利用LC-MS/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討丹黃明目湯對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在治療作用

〔摘要〕 目的 探討丹黃明目湯對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）的潛在治療作用。方法 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）技術(shù)檢測(cè)丹黃明目湯入血成分。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析丹黃明目湯的藥效成分及其治療DR的關(guān)鍵通路及潛在靶點(diǎn)。將60只大鼠隨機(jī)分為未造模組（24只）和造模組（36只）。將24只未造模組大鼠分為空白組（等體積生理鹽水）、空白給藥組（等體積生理鹽水+1.25 g/kg丹黃明目湯浸膏），每組12只。造模組腹腔一次性注射40 mg/kg鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）聯(lián)合高脂飼養(yǎng)建立DR模型后，分為模型組（40 mg/kg STZ）、陽(yáng)性對(duì)照組（40 mg/kg STZ+羥苯磺酸鈣膠囊0.09 g/kg）、丹黃明目湯樣本組（40 mg/kg STZ+1.25 g/kg丹黃明目湯浸膏），每組12只，連續(xù)干預(yù)4周。生化試劑盒檢測(cè)超氧化物歧化酶（superoxidedismutase， SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase， CAT）的活性;ELISA檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-6和血清炎癥因子IL-1β的水平;Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase， p38 MAPK）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2， ERK1/2）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 LC-MS/MS結(jié)果表明，丹黃明目湯中共檢測(cè)到347個(gè)入血化合物，其中前7個(gè)含量較高的入血代謝物分別為1，7-bis（4-hydroxyphenyl）heptan-3-one、5-hydroxy-2，2-dimethyl-10-（2-methylbut-3-en-2-yl）pyrano[3，2-g]chromen-8-one、5，7，4'-Trimethoxyflavone、Cillin、Deacetylto mentosideI、canescinA CanescinA、VentiloquinoneI。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，丹黃明目湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號(hào)通路、緊密連接和趨化因子信號(hào)通路等關(guān)鍵生物通路的多靶點(diǎn)干預(yù)DR。與空白組相比，模型組SOD、CAT水平及p38 MAPK、ERK1/2總蛋白表達(dá)降低（Plt;0.05，Plt;0.01），TNF-α、IL-6、IL-1β水平及p38 MAPK、ERK1/2磷酸化水平升高（Plt;0.05，Plt;0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、空白給藥組和丹黃明目湯樣本組的SOD、CAT、TNF-α、IL-6、IL-1β水平及p38 MAPK、ERK1/2磷酸化水平降低（Plt;0.05，Plt;0.01）。結(jié)論 丹黃明目湯可通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路抑制p38 MAPK等因子的表達(dá)和活性，促進(jìn)SOD和CAT的表達(dá)，從而減輕DR的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管損傷，最終起到治療DR的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 糖尿病視網(wǎng)膜病變;丹黃明目湯;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;抗炎;抗氧化;p38絲裂原活化蛋白激酶;超氧化物歧化酶;過(guò)氧化氫酶

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.018

Exploring the potential therapeutic effects of Danhuang Mingmu Decoction on diabetic retinopathy through LC-MS/MS and network pharmacology

GUO Xinyi1， HUANG Longrong1， GUO Yonghong3， CHEN Xiangdong1，2*， FU Meilin1，2*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;"2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hengyang Municipal Hospital of Chinese Medicine， Hengyang， Hunan 421000， China

〔Abstract〕 Objective To explore the potential therapeutic effects of Danhuang Mingmu Decoction （DHMMD） on diabetic retinopathy （DR）. Methods Liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） was employed to identify the absorbed components of DHMMD in the blood. The pharmacological components of DHMMD and their key pathways and potential targets for treating DR were analyzed using network pharmacology. Sixty rats were randomized into a non-model group （n=24） and a model induction group （n=36）. The 24 rats in the non-model group were subdivided into blank group （equal volume of normal saline） and blank treatment group （equal volume of normal saline+DHMMD extract 1.25 g/kg）， with 12 rats in each group. After establishing the model by a single intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ） 40 mg/kg combined with a high-fat diet， the 36 rats in the model induction group were subdivided into model group （STZ 40 mg/kg）， positive control group （STZ 40 mg/kg+calcium hydroxyl sulfonate capsule 0.09 g/kg）， and DHMMD sample group （STZ 40 mg/kg+DHMMD extract 1.25 g/kg）， with 12 rats in each group. The intervention lasted for four weeks. The activity of superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） was determined using biochemical kits. The rat serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-6， and the inflammatory cytokine IL-1β were measured by ELISA. The protein expression levels of p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK） and extracellular regulated protein kinases 1/2 （ERK1/2） in rat retinal tissues were examined by Western blot. Results The LC-MS/MS revealed that a total of 347 compounds of DHMMD were examined in the blood after administration， with the first seven metabolites with higher content checked in the blood being 1，7-bis （4-hydroxyphenyl） heptan-3-one， 5-hydroxy-2，2-dimethyl-10-（2-methylbut-3-en-2-yl） pyrano[3，2-g] chromen-8-one， 5，7，4'-Trimethoxyflavone， Cillin， Deacetylto mentosideI， canescinA CanescinA， and VentiloquinoneI. The network pharmacology revealed that DHMMD might intervene in DR through multi-target regulation of key biological pathways such as the mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway， tight junctions， and chemotaxis factor signaling pathway. Compared with the blank group， the levels of SOD and CAT， as well as the total protein expressions of p38 MAPK and ERK1/2 in the model group decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）， while the levels of TNF-α， IL-6， and IL-1β， as well as the phosphorylation levels of p38 MAPK and ERK1/2 increased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the model group， the levels of SOD， CAT， TNF-α， IL-6， and IL-1β， as well as the phosphorylation levels of p38 MAPK and ERK1/2 decreased in the positive control， blank treatment， and DHMMD sample groups （Plt;0.05， Plt;0.01）. Conclusion DHMMD can inhibit the expression and activity of factors such as p38 MAPK by regulating the MAPK signaling pathway， promote the expression of SOD and CAT， thereby reducing the inflammatory response， oxidative stress， and vascular damage in DR， and ultimately play a therapeutic role in DR.

〔Keywords〕 diabetic retinopathy; Danhuang Mingmu Decoction; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; anti-inflammation; anti-oxidation; p38 mitogen-activated protein kinase; superoxide dismutase; catalase

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，早期發(fā)現(xiàn)并干預(yù)可預(yù)防失明的發(fā)生[1]。隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，幾乎所有1型糖尿病患者和超過(guò)60%的2型糖尿病患者在確診后20年內(nèi)會(huì)發(fā)展為DR[2]。盡管目前有多種治療方法，但這些方法都存在局限性。激光治療可能會(huì)導(dǎo)致視野縮小和夜視問(wèn)題;抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治療雖然有效，但需要定期重復(fù)注射，且可能引發(fā)眼內(nèi)炎癥或感染;而糖皮質(zhì)激素的長(zhǎng)期使用可能增加患白內(nèi)障和青光眼的風(fēng)險(xiǎn);晚期玻璃體手術(shù)有眼內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。

中醫(yī)藥是中國(guó)傳統(tǒng)文化和醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在糖尿病等慢性病的治療中有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[5-7]。中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，成分之間以及藥物與人體之間的相互作用也極為復(fù)雜，探究中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及有效成分變得尤為重要[8-9]。丹黃明目湯是陳向東教授依據(jù)養(yǎng)陰清熱、活血利水的治法研制而成的臨床驗(yàn)方。本課題組成員通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，丹黃明目湯可通過(guò)降低VEGF表達(dá)、保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）和改善氧化應(yīng)激反應(yīng)等改善DR，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中也證實(shí)了本方對(duì)DR具有明顯的療效[10]。

本研究運(yùn)用代謝組學(xué)對(duì)丹黃明目湯入血代謝物的變化進(jìn)行分析，深入了解其在分子水平上的作用機(jī)制，闡明丹黃明目湯在緩解DR方面的復(fù)雜代謝作用，以期為DR患者制定更有效的治療策略。

1 材料

1.1" 主要試劑

甲醇、乙腈、甲酸（中國(guó)Abiowell公司，批號(hào)分別為130100-201903、130103-202203、101414-201902）;鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）（北京克爾慧科技有限公司，批號(hào)：242-648-8）;p38抗體、ERK1/2抗體、山羊抗兔二抗（中國(guó)Abiowell公司，批號(hào)分別為20A231106、09G240126、06G240902）;腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-6、IL-1β試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)分別為Q19036889、U21036309、U20036308）。

1.2" 主要儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）;全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：PW-812、MB-530）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)：DHP-500）;電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（中國(guó)北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）;超高效液相、高分辨質(zhì)譜、離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：Vanquish、Q Exactive Focus、Heraeus Fresco17）;天平（Sartorius公司，型號(hào)：BSA124S-CW）;研磨儀（上海凈信科技有限公司，型號(hào)：JXFSTPRP-24）;純水儀（Merck Millipore公司，型號(hào)：明澈 D24 UV）;超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司，型號(hào)：YM-080S）。

1.3" 動(dòng)物準(zhǔn)備

本研究于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：ZYFY20231210-001）。SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，2月齡，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供（動(dòng)物合格證編號(hào)：430727241100059528）。飼養(yǎng)環(huán)境：飲食符合清潔級(jí)動(dòng)物的衛(wèi)生質(zhì)量要求，環(huán)境溫度21～27 ℃，濕度45%～50%，每12小時(shí)光暗交換，墊料每2天更換一次。

1.4" 藥物制備

丹黃明目湯藥材：生地黃15 g（批號(hào)：HY22081502），茯苓15 g（批號(hào)：CK22082302），牡丹皮15 g（批號(hào)：MG22082302），丹參15 g（批號(hào)：TH22082302），黃連10 g（批號(hào)：PR22080503），車(chē)前子10 g（批號(hào)：HQ22080103），麥冬10 g（批號(hào)：HQ22082201），白茅根10 g（批號(hào)：20210501）。飲片均購(gòu)于長(zhǎng)沙新林制藥有限公司。

取處方量，加10倍水量浸泡1 h，煎煮6 h，紗布過(guò)濾，加8倍水量煎煮4 h，合并2次濾液，真空濃縮干燥，得浸膏。稱(chēng)取適量浸膏，蒸餾水溶解，即得。使用前，用生理鹽水稀釋至適宜濃度，根據(jù)人與大鼠體表面積的等效劑量[11]計(jì)算得到灌胃浸膏劑量為1.25 g/kg。

2 方法

2.1" 代謝物提取

2.1.1" 血清樣本制備" 將12只大鼠隨機(jī)分為空白血清組（6只）和含藥血清組（6只），分別予以等體積蒸餾水、丹黃明目湯（1.25 g/kg）連續(xù)灌胃7 d。采用3%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈采血，30 ℃自然放置2 h。待血液表面有淡黃色液體滲出時(shí)，放入低溫離心機(jī)中，在4 ℃以5 000 r/min離心5 min（離心半徑：15 cm）后取上清液。取400 μL空白血清組及含藥血清組血漿，分別加入40 μL鹽酸（2 mol/L），混勻后渦旋振蕩4 min，靜置15 min后加入1.6 mL乙腈，以12 000 r/min離心5 min（離心半徑：8.6 cm）。取1 800 μL上清液，揮干溶劑，加入150 μL甲醇復(fù)溶殘?jiān)?.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，平行3次，將樣品準(zhǔn)備好放入-80 ℃冰箱。

2.1.2" 中藥浸膏樣本制備" 將丹黃明目湯浸膏放于冰上解凍，渦旋30 s后，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min（離心半徑：8.6 cm）。取上清液300 μL轉(zhuǎn)移至新鮮試管中，加入10 μg/mL內(nèi)標(biāo)的提取液1 000 μL，冰水浴超聲處理5 min。樣品在-40 ℃下放置1 h后，在4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心15 min（離心半徑：8.6 cm）。上清液通過(guò)0.22 μm微孔膜仔細(xì)過(guò)濾，保存于-80 ℃，以待超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS）分析。

2.2" LC-MS/MS檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理

2.2.1" 色譜條件" LC-MS/MS分析采用UHPLC系統(tǒng)，色譜柱規(guī)格為1.7 μm×2.1 mm×100 mm。樣品進(jìn)樣量設(shè)置為5 μL，流速設(shè)定為0.5 mL/min，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈溶液（B）。梯度洗脫程序?yàn)椋?～11 min，85%～25%A;11～12 min，25%～2%A;12～14 min，2%～2%A;14～14.1 min，2%～85%A;14.1～15 min，85%～85%A;15～16 min，85%～85%A。

2.2.2" 質(zhì)譜條件" 質(zhì)譜儀在控制軟件Xcalibur 2.2控制下基于FullScan-ddMS2功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)如下。鞘氣流量：45 Arb，輔助氣流量：15 Arb，毛細(xì)管溫度：400 ℃，全掃描質(zhì)譜分辨率：70 000，串聯(lián)質(zhì)譜分辨率：17 500，碰撞能量：1/30/45（歸一化碰撞能量模式），噴霧電壓：4.0 kV（正離子模式）或-3.6 kV（負(fù)離子模式）。

通過(guò)XCMS軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入XCMS軟件中。進(jìn)行一系列數(shù)據(jù)處理步驟，包括保留時(shí)間的矯正，峰的識(shí)別、提取和積分，峰的對(duì)齊。通過(guò)利用自建的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及相應(yīng)的裂解規(guī)律匹配法，對(duì)包含MS/MS數(shù)據(jù)的峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

2.3" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

本研究利用質(zhì)譜將中藥入血成分進(jìn)行代謝組學(xué)分析，從生物活性分子數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/）和傳統(tǒng)中醫(yī)免疫腫瘤學(xué)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// http：//tcmio.xielab.net）查詢(xún)代謝物的作用靶點(diǎn)，選取口服生物利用度≥30%，類(lèi)藥性≥0.18的代謝物。從人類(lèi)基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）以及中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.symmap.org）中獲取DR疾病治療靶點(diǎn)。將入血成分作用靶點(diǎn)、疾病治療靶點(diǎn)的結(jié)果以韋恩圖表示。將測(cè)得的代謝物差異表達(dá)基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的各節(jié)點(diǎn)映射，并利用GO（http：//www.geneontology.org/）進(jìn)行功能富集分析。靶點(diǎn)蛋白按照生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3種獨(dú)立的方式進(jìn)行分類(lèi)展示。通過(guò)KEGG對(duì)靶點(diǎn)蛋白顯著富集的代謝通路進(jìn)行分析，以氣泡圖的形式展示靶點(diǎn)蛋白通路富集分析結(jié)果。運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（string-db.org）構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析圖。具體操作如下：首先將靶點(diǎn)蛋白輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，然后選擇Homosapiens（human）選項(xiàng)以查詢(xún)PPI關(guān)系，進(jìn)而構(gòu)建出靶點(diǎn)蛋白的PPI圖。針對(duì)檢測(cè)入血成分匹配作用靶點(diǎn)前50的入血成分與其作用靶點(diǎn)，構(gòu)建復(fù)方藥材-入血成分-作用靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驗(yàn)證

2.4.1" 造模及模型驗(yàn)證" 將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為未造模組（24只）和造模組（36只）。未造模組腹腔注射生理鹽水，造模組腹腔一次性注射40 mg/kg STZ。STZ的配制方法如下：將STZ溶解在0.1 mmol新鮮檸檬酸緩沖液中（pH=4.5），使其濃度為1%。注射STZ后72 h，血糖儀監(jiān)測(cè)大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG檢測(cè)前1天，大鼠禁食12 h以上，尾靜脈采血1 mL，用血糖儀檢測(cè)并記錄。連續(xù)3次FBGgt;16.7 mmol/L，即提示糖尿病大鼠造模成功。采用高脂飼料喂養(yǎng)糖尿病大鼠，造模12周后，熒光素血管造影（fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA）觀察大鼠眼底出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血、血管迂曲、微血管瘤等，表明DR大鼠造模成功[10]。

2.4.2" 動(dòng)物分組及給藥" 將24只未造模組大鼠分為空白組（等體積生理鹽水）、空白給藥組（等體積生理鹽水+1.25 g/kg丹黃明目湯浸膏），36只造模組大鼠分為模型組（40 mg/kg STZ）、陽(yáng)性對(duì)照組（40 mg/kg STZ+羥苯磺酸鈣膠囊0.09 g/kg）、丹黃明目湯樣本組（40 mg/kg STZ+1.25 g/kg丹黃明目湯浸膏），以上5組，每組12只，共干預(yù)4周。

2.4.3" 生化及ELISA試劑盒檢測(cè)" 腹主動(dòng)脈取血，室溫自然凝固30 min，3 000 r/min離心15 min（離心半徑：15 cm），取上清液，按照生化及ELISA試劑盒步驟檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織SOD、CAT、TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

2.4.4" Western blot檢測(cè)VEGF、MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)" 取-80 ℃保存的6只大鼠左眼球，分離出視網(wǎng)膜組織，裂解、提取總蛋白，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。在4 ℃下加入一抗p38 MARK（1∶1 000）、ERK1/2（1∶500）和GAPDH（1∶3 000）孵育過(guò)夜，清洗。在4 ℃下加入山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。用ECL發(fā)光顯影，觀察拍照，用ImageJ軟件處理分析各條帶灰度值。

2.4.5" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析" 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以“x±s”表示。兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組及以上的統(tǒng)計(jì)分析則采用單因素方差分析（ANOVA）配合Tukey事后多重比較檢驗(yàn)。不滿(mǎn)足正態(tài)性時(shí)，使用非參數(shù)檢驗(yàn)，Plt;0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 血清藥物化學(xué)分析結(jié)果

共檢測(cè)到347個(gè)入血化合物，其中前7個(gè)含量較高的入血代謝物分別為1，7-bis（4-hydroxyphenyl）heptan-3-one、5-hydroxy-2，2-dimethyl-10-（2-methylbut-3- en-2-yl）pyrano[3，2-g]chromen-8-one、5，7，4'-Trimethoxyflavone、Cillin、Deacetylto ment?osideI、canescinA CanescinA、VentiloquinoneI。詳見(jiàn)表1。

3.2" 入血成分分析結(jié)果

空白血清組的代謝物總數(shù)為2 944，丹黃明目湯浸膏組代謝物總數(shù)為3 048，含藥血清組代謝物的總數(shù)為3 058。3組的共有代謝物總數(shù)為2 545?？瞻籽褰M有7個(gè)入血成分，含藥血清組有6個(gè)入血成分，丹黃明目湯浸膏組有8個(gè)入血成分。詳見(jiàn)表2、圖1。

3.3" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

測(cè)得丹黃明目湯藥物有效靶點(diǎn)為115個(gè)，DR疾病靶點(diǎn)為2 583個(gè)，共有73個(gè)交集靶點(diǎn)。靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析結(jié)果提示，丹黃明目湯的主要作用靶點(diǎn)為p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、VEGF、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）等。靶點(diǎn)蛋白的GO注釋富集分析結(jié)果顯示：BP的富集結(jié)果主要為對(duì)凋亡信號(hào)通路、活性氧物種代謝過(guò)程、氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控及蛋白質(zhì)、肽酰酪氨酸修飾及磷酸化;CC的富集結(jié)果表明，靶點(diǎn)主要在核周、跨膜受體、細(xì)胞膜筏及核染色質(zhì)等區(qū)域;MF結(jié)果顯示，靶點(diǎn)蛋白主要通過(guò)生長(zhǎng)因子、輔因子結(jié)合，催化氧化還原反應(yīng)，催化磷酸化、去磷酸化反應(yīng)等功能調(diào)控機(jī)體。KEGG結(jié)果顯示，丹黃明目湯活性成分可能通過(guò)多種癌癥相關(guān)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)與信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用。詳見(jiàn)圖2。

代謝物-靶點(diǎn)-GO通路互作網(wǎng)絡(luò)圖及代謝物-靶點(diǎn)-KEGG互作網(wǎng)絡(luò)圖顯示，丹黃明目湯的主要代謝物有黃芩苷、黃芩素、黃芪苷、葛根素等黃酮類(lèi)化合物，靶點(diǎn)主要有p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB、VEGF、PI3K/AKT等，主要涉及絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、緊密連接信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等。詳見(jiàn)圖3。

丹黃明目湯活性成分主要包括槲皮素、山柰酚、黃連堿、丹參酸、多糖類(lèi)等。作用機(jī)制主要為抗氧化作用、抗炎作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)識(shí)別出丹黃明目湯活性成分作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，包括TNF-α、IL-6、IL-1β、p38 MAPK、ERK1/2、VEGF等，它們與多個(gè)其他蛋白相連，在疾病進(jìn)程中起核心調(diào)控作用。詳見(jiàn)圖4。

3.4" 丹黃明目湯對(duì)DR大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

3.4.1" 抗氧化酶SOD和CAT的活性" 與空白組相比，模型組的SOD和CAT水平降低（Plt;0.05）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、空白給藥組和丹黃明目湯樣本組的SOD和CAT水平升高（Plt;0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，空白給藥組、丹黃明目湯樣本組的SOD和CAT水平降低（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表3。

3.4.2" 炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平" 與空白組相比，模型組的TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（Plt;0.05）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、空白給藥組和丹黃明目湯樣本組的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均降低（Plt;0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，空白給藥組、丹黃明目湯樣本組的TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表3。

3.5" 丹黃明目湯對(duì)DR大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2和ERK1/2的蛋白表達(dá)水平的影響

與空白組相比，模型組中p-p38 MAPK、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平上調(diào)（Plt;0.01），p38 MAPK、ERK1/2的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（Plt;0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、空白給藥組、丹黃明目湯樣本組的p-p38 MAPK、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（Plt;0.01），p38 MAPK、ERK1/2的蛋白表達(dá)水平上調(diào)（Plt;0.01）。詳見(jiàn)表4、圖5。

4 討論

本研究利用XCMS軟件處理LC-MS/MS數(shù)據(jù)，進(jìn)行代謝物的檢測(cè)和定量。XCMS通過(guò)高效的數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括峰檢測(cè)、峰對(duì)齊和峰整合，確保了數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和可重復(fù)性。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)識(shí)別了與丹黃明目湯成分相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，如MIF、MAPK1、AURKA、CSNK2A1等，這些蛋白在DR中發(fā)揮作用[12]。MAPK1參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和死亡的調(diào)節(jié)，其活化與炎癥、細(xì)胞凋亡和血管新生密切相關(guān)[13]。AURKA的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和血管異常[14]。MIF是巨噬細(xì)胞遷移抑制因子，是一種多功能的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和炎癥等過(guò)程中發(fā)揮作用[15]。

GO富集分析結(jié)果顯示，丹黃明目湯主要靶點(diǎn)包括ERK1/2、NF-κB、VEGF、PI3K/AKT等。這與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)密切相關(guān)[16-18]。KEGG通路分析結(jié)果提示，MAPK信號(hào)通路、緊密連接和趨化因子信號(hào)通路為關(guān)鍵通路，這些通路在細(xì)胞增殖、炎性反應(yīng)和細(xì)胞黏附中發(fā)揮作用，是DR的重要調(diào)控路徑。

p38 MAPK在調(diào)控DR過(guò)程中扮演非常重要的角色。DR與氧化應(yīng)激、炎癥和血管生成密切相關(guān)[19-20]。有研究表明，糖尿病引發(fā)的視網(wǎng)膜病變常常伴隨氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，導(dǎo)致p38 MAPK信號(hào)通路的活化，而p38 MAPK的激活會(huì)促進(jìn)ROS的生成，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷和功能障礙[21]。本研究結(jié)果提示，丹黃明目湯能顯著提升SOD、CAT抗氧化酶活性，減輕DR所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。這與丹參注射液聯(lián)合羥苯磺酸鈣通過(guò)上調(diào)抗氧化酶CAT和SOD的活性抑制DR所導(dǎo)致氧化應(yīng)激的研究[22]結(jié)果一致。p38 MAPK是炎癥信號(hào)通路的重要組成部分，p38 MAPK被激活時(shí)，會(huì)促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致微血管病變和視網(wǎng)膜損傷[21，23]。在本研究中，DR大鼠血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高，丹黃明目湯能有效降低這些促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)。這表明丹黃明目湯可能通過(guò)抑制p38

MAPK信號(hào)通路的激活從而發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用。研究報(bào)道，p38 MAPK可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)新生血管的形成，而新生血管較為脆弱，容易導(dǎo)致出血和視網(wǎng)膜水腫[21]。丹黃明目湯可以通過(guò)抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織p38 MAPK、ERK1/2的表達(dá)調(diào)控血管新生，這與組胺受體4通過(guò)調(diào)控p38 MAPK軸緩解糖尿病視網(wǎng)膜色素上皮中促VEGF和抗VEGF之間的不平衡研究[24]結(jié)果相類(lèi)似。這表明丹黃明目湯可通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎、抗氧化、保護(hù)細(xì)胞和調(diào)節(jié)血管生成的作用。

綜上所述，本研究探究了丹黃明目湯對(duì)DR的潛在治療作用。通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)分析了丹黃明目湯入血的主要成分。對(duì)差異代謝物結(jié)果進(jìn)行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)丹黃明目湯可以通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路、緊密連接完整性和趨化因子信號(hào)等多條信號(hào)通路影響DR的進(jìn)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹黃明目湯可以通過(guò)抑制p38-MAPK信號(hào)通路緩解DR所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、炎癥以及血管生成增加。但由于選用的數(shù)據(jù)庫(kù)有限，篩選方式及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在局限性，無(wú)法完全闡明丹黃明目湯的作用機(jī)制，在接下來(lái)的研究中，本課題組將通過(guò)進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)深入探究丹黃明目湯發(fā)揮藥效的具體分子機(jī)制，以期為DR的治療提供新的思路。

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〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82374525）;湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（C2022003）;湖南省眼科疾?。ㄖ嗅t(yī)）臨床醫(yī)學(xué)研究中心（2023SK4038）;湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021JJ30520）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目（2023CX39）。

〔通信作者〕*陳向東，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：564259166@qq.com;付美林，女，碩士，副教授，E-mail：neffy100@126.com。