當(dāng)歸芍藥散對(duì)糖尿病腎病db/db小鼠腸道菌群的作用

〔摘要〕 目的 研究當(dāng)歸芍藥散（Danggui Shaoyao San， DSS）對(duì)糖尿病腎病小鼠腸道菌群的作用。方法 選取30只8周齡雄性db/db小鼠，6只8周齡雄性db/m小鼠。檢測(cè)空腹血糖以及尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin to creatinine ratio， UACR），將符合要求的db/db小鼠隨機(jī)分成5組：模型（MOD）組（0.1 mL/10 g蒸餾水）、達(dá)格列凈（DAPA）組（1.3 mg/kg達(dá)格列凈片）及DSS低劑量（DSS-L）組（8.39 g/kg）、中劑量（DSS-M）組（16.77 g/kg）、高劑量（DSS-H）組（33.54 g/kg），每組6只;6只db/m小鼠為空白對(duì)照（CON）組（0.1 mL/10 g蒸餾水）。測(cè)定小鼠空腹血糖、胰島素耐量;ELISA法測(cè)定血尿素氮和血肌酐;全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)UACR;對(duì)小鼠的腎臟組織和小腸組織進(jìn)行HE染色;取小鼠結(jié)腸糞便進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。結(jié)果 與CON組比較，MOD組糖耐量下降，空腹血糖、血尿素氮、血肌酐、UACR升高（Plt;0.01）;與MOD組比較，DSS組的糖耐量升高（Plt;0.01），空腹血糖、血尿素氮、血肌酐、UACR降低（Plt;0.01），腎臟和小腸的病理?yè)p傷程度降低。腸道菌群多樣性研究結(jié)果顯示：相比CON組，MOD組腸道菌群多樣性降低;相比MOD組，DSS-M組與CON組的菌群差異性較小。在菌群的物種組成方面，DSS-M組小鼠嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）的相對(duì)豐度明顯增加（Plt;0.01）。結(jié)論 DSS能顯著增加糖尿病腎病db/db小鼠腸道中的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的豐度，可能是其改善糖尿病腎病的機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕 糖尿病腎病;當(dāng)歸芍藥散;腸道菌群;活血利水法;糖尿病;16S rRNA;中醫(yī)藥

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.005

Effects of Danggui Shaoyao San on the intestinal flora of db/db"mice with diabetic nephropathy

YANG Shiyao1， LI Hong1， LI Liu1， TAN Danni1， LIU Xiu1，2， XIANG Qin3， HUANG Qiuqing1，

ZOU Junju1， YU Rong1，2*

1. School of Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Prescription and Syndromes Translational Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Office of Science amp; Technology， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Danggui Shaoyao San （DSS） on the intestinal flora of mice with diabetic nephropathy （DN）. Methods Thirty 8-week-old male db/db mice and six 8-week-old male db/m mice were selected. Fasting blood glucose （FBG） and urinary albumin to creatinine ratio （UACR） were measured， and the qualified db/db mice were randomized into five groups： model （MOD） group （distilled water 0.1 mL/10 g）， dapagliflozin （DAPA） group （dapagliflozin tablets 1.3 mg/kg）， low-dose DSS （DSS-L） group （8.39 g/kg）， medium-dose DSS （DSS-M） group （16.77 g/kg）， and high-dose DSS （DSS-H） group （33.54 g/kg）， with six mice in each group. The six db/m mice served as the blank control （CON） group （distilled water 0.1 mL/10 g）. Then FBG and insulin tolerance in mice were measured. Blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （Scr） were measured by ELISA， and UACR was detected by fully automatic biochemical analyzer. Samples of the mouse renal and small intestinal tissues were taken for HE staining， and feces in the mouse colon was selected for 16S rRNA sequencing. Results Compared with the CON group， the MOD group had lower glucose tolerance and higher levels of FBG， BUN， Scr， and UACR （Plt;0.01）. Compared with the MOD group， the DSS group exhibited increased glucose tolerance （Plt;0.01）， decreased levels of FBG， BUN， Scr， and UACR （Plt;0.01）， and reduced pathological damage to the kidney and small intestine. The study on the intestinal flora diversity show that compared with the CON group， the MOD group had a lower diversity of intestinal flora. Compared with the MOD group， the flora differences between the DSS-M group and the CON group were smaller. In terms of the species composition of the flora， the relative abundance of Akkermansia muciniphila in the DSS-M group of mice was significantly higher （Plt;0.01）. Conclusions DSS can significantly increase the abundance of Akkermansia muciniphila in the intestines of db/db mice with DN， which may be one of the mechanisms by which it improves DN.

〔Keywords〕 diabetic nephropathy; Danggui Shaoyao San; intestinal flora; circulating blood and draining water retention; diabetes; 16S rRNA; Chinese medicine

糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）為糖尿病引發(fā)的全身微血管病變影響腎臟部位的并發(fā)癥，因糖代謝持久異常引起腎小球毛細(xì)血管基膜增厚，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化[1]。DN的病機(jī)多為陰虛燥熱、腎虛水泛，瘀血常為其重要的病理因素[2]。中藥對(duì)DN的保護(hù)和治療作用的相關(guān)研究逐年增多，涉及復(fù)方、單味中藥、中藥提取物及中藥活性化合物等[3]。當(dāng)歸芍藥散（Danggui Shaoyao San，DSS）是《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治第二十》中的名方，方由當(dāng)歸、芍藥、茯苓、澤瀉、白術(shù)、川芎6味藥組成。方中川芎、當(dāng)歸、芍藥補(bǔ)血祛瘀，當(dāng)歸、川芎并可疏利氣機(jī);茯苓、白術(shù)健脾益氣，合澤瀉淡滲利濕。全方氣、血、水同治，共奏補(bǔ)血活血、利水祛濕之功，與DN病機(jī)契合。有研究表明，DSS可能通過(guò)改善大鼠的氧化應(yīng)激水平或足細(xì)胞損傷減輕腎臟病理?yè)p傷[4-5]。DSS能有效改善DN患者的一系列臨床表現(xiàn)，如減少水腫、尿蛋白等[6-8]。

腸道菌群失調(diào)在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[9]。目前，以腸道菌群為靶點(diǎn)從中藥中尋找治療DN的單體成分與復(fù)方已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)新藥的新方向[10]。腸道菌群協(xié)助人體消化吸收的功能與中醫(yī)學(xué)脾主運(yùn)化相應(yīng)[11]。當(dāng)運(yùn)化功能失調(diào)時(shí)，人體代謝系統(tǒng)出現(xiàn)異常，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面影響。腎與脾的關(guān)系密切，腎精以稟賦先天之精為主，又賴以脾胃化生的后天之精滋養(yǎng)，腸道菌群的功能部分屬于脾的范疇，有學(xué)者將腸、腎的聯(lián)系總結(jié)為“腸-腎軸”[12]。為進(jìn)一步探索相關(guān)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究DSS對(duì)db/db小鼠的糖代謝、腎功能、腎臟及腸道病理?yè)p傷方面的影響，并對(duì)小鼠的腸道菌群進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析，以期尋找DSS改善DN的菌群靶點(diǎn)以及作用途徑。

1 材料與方法

1.1" 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性6周齡db/db小鼠（C57BLKS/J），體質(zhì)量（35±2） g，雄性6周齡db/m小鼠（C57BLKS/J），體質(zhì)量（23±2） g，均購(gòu)自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司，許可證號(hào)SCXK（蘇）2020-0009。將所有小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，動(dòng)物房保持恒定溫度（25±0.5） ℃和濕度（50%±5%）環(huán)境，均用普通飼料喂養(yǎng)，飼料由協(xié)同生物有限公司提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南執(zhí)行，倫理審批編號(hào)為L(zhǎng)L2023042602。

1.2" 藥物與主要試劑

從湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門(mén)診中藥房購(gòu)入當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、澤瀉、川芎，批號(hào)依次為T(mén)H22101801、TH22082301、CK22102401、2022083104、HY22092803、GW23031301。以《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治第二十》中原方比例（當(dāng)歸∶白芍∶茯苓∶白術(shù)∶川芎∶澤瀉=3∶16∶4∶4∶8∶8）稱取藥材共129 g。按db/db小鼠灌胃給藥6周時(shí)間計(jì)算所需的中藥藥材量，將所有藥材放入鍋中，倒入蒸餾水浸泡30 min后，倒入8倍蒸餾水煎煮30 min，倒出藥液，第二次加入6倍蒸餾水煎煮30 min，將兩次的藥液混合均勻，將濾液蒸發(fā)濃縮至含生藥量3 g/mL的DSS藥湯中，倒出放冷分裝，放置于4 ℃冰箱備用。

達(dá)格列凈片（規(guī)格：10 mg×14片，美國(guó)阿斯利康制藥公司，批號(hào)：H20170119）;氯化鈉注射液（規(guī)格：100 mL∶0.9 g，湖南科倫制藥有限公司，批號(hào)：H43020456）;50%葡萄糖溶液（規(guī)格：20 mL∶10 g，貴州天地藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20065510）;胰島素溶液（規(guī)格：10 mL∶400 U×2支，江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，批號(hào)：H10890001）。

肌酐比色法測(cè)試盒、尿素氮比色法測(cè)試盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：E-BC-K188-M、E-BC-K183-M）;4%多聚甲醛組織固定液、電鏡液、中性樹(shù)膠（蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)：BL539A、BL911A、BL704A）;二甲苯（AR級(jí)）、無(wú)水乙醇（AR級(jí)）（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：10023418、100092680）;蘇木素染液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)：G1004）;伊紅染液（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：YE2080）;鹽酸（AR級(jí)）（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：7647-01-0）。

1.3" 主要儀器

血糖儀及試紙（三諾生物傳感股份有限公司，型號(hào)：GA-3）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R、TDZ4-WS）;Spark多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司，型號(hào)：30086376）;超低溫冰箱（德國(guó)艾本德股份公司，型號(hào)：CryoCube F570）;超純水儀（威立雅水處理技術(shù)有限公司，型號(hào)：PURELAB Chorus 1 complete）;水浴鍋（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司，型號(hào)：SSW-420）;電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：YP1002N）。

1.4" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、分組及給藥

在動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，所有小鼠均喂食同樣的飼料和水，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)鼠連續(xù)兩日進(jìn)行空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后，使用實(shí)驗(yàn)室提供的代謝籠接取小鼠24 h尿液。尿液樣本在采集后2 h內(nèi)送檢，如未及時(shí)送檢，冷藏保存于4 ℃冰箱內(nèi)，避免尿液成分變質(zhì)或被破壞。對(duì)采集的尿液樣本進(jìn)行尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin to creatinine ratio，UACR）檢測(cè)后，將FBG≥11.1 mmol/L，且UACRgt;30 mg/g的db/db小鼠選入實(shí)驗(yàn)組，30只小鼠均造模成功。

采用隨機(jī)數(shù)字法將db/db小鼠分為5組，每組6只，分別為模型（MOD）組，DSS低劑量（DSS-L）、中劑量（DSS-M）、高劑量（DSS-H）組，達(dá)格列凈（DAPA）組。6只db/m小鼠為空白對(duì)照（CON）組。

按人和動(dòng)物間體表面積的等效劑量比值[13]換算，DSS-M組灌胃劑量為9.1×129 g/70 kg=16.77 g/kg，用3 g/mL的生藥液灌胃，灌胃體積0.06 mL/10 g;按1：2：4比例計(jì)算，DSS-L組和DSS-H組灌胃劑量分別為8.39、33.54 g/kg;達(dá)格列凈片按10 mg/d成人劑量換算，DAPA組灌胃劑量為1.3 mg/kg。MOD組與CON組按0.1 mL/10 g用蒸餾水灌胃。所有實(shí)驗(yàn)小鼠持續(xù)灌胃給藥6周，定時(shí)1 d/次。

1.5" FBG測(cè)定、胰島素耐量試驗(yàn)

每日觀察小鼠狀態(tài)。給鼠籠更換潔凈墊料后，斷食不斷水8 h，用血糖試紙采集尾端靜脈血后插入血糖儀，屏幕數(shù)值即FBG，每周測(cè)定一次。

灌胃結(jié)束時(shí)，確定小鼠身體狀況良好，再進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance test，ITT），更換潔凈墊料后，禁食不禁水，空腹3～5 h。0 min的血糖值，記為H0，按小鼠體質(zhì)量腹腔注射1 U/kg的胰島素溶液，開(kāi)始計(jì)時(shí)后，在30、60、90、120 min時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠血糖，分別記為H30、H60、H90、H120，畫(huà)出血糖曲線并計(jì)算葡萄糖曲線下面積（area under the curve， AUC），AUC值通過(guò)GraphPad Prism 9.5.0進(jìn)行計(jì)算。

1.6" UACR、BUN、Scr檢測(cè)

DN患者中，UACR、血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）指標(biāo)常病理性增高[14]。末次給藥后，將所有實(shí)驗(yàn)小鼠放入實(shí)驗(yàn)室提供的代謝籠中，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠24 h尿液中的UACR值。用肌酐比色法測(cè)試盒、尿素氮比色法測(cè)試盒檢測(cè)小鼠Scr、BUN。

1.7" 腎臟、小腸組織染色

麻醉小鼠后進(jìn)行眼眶取血，完成后迅速處死小鼠，取出腎臟和小腸后分別裝入EP管中，并放入4%多聚甲醛液固定。將腎臟和小腸組織按常規(guī)石蠟包埋制備4 μm組織切片，制作HE、Masson切片。

1.8" 小鼠腸道菌群16S rRNA測(cè)序與分析

CON組、MOD組和DSS-M組（前期生化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)DSS-M組療效較明顯，因此僅選擇DSS-M組進(jìn)行16S rRNA測(cè)序）小鼠的糞便樣本委托廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。使用基迪奧生物軟件進(jìn)行菌群多樣性、物種組成及差異分析。通過(guò)Sobs、Chao1、ACE和Shannon指數(shù)對(duì)小鼠腸道菌群進(jìn)行α多樣性分析。其中，Sobs指數(shù)表示檢測(cè)到的菌群操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）個(gè)數(shù);Chao1和ACE指數(shù)表示預(yù)測(cè)的菌群OTU個(gè)數(shù);Shannon指數(shù)綜合體現(xiàn)腸道菌群的豐富度和均勻度。選擇與DN密切相關(guān)的4個(gè)生化指標(biāo)FBG、BUN、Scr、UACR與CON組、MOD組和DSS-M組屬水平菌群的相對(duì)豐度進(jìn)行環(huán)境因子分析。使用冗余分析（redundancy analysis， RDA）展示環(huán)境因子、物種、樣本三者之間的關(guān)系。對(duì)選取的環(huán)境因子和菌屬進(jìn)行相關(guān)性分析，繪制Spearman相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖和相關(guān)性熱圖，從而得出環(huán)境因子和某個(gè)菌屬的相關(guān)密切程度。

1.9" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.5.0和SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果全部采用“x±s”表示。符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析方法進(jìn)行多重比較;不符合正態(tài)分布或方差齊性者，使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在腸道菌群16S rRNA基因測(cè)序中，使用qiime軟件進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析。在β多樣性分析中，基于樣本間的Jaccard距離，使用R語(yǔ)言vegan包，進(jìn)行非加權(quán)組平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）分析，將距離較小的樣本合并為一簇。使用R語(yǔ)言vegan包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）。使用R語(yǔ)言ropls包進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）。使用R語(yǔ)言labdsv包計(jì)算比較各物種在CON組、MOD組和DSS-M組之間的indicator value，并使用交叉驗(yàn)證進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，獲得P值，設(shè)置Plt;0.05為篩選閥值。使用PICRUSt2 2.5.1軟件比對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)腸道菌群的功能通路進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1" DSS對(duì)db/db小鼠基本情況的影響

灌胃給藥6周后，CON組小鼠飲食量、體質(zhì)量基本穩(wěn)定，皮毛順滑有光澤，大小便正常。與CON組比較，MOD組小鼠飲食量減少，體質(zhì)量顯著增加，行動(dòng)遲緩，皮毛油膩、脫毛，身體肥大。

2.2" DSS對(duì)db/db小鼠體質(zhì)量的影響

給藥前，與CON組比較，其余各組體質(zhì)量顯著上升（Plt;0.01）。給藥后，與MOD組比較，DSS-L組、DSS-M組、DSS-H組體質(zhì)量明顯降低（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3" DSS對(duì)db/db小鼠FBG和ITT的影響

給藥前，與CON組比較，其余各組FBG上升（Plt;0.01）。給藥后，與CON組比較，其余各組FBG、ITT-AUC明顯上升（Plt;0.01）;與MOD組比較，DAPA組、DSS-M組、DSS-H組FBG和ITT-AUC明顯降低（Plt;0.01），DSS-L組FBG降低（Plt;0.01）;與DAPA組比較，DSS-L組（Plt;0.01）和DSS-H組（Plt;0.05）的FBG增高，DSS-L組ITT-AUC增高（Plt;0.05）;與DSS-L組比較，DSS-M組的ITT-AUC降低（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.4" DSS對(duì)db/db小鼠UACR、Scr、BUN的影響

與CON組比較，MOD組UACR、Scr、BUN明顯升高（Plt;0.01）。與MOD組比較，DAPA組和DSS各組小鼠UACR、Scr、BUN均明顯下降（Plt;0.01）。詳見(jiàn)表3。

2.5" DSS對(duì)db/db小鼠腎臟、小腸組織病理?yè)p傷的影響

CON組小鼠腎小球及周?chē)I小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理變化。與CON組比較，MOD組小鼠中部分腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)異常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管球系膜細(xì)胞增生，毛細(xì)血管淤血，腎小管可見(jiàn)蛋白管型和白細(xì)胞管型，管腔內(nèi)可見(jiàn)均質(zhì)紅染的物質(zhì)和中性粒細(xì)胞，腎間質(zhì)中有大量慢性炎細(xì)胞和纖維組織。與MOD組比較，DSS組和DAPA組小鼠腎組織的病理?yè)p傷明顯減輕，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，血管球系膜細(xì)胞有輕微增生，毛細(xì)血管輕微淤血，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生。詳見(jiàn)圖1。

CON組小鼠小腸組織腸黏膜完整，腸絨毛形態(tài)完好、排列整齊，未見(jiàn)明顯病理變化。與CON組比較，MOD組小鼠的腸道結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，淋巴細(xì)胞增多，腸絨毛紊亂和碎裂，且絨毛高度萎縮變短，杯狀細(xì)胞明顯減少。與MOD組比較，DSS-L組、DSS-M組、DSS-H組以及DAPA組小鼠腸腺上皮細(xì)胞腫脹及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均有不同程度緩解，腸絨毛排列較整齊，杯狀細(xì)胞數(shù)量有所增加，以DSS-M組較為明顯。詳見(jiàn)圖2。

2.6" DSS對(duì)db/db小鼠腸道菌群的影響

2.6.1" DSS對(duì)db/db小鼠腸道菌群多樣性的影響" 根據(jù)α多樣性分析的Sobs、Chao1、ACE指數(shù)結(jié)果可知，與CON組比較，DSS-M組的菌群種類減少（Plt;0.05）;與MOD組比較，雖然DSS-M組有減少的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。從Shannon指數(shù)結(jié)果分析，與CON組和MOD組比較，DSS-M組的菌群豐富度和均勻度顯著下降（Plt;0.01）。

根據(jù)β多樣性分析結(jié)果可知，在UPGMA聚類樹(shù)中，CON組和DSS-M組的樣本處于同一枝;MOD組樣本均處于另一枝。PCoA和PLS-DA分析結(jié)果顯示，3組樣本分布于不同象限，分離趨勢(shì)明顯，且CON組和DSS-M組距離較近。詳見(jiàn)圖3。

2.6.2" DSS對(duì)db/db小鼠腸道菌群物種組成的影響

從門(mén)水平分析，與CON組比較，MOD組小鼠的擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobiota）的菌群相對(duì)豐度減少，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的相對(duì)豐度增加;與MOD組比較，DSS-M組逆轉(zhuǎn)了疣微菌門(mén)、厚壁菌門(mén)菌群相對(duì)豐度。此外，DSS-M組小鼠腸道疣微菌門(mén)菌群的相對(duì)豐度為35.26%，顯著高于CON組和MOD組（Plt;0.01）。從科水平分析，與CON組比較，MOD組小鼠的毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對(duì)豐度顯著增加，經(jīng)DSS干預(yù)后，毛螺菌科的豐度被逆轉(zhuǎn);與CON組和MOD組比較，DSS-M組小鼠鼠桿菌科（Muribaculaceae）相對(duì)豐度減少，而阿克曼氏菌科（Akkermansiaceae）顯著增加。從屬水平分析，與CON組比較，MOD組Lachnospiraceae_NK4A136_group的相對(duì)豐度明顯增加，經(jīng)DSS干預(yù)后，豐度被明顯逆轉(zhuǎn);與CON組和MOD組比較，DSS-M組的阿克曼氏菌屬（Akkermansia）的相對(duì)豐度顯著增加（Plt;0.01）。從種水平分析，與CON組和MOD組比較，DSS-M組的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）相對(duì)豐度顯著增加（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖4。

2.6.3" DSS對(duì)db/db小鼠腸道菌群指示物種的影響

本研究為尋找CON組、MOD組和DSS-M組間的差異菌群進(jìn)行線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size， LEfSe）比較（圖5A），展示不同組中豐度差異顯著的物種。CON組發(fā)現(xiàn)60個(gè)群落被選擇性富集，包括擬桿菌目（Bacteroidales）、擬桿菌門(mén)、擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌科（Muribaculaceae）、鼠乳桿菌（Lactobacillus_murinus）、產(chǎn)酸擬桿菌（Bacteroides_acidifaciens）、伯克霍爾德菌目（Burkholderiales）、薩特菌科（Sutterellaceae）、副薩特菌屬（Parasutterella）等。MOD組發(fā)現(xiàn)34個(gè)群落被選擇性富集，包括梭菌綱（Clostridia）、毛螺菌科、毛螺目（Lachnospirales）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、Prevotellaceae_UCG_001、Diaphorobacter、Diaphorob?acter_polyhydroxybutyrativorans。DSS-M組富集在阿克曼氏菌屬、疣微菌目（Verrucomicrobiales）、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）、阿克曼氏菌科、疣微菌門(mén)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、顫螺旋目（Oscillospirales）、產(chǎn)糞甾醇真桿菌科（Eubacterium_coprostanoligenes_group）、Christensenella、Akkermansia_sp_KLE1798等16個(gè)群落。以氣泡圖展示不同分類水平上各組的差異菌種，在門(mén)水平上，擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)和脫硫菌門(mén)（Desulfobacterota）是主要的差異物種;在種水平上，嗜黏蛋白阿克曼氏菌、鼠乳桿菌、產(chǎn)酸擬桿菌等是主要的差異菌群。詳見(jiàn)圖5B、5C。

2.6.3" DSS對(duì)db/db小鼠腸道菌群影響的KEGG通路富集分析" 結(jié)合KEGG功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)Level-2層級(jí)共有30種子功能類別，其中以代謝相關(guān)功能通路為主，共11條。將代謝相關(guān)通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異顯著的代謝通路包括糖代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、類脂化合物代謝、能量代謝、其他次生代謝物的生物合成、外源性生物降解和代謝、核苷酸代謝。詳見(jiàn)圖6。

2.6.4" 腸道菌群與FBG、BUN、Scr、UACR水平的相關(guān)性分析" RDA分析結(jié)果顯示，F(xiàn)BG、BUN、Scr、UACR的水平顯著影響各組小鼠的菌落組成（圖7A）。從相關(guān)性熱圖和網(wǎng)絡(luò)圖展現(xiàn)出的結(jié)果分析，在屬水平上，4種因子與菌群的相關(guān)關(guān)系較一致（圖7B、C）。FBG水平與副薩特菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_

group、Odoribacter呈負(fù)相關(guān)，與Lachnospiraceae_NK4?A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Prevotellace?ae_UCG-001呈正相關(guān);UACR與副薩特菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Odoribacter、Prevotellaceae_NK3B31_group、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）呈負(fù)相關(guān)，與Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Prevotellaceae_UCG-001呈正相關(guān);Scr、BUN與副薩特菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Odoribacter、Prevotellaceae_NK3B31_group、副擬桿菌屬（Parabacteroides）呈負(fù)相關(guān)，與Lachn?ospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006呈正相關(guān)。

3 討論

DSS除治療“腹中痛”外，還用于治療消化、腎臟系統(tǒng)等疾病[15]。針對(duì)DN水液內(nèi)停、腎絡(luò)瘀阻的病機(jī)特點(diǎn)[16]，可用活血利水方DSS治療。與CON組相比，MOD組小鼠體質(zhì)量、FBG、ITT-AUC、UACR、Scr、BUN顯著增高。與MOD組相比，DAPA組和DSS組上述指標(biāo)均顯著下降，且基于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相比于DSS，DAPA可能對(duì)db/db小鼠體質(zhì)量的影響較小。從病理?yè)p傷程度上分析，與MOD組相比，DSS組和DAPA組小鼠的腎組織和腸黏膜的結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。由上述結(jié)果可知，DSS能降低db/db小鼠血糖，保護(hù)其腎功能以及減輕腸道損傷。

本研究觀察到DSS-M組小鼠的α多樣性指數(shù)比MOD組更低，尤其是Shannon指數(shù)顯著下降，不排除DSS中含有抗菌活性成分從而導(dǎo)致DSS-M組小鼠的腸道菌群豐度下降。從DSS中的澤瀉中分離出來(lái)的23-乙酰澤瀉醇B等，表現(xiàn)出有效的抗菌活性，經(jīng)23-乙酰澤瀉醇B干預(yù)后的肥胖模型小鼠，與肥胖模型小鼠比較，其腸道菌群豐度也具有下降趨勢(shì)[17]。然而，在β多樣性分析中，三組表現(xiàn)出明顯的聚類分離，說(shuō)明雖然DSS-M組仍與MOD組有明顯差異，且與CON組接近，DSS仍可以部分糾正db/db小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)。在DSS對(duì)db/db小鼠腸道菌群物種組成的影響分析中發(fā)現(xiàn)，與MOD組相比，DSS能夠特異性增加嗜黏蛋白阿克曼氏菌的相對(duì)豐度。指示物種分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，阿克曼氏菌屬、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Odoribacter等是主要的差異菌屬;在種水平上，嗜黏蛋白阿克曼氏菌是最主要的差異菌。作為一種有益菌，有許多證據(jù)表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌豐度降低與肥胖、糖尿病、炎癥等多種疾病有關(guān)[18]。以上結(jié)果表明，DSS能顯著性增加有益菌嗜黏蛋白阿克曼氏菌的豐度，這可能與其改善DN的機(jī)制有關(guān)。

在功能分析中發(fā)現(xiàn)，MOD組小鼠與新陳代謝相關(guān)的通路顯著上調(diào)，主要是糖代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、類脂化合物代謝、能量代謝等通路，且在DSS-M組中部分逆轉(zhuǎn)。DN的發(fā)生發(fā)展與糖脂代謝紊亂密切相關(guān)[19]。而在屬水平的環(huán)境因子分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，副薩特菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Odoribacter等與db/db小鼠的FBG、BUN、Scr、UACR呈負(fù)相關(guān);Lachnospiraceae_NK4A136_gro?up、Lachnospiraceae_UCG-006等與上述指標(biāo)呈正相關(guān)。與環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)的可能是改善DN的有益菌屬，比如副薩特菌屬在人和小鼠腸膽汁酸維持和膽固醇代謝過(guò)程中發(fā)揮潛在作用[20]。Rikenellaceae_RC9_gut_group與參與短鏈脂肪酸吸收和代謝呈正相關(guān)[21]。Odoribacter的缺失可導(dǎo)致短鏈脂肪酸可用性降低[22]。

本研究?jī)H對(duì)db/db小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，尚未研究DSS與db/db小鼠腸道代謝產(chǎn)物的關(guān)系及其作用途徑。本課題組已對(duì)DSS對(duì)于DN小鼠的作用在轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面進(jìn)行了分析研究[23]，多組學(xué)聯(lián)合分析相比單一組學(xué)分析更能反應(yīng)機(jī)體物質(zhì)的代謝途徑，本課題組將進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，DSS在治療db/db小鼠方面表現(xiàn)出一定的療效，顯著增加嗜黏蛋白阿克曼氏菌的豐度可能是其改善DN的機(jī)制之一。

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〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U21A20411，82074400）;湖南省自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體項(xiàng)目（2024JJ1007）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)科建設(shè)“揭榜掛帥”項(xiàng)目（22JBZ002）;湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX20220778）。

〔通信作者〕*喻" 嶸，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：yurong@21.cn.com。