components and 131 key pneumonia-related targets. KEGG pathway enrichment analysis indicated that Qingfei Decoction exerted its anti-pneumonia effects through multiple signaling pathways， including the MAPK3 signaling pathway， EGFR signaling pathway， and LCK signaling pathway， as well as multiple targets such as interleukin-5 （IL-5）， interleukin-2 （IL-2）， and thymic stromal lymphopoietin （TSLP）. Conclusion The active ingredients in Qingfei Decoction can exert therapeutic effects against pneumonia via multi-pathway and multi-target mechanisms， including immune regulation， anti-inflammatory action， modulation of apoptosis， antiviral effects， and mitigation of pulmonary fibrosis.

〔Keywords〕 UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS; Qingfei Decoction; pneumonia; network pharmacology; mechanism of action

肺炎是指由病毒、細(xì)菌、化學(xué)污染物等因素引起的疾病，涉及肺泡、肺間質(zhì)及肺葉部位的炎性病變，在老年與幼兒人群高發(fā)，末期可引發(fā)敗血癥及呼吸衰竭[1]。臨床肺炎的治療包括抗感染治療、對(duì)癥治療、支持治療及并發(fā)癥治療[2-3]。抗感染治療是肺炎治療的主要環(huán)節(jié)之一，治療的藥物主要包括抗生素、抗病毒藥物和抗真菌藥物等，但該類藥物在臨床應(yīng)用中易產(chǎn)生耐藥性和不良反應(yīng)[4-5]。因此，從中藥中尋找治療肺炎新藥意義重大。

清肺湯出自《萬病回春·咳嗽門》，是明朝龔?fù)①t用于治療咳嗽的經(jīng)典名方。清肺湯為《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》收載的湯劑之一，其由黃芩、桔梗、茯苓、橘紅和貝母等15味中藥組成，原文記載“清肺湯治一切咳嗽，上焦痰盛”[6]?？偨Y(jié)古籍及文獻(xiàn)中關(guān)于清肺湯功效主治的記載，其功效為清肺化痰止咳，臨床常用于治療支氣管炎、慢性支氣管炎、肺炎、肺結(jié)核、慢性咽炎、支氣管喘息、心臟性喘息等病癥[7-8]。現(xiàn)代藥理作用研究表明，清肺湯可有效改善肺炎患者的血液生化、病理影像學(xué)指標(biāo)，具有依從性好、用藥周期短、副作用小等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。但其治療肺炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確，因此，對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行闡釋有利于指導(dǎo)其臨床用藥。

中藥復(fù)方起效機(jī)制研究的復(fù)雜性主要體現(xiàn)在成分組成、生物學(xué)效應(yīng)兩個(gè)方面，而網(wǎng)絡(luò)藥理研究模式可以有序地將藥物化學(xué)、藥理學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科與系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析相結(jié)合，從基因分布、分子功能和信號(hào)通路等角度解釋中藥復(fù)方如何通過多組分影響多通路、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，該研究模式特別適合中藥復(fù)方作用機(jī)制的闡釋[11]。本研究通過UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS對(duì)清肺湯中化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探尋清肺湯治療肺炎的主要有效成分和作用機(jī)制，以期在分子層面上闡釋清肺湯多成分、多途徑和多靶點(diǎn)發(fā)揮抗肺炎作用的科學(xué)內(nèi)涵，為其治療肺炎的臨床應(yīng)用提供參考，同時(shí)為其深入的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1" 試藥與試劑

當(dāng)歸（批號(hào)：DGYP-2，產(chǎn)地：甘肅岷縣）2.61 g、梔子（批號(hào)：ZZYP-10，產(chǎn)地：福建福鼎）2.61 g、桔梗（批號(hào)：JGYP-3，產(chǎn)地：河北安國）3.73 g、黃芩（批號(hào)：HQYP-6，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古赤峰）5.60 g、麥冬（批號(hào)：MDYP-5，產(chǎn)地：四川三臺(tái)縣）2.61 g、甘草（批號(hào)：GCYP-6，產(chǎn)地：新疆庫爾勒博湖縣）1.12 g、苦杏仁（批號(hào)：KXRYP-7，產(chǎn)地：河北懷來）2.61 g、五味子（批號(hào)：WWZYP-11，產(chǎn)地：遼寧新賓）1 g、茯苓（批號(hào)：FLYP-11，產(chǎn)地：安徽岳西）3.73 g、橘紅（批號(hào)：JHYP-5，產(chǎn)地：湖南常德）3.73 g、浙貝母（批號(hào)：ZBMYP-11，產(chǎn)地：浙江寧波）3.73 g、桑白皮（批號(hào)：SBPYP-13，產(chǎn)地：重慶石柱）3.73 g、天冬（批號(hào)：TDYP-12，產(chǎn)地：重慶石柱）2.61 g、生姜（批號(hào)：SJYP-02，產(chǎn)地：云南文安縣）2 g、大棗（批號(hào)：DZYP-06，產(chǎn)地：新疆若羌縣）6 g，所用飲片經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)任廣喜講師鑒定為正品，且經(jīng)檢驗(yàn)均符合《中華人民共和國藥典》（2020年版）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求。水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）;乙腈（質(zhì)譜級(jí)，德國Merck公司）;甲酸（質(zhì)譜級(jí)，美國Sigma公司）。

1.2" 儀器

Vanquish Horizon型超高效液相色譜儀、UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific公司）;BT25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;JM-B10002型電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）;KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;LC-10N-50A型臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)（上海力辰儀器科技有限公司）;Milli-Q型超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1" 清肺湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉的制備

處方各藥飲片粉碎為過4目篩不過10目篩的粗顆粒，10倍水浸泡30 min，先用1 200 W武火煮沸，后轉(zhuǎn)600 W火繼續(xù)煎煮45 min，趁熱以200目濾除藥渣，收集濾液，真空冷凍干燥（Tlt;-40 ℃，Vaclt;20 Pa）60 h。

2.2" 基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的清肺湯化學(xué)成分鑒定研究

2.2.1" 色譜條件" 色譜柱為Waters Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）;流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脫（0～5 min，5%→7%B;5～15 min，7%→15%B;15～25 min，15% →18%B;25～45 min，18%→20%B;45～55 min，20%→25%B;55～65 min，25%→75%B;65～70 min，75% →95%B）;流速為0.3 mL·min-1;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.2" 質(zhì)譜條件" HESI采用正、負(fù)離子掃描模式，噴霧電壓為3.5 kV;毛細(xì)管溫度為320 ℃，輔助氣溫度為400 ℃;掃描范圍為m/z 100～1 000;Full MS、dd-MS2分辨率分別為7×104、1.75×104;S-lens RF level為55;輔助氣流速為10 arb，鞘氣流速為35 arb;NCE為30、35、40。

2.2.3" 供試品溶液制備" 精密稱取清肺湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉0.2 g，精密加入25 mL 75%甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理20 min（250 W，40 kHz），75%甲醇補(bǔ)足失重量，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.4" 數(shù)據(jù)采集與分析" 首先將供試品溶液按照“2.1.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)行質(zhì)譜分析，利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（human metabolome database，HMDB）和MassBank數(shù)據(jù)庫（https：//massbank.eu/）收集關(guān)于清肺湯的相關(guān)內(nèi)容，構(gòu)建清肺湯成分自建庫，根據(jù)分子量、碎片離子、不同種類化合物的化學(xué)鍵斷裂規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)資料，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)來對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

2.3" 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的清肺湯治療肺炎作用機(jī)制研究

2.3.1" 清肺湯中主要活性成分和靶標(biāo)蛋白篩選" 根據(jù)UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的鑒定結(jié)果，設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%且類藥性（drug likeness， DL）≥0.18為篩選條件，建立清肺湯的主要有效成分?jǐn)?shù)據(jù)庫并得到相關(guān)作用靶點(diǎn)信息。

2.3.2" 肺炎靶點(diǎn)的收集和清肺湯抗肺炎的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測" 通過Swiss target（http：//www.swisstargetprediction.ch/）對(duì)“2.2.1”中清肺湯化學(xué)成分組的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，規(guī)范名稱、去除重復(fù)項(xiàng)，得到清肺湯活性成分的作用靶點(diǎn)組。進(jìn)一步在OMIM（https：//www.omim.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/，relevance scoregt;1）和PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫，以“pneumonia”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索、規(guī)范名稱并去除重復(fù)項(xiàng)，得到肺炎相關(guān)的作用靶點(diǎn)，并與預(yù)測得到的清肺湯活性成分的作用靶點(diǎn)組取交集并繪制韋恩圖，以得到清肺湯治療肺炎的潛在作用靶點(diǎn)。

2.3.3" 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和“化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建" 將“2.2.2”中得到的清肺湯治療肺炎的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5（https：//cn.string-db.org），限定物種為“Homo sapiens”，將篩選后的結(jié)果保存為“TSV”格式，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件（https：//www.cytoscape.org/）對(duì)其進(jìn)行可視化，以“String Physical Scoregt;0.132，Network Sizegt;3”為條件，使用Cytoscape的MCODE功能對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。并利用Cytoscape軟件完成“化合物-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

2.3.4" 基因本體富集分析" 通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）和WikiPathways數(shù)據(jù)庫（https：//www.wikipathways.org/index.php/WikiPathways）對(duì)得到的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，輸入潛在作用靶點(diǎn)并限制物種為人，得到的分析結(jié)果以Plt;0.05為指標(biāo)進(jìn)行篩選。使用R語言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理，分析得到清肺湯治療肺炎的作用機(jī)制。

3 結(jié)果

3.1" 基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的清肺湯化學(xué)成分分析

清肺湯正、負(fù)離子掃描模式的總離子流圖見圖1，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Xcalibur 4.1中的Qual Browser程序，調(diào)取MS離子并模擬分子式，結(jié)合MS2碎片離子、數(shù)據(jù)庫（Massbank of North America、MassBank Europe）及文獻(xiàn)共鑒定出142個(gè)化合物，其中黃酮及其苷類成分占比較大。其中92個(gè)化合物可明確其歸屬，其詳細(xì)信息見表1。

3.2" 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的清肺湯治療肺炎作用機(jī)制研究

3.2.1" 清肺湯中活性成分和靶標(biāo)蛋白篩選" 符合條件OB≥30%，DL≥0.18的化合物共有44個(gè)，其中甘草中活性成分12種，黃芩中活性成分9種，且篩選得到的活性成分多屬于黃酮類成分及其衍生物，通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取活性成分的sdf格式分子結(jié)構(gòu)，通過SwissTargetPrediction平臺(tái)預(yù)測得到對(duì)應(yīng)靶標(biāo)550個(gè)。

3.2.2" 肺炎疾病靶點(diǎn)和清肺湯治療肺炎潛在靶點(diǎn)" 利用OMIM、DrugBank、GeneCards和PharmGKB數(shù)據(jù)庫檢索得到肺炎相關(guān)靶點(diǎn)1 508個(gè)，通過Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）平臺(tái)將清肺湯主要化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與肺炎疾病靶點(diǎn)取交集，得到200個(gè)清肺湯治療肺炎的潛在靶點(diǎn)，詳見圖2。

3.2.3" “化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析" 利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建的化學(xué)成分-靶點(diǎn)交互網(wǎng)絡(luò)見圖3。通過分析篩選到的關(guān)鍵化合物有44個(gè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)有131個(gè)。其中排名前10位的化合物是6-姜酚、五味子醇甲、五味子酯乙、10-姜酚、槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷、5，7，8-三羥基黃酮、甘草苷;排名前5的靶點(diǎn)是IL-5、EGFR、LCK、TNF、MAPK3，見表2和表3。由圖3可知，1個(gè)活性化合物可對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)起作用，與此同時(shí)也存在多個(gè)成分對(duì)1個(gè)靶點(diǎn)起作用，體現(xiàn)了清肺湯多成分和多靶點(diǎn)相互協(xié)同治療肺炎的特點(diǎn)。

3.2.4" 清肺湯治療肺炎潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建" 利用Metascape平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)平臺(tái)MCODE算法分析得5個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)大于3的顯著聚類簇，見圖4。由圖4可知，包含130個(gè)節(jié)點(diǎn)和104 1條邊。靶蛋白的平均節(jié)點(diǎn)等級(jí)值為30，超過平均節(jié)點(diǎn)等級(jí)值的有50個(gè)。篩選出前5個(gè)節(jié)點(diǎn)度值的靶點(diǎn)蛋白，分別是IL-2、MAPK14、NFKB1、PIK3R1、NTRK1，揭示其可能是清肺湯治療肺炎的主要作用靶點(diǎn)。

3.2.5" GO富集分析" 通過DAVID網(wǎng)站中的GO富集分析得到了GO條目（Plt;0.05），其中包含465個(gè)生物過程（biological process， BP）條目，143個(gè)分子功能（molecular function， MF）條目和98個(gè)細(xì)胞組分（cell composition， CC）條目，對(duì)各聚類簇的代表?xiàng)l目（-log10

P值降序排名前3者）進(jìn)行展示，結(jié)果如圖5所示。在BP中靶點(diǎn)主要涉及正向調(diào)節(jié)外部刺激反應(yīng)（positive regulation of response to external stimulus）、酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路（enzyme linked receptor protein signaling pathway）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、趨化性（chemotaxis）及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路（cytokine-mediated signaling pathway）等。在MF中靶點(diǎn)主要涉及磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、C-C趨化因子受體活性（C-C chemokine receptor activity）及C-C趨化因子結(jié)合（C-C chemokine binding）等。在CC中靶點(diǎn)主要涉及分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、囊泡腔（vesicle lumen）、膜面（side of membrane）及質(zhì)膜外側(cè)（external side of plasma membrane）等。

3.2.6" WikiPathways通路富集" 經(jīng)WikiPathways富集分析后，對(duì)各聚類簇的代表?xiàng)l目（-log10P值降序排名前3者）進(jìn)行展示，結(jié)果如圖6所示，主要包括白細(xì)胞介素-5（interleukin-5， IL-5）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2， IL-2）信號(hào)通路、胸腺基質(zhì)淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）信號(hào)通路及抑瘤素M（oncostain M， OSM）信號(hào)通路，這些信號(hào)通絡(luò)可能是清肺湯治療肺炎的主要作用靶點(diǎn)。

4 討論

清肺湯由黃芩、桔梗和茯苓等共15味藥材組成，方中黃芩配伍梔子使二者清肺熱、解熱毒的作用增強(qiáng);苦杏仁與天門冬和麥冬配伍，增強(qiáng)止咳平喘作用的同時(shí)又強(qiáng)化潤肺的作用，緩解肺部燥熱;桔梗配伍甘草，使止咳化痰作用增強(qiáng);貝母配伍苦杏仁和甘草，增強(qiáng)化痰止咳、潤肺平喘的作用，貝母配伍黃芩，增強(qiáng)黃芩清熱解毒和貝母潤肺止咳的作用，貝母與桔梗配伍，起到宣肺平喘、化痰止咳的作用;茯苓與當(dāng)歸配伍，起到調(diào)血益氣、活血化瘀的作用，茯苓與甘草配伍，起到益氣健脾、祛痰濕的作用;桑白皮與黃芩配伍，增強(qiáng)黃芩清熱涼血解毒的作用;橘紅與甘草配伍，使和中化濕、行氣止痛的作用增強(qiáng)，橘紅配伍生姜，使二者化痰止咳的作用增強(qiáng)，全方共奏養(yǎng)陰清肺、宣肺止咳、燥濕化痰功效[37-38]。

本研究首先使用UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS技術(shù)獲取清肺湯的成分信息，初步鑒別142個(gè)結(jié)構(gòu)，包括黃酮及其苷類74個(gè)、氨基酸類12個(gè)、小分子有機(jī)酸類12個(gè)、木脂素類7個(gè)、生物堿類6個(gè)、三萜類5個(gè)、環(huán)烯醚萜類5個(gè)、苯酞類4個(gè)、香豆素類3個(gè)、核苷類3個(gè)、姜酚類2個(gè)、酯類2個(gè)、醛類2個(gè)、苯乙醇苷類1個(gè)、二苯乙烯苷類1個(gè)、氫苷類1個(gè)、甾體皂苷類1個(gè)、多酚類1個(gè)，較為全面地反映了復(fù)方的成分信息，其潛在活性成分包括五味子醇甲、黃芩素、槲皮素、6-姜酚及漢黃芩素等。黃芩素可明顯緩解炎癥和降低炎性因子水平，減輕肺組織水腫和病理損傷，顯著降低肺炎球菌性肺炎小鼠死亡率，其主要通過下調(diào)肺組織中NF-κB和p38 MAPK在mRNA水平的表達(dá)，以發(fā)揮抗炎作用[39]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制病毒的復(fù)制，減輕肺部炎癥，降低感染小鼠死亡率和肺指數(shù)，對(duì)感染流感病毒的小鼠亦有治療作用[40]，同時(shí)槲皮素可通過減少氧化應(yīng)激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和下調(diào)活性氧介導(dǎo)的下游信號(hào)通路等方式，發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎和抗病毒等藥理作用[41]。漢黃芩素具有較強(qiáng)抑制炎癥反應(yīng)的作用，通過減輕流感病毒感染后的過度免疫應(yīng)答反應(yīng)而減輕肺組織細(xì)胞損傷，能夠緩解病毒性肺炎的炎性損傷，達(dá)到治療肺炎的作用[42]。

WikiPathways通路富集及聚類簇歸屬顯示，治療靶標(biāo)組主要干預(yù)人體的IL-2信號(hào)通路、IL-5信號(hào)通路、胸腺基質(zhì)淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）信號(hào)通路及抑瘤素M（oncostain M， OSM）信號(hào)通路。肺部發(fā)生感染或損傷時(shí)，引起復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)IL-2、IL-5等促炎因子過度釋放時(shí)，形成炎性細(xì)胞爆發(fā)，毛細(xì)血管的通透性改變，致大量內(nèi)毒素蛋白進(jìn)入肺泡，肺泡表面被破壞，病情急劇惡化[43]。因此在治療肺炎中，及時(shí)抑制此類促炎因子過度表達(dá)尤為重要。通過調(diào)控IL-2信號(hào)通路和IL-5信號(hào)通路減輕肺部炎癥反應(yīng)，從而降低肺泡上皮細(xì)胞的凋亡率，達(dá)到保護(hù)肺組織，防治肺二次損傷的作用[44]。TSLP參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)，可以促進(jìn)慢性疾病和過敏性炎癥，調(diào)控TSLP信號(hào)通路，在免疫反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，減輕過敏，促進(jìn)機(jī)體的恢復(fù)[45]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS系統(tǒng)探究清肺湯治療肺炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，研究結(jié)果表明清肺湯中五味子醇甲、黃芩素、6-姜酚及漢黃芩素等活性成分作用于MAPK3、EGFR、LCK信號(hào)通路的IL-5、IL-2和TSLP等關(guān)鍵靶標(biāo)，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抗病毒感染和改善肺纖維化的作用，從而起到治療肺炎的作用。本研究初步探明經(jīng)典名方清肺湯治療肺炎的物資基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為經(jīng)典名方的新藥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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〔基金項(xiàng)目〕河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2022329003）。

〔通信作者〕*李" 揮，男，博士，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：lihui7171@163.com;劉永利，男，碩士，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：liuyongli2008@126.com。