不同地點條件下玉米單倍體自然加倍及除草劑加倍效率

摘要：本研究探究了4個不同基礎材料單倍體在不同地點的自然加倍率，以及經過不同除草劑處理下的單倍體加倍效果之間的差異。結果表明，海南試驗點的自然加倍率要明顯高于吉林試驗點的自然加倍率，說明海南的氣候和光照等適宜的環(huán)境條件更有利于玉米單倍體的自然加倍，且不同品種的單倍體自然加倍率有很大差異，說明不同基礎材料由于遺傳背景的差異對加倍效果產生不同影響；化學除草劑加倍處理下，濃度為80 μmol·L-1炔苯酰草胺及60 μmol·L-1安磺靈的加倍效果最好，而高濃度安磺靈的加倍率明顯低于炔苯酰草胺；同為80 μmol·L-1炔苯酰草胺處理下的針刺生長點法的加倍率稍高于浸芽法的加倍率。

關鍵詞：玉米 單倍體 自然加倍 除草劑加倍玉米作為我國不可或缺的糧食作物，其新品種選育的迫切性有目共睹，然而常規(guī)的育種技術育種周期普遍較長，通常需要經過6-10代的自交才能選育出優(yōu)良的新品種[1]。單倍體育種技術在很大程度上規(guī)避了常規(guī)育種耗時長、消費高的弊端，做到高效又節(jié)省成本，通過兩代的培育就可以得到純合的自交系，并且該技術還能夠選育出具有植株高大、花期長、花粉量大、抗病蟲害等優(yōu)良性狀的新品種[2]。目前我國常規(guī)的育種技術已經實現在玉米育種行業(yè)的普及，但對玉米單倍體育種技術的研究起步較晚，與國外的發(fā)達國家依然存有差距。國外發(fā)達國家的某些種子公司已經建立了全面的單倍體育種體系，并能夠進行大規(guī)模的工廠化育種。但我國的一些育種公司與科研院所還無法達到規(guī)?；N。還存在著由于單倍體加倍率低導致玉米單倍體育種技術發(fā)展受阻的問題[3]。為推動單倍體育種技術的發(fā)展，突破發(fā)達國家的技術封鎖，單倍體加倍率低已成為各育種單位和育種家重點研究和攻克的方向。

玉米單倍體育種技術的自然加倍法能夠節(jié)約育種的成本，減輕對自然環(huán)境的危害，加倍環(huán)節(jié)簡單快捷，受到廣泛的青睞。玉米單倍體的化學加倍法使用最多的化學藥劑是秋水仙素，但秋水仙素具有較高的毒性，容易危害植株的生長發(fā)育甚至死亡并且處理程序煩瑣，也可能對環(huán)境造成污染，影響土壤和水源從而破壞生態(tài)環(huán)境和生態(tài)平衡[4]。為了玉米單倍體育種技術的發(fā)展和環(huán)境的保護，必須尋找安全的化學試劑，本研究主要使用的除草劑為安磺靈和炔苯酰草胺，這兩種除草劑與秋水仙素相似，同樣具有使單倍體加倍的效果，但目前對這兩種除草劑的研究相對較少。除這兩種除草劑之外，甲基胺草磷和氟樂靈也是常用于單倍體加倍的除草劑[5]。根據前人的研究表明，這四種除草劑雖然都具有抑制細胞分裂的效果，但每種除草劑的加倍效果不同，并且不同基礎材料誘導出的單倍體對不同除草劑的適應程度也不同[6]。

本研究不僅探索不同除草劑的加倍效果，對化學加倍的方法也進行了一定程度的研究。常用的化學加倍方法有浸芽法、浸根法、針刺生長點法及滴心葉法。本試驗采用的化學加倍方法是浸芽法和針刺生長點法。浸芽法是將玉米單倍體的幼芽浸泡在含有藥劑的溶液中，以促進其染色體加倍，而針刺生長點法是在單倍體幼苗的生長點處進行針刺處理，并配合使用藥劑處理，以實現染色體加倍。這兩種的原理與浸根法基本相似，但處理的目標不同，主要受處理時間的影響。滴心葉法是將藥劑溶液滴在單倍體玉米的心葉上，操作較為煩瑣。又有眾多研究表明，本試驗在吉林和海南兩地進行，分別采用自然加倍法和化學加倍法研究單倍體的加倍率。在化學加倍法中，使用炔苯酰草胺和安磺靈兩種除草劑，通過浸芽法和針刺生長點法測定不同除草劑和不同處理方法下的玉米單倍體加倍率，旨在探究更適合單倍體加倍的除草劑和處理方法，從而為培育新品種提供更有利的試驗條件，并為玉米單倍體育種提供理論依據。

一、材料與方法

（一）試驗材料

本試驗將4個單倍體品種的籽粒作為試驗材料進行玉米單倍體加倍試驗，分別是九單525、九單918、九單186和九單200。以上4個基礎材料為母本，吉科誘115為父本，在前一季玉米種植前進行單倍體誘導，收獲的單倍體籽粒為單倍體材料。由于本研究采用自然加倍法、浸芽法以及針刺生長點法三種試驗方法，所以將四種單倍體種子分為三組進行研究，分配種子時要進行隨機挑選，平均每組1000粒，以確保實驗的準確性和嚴謹性。而用于自然加倍的單倍體籽粒分為兩部分種植，一部分位于吉林省吉林市吉林農業(yè)科技學院吉林玉米育種試驗地（吉林試驗點）種植，另一部分位于海南省三亞市崖州區(qū)南濱農場的南繁基地試驗地（海南試驗點）進行種植。采用安磺靈和炔苯酰草胺兩種除草劑，使用浸芽法和針刺生長點法進行的除草劑加倍試驗均在吉林試驗點進行。安磺靈和炔苯酰草胺購自于長春百金生物科技有限公司。

（二）單倍體鑒定

使用籽粒Navajo標記鑒定，紫頂白胚的為單倍體籽粒。該方法是使用具有遺傳標記基因的誘導系進行單倍體誘導，將誘導系與基礎材料進行雜交，在單倍體籽粒中導入Navajo標記。正常二倍體籽粒為紫頂紫胚。田間苗期鑒定可以通過觀察玉米植株的生長情況，初步判斷玉米植株是否為單倍體。單倍體的葉鞘為綠色，并且葉片與正常二倍體不同，數量少、寬度狹窄、較為直立，在幼苗生長到4-5葉期時，通過觀察植株矮小瘦弱，生長勢弱的為單倍體，而正常二倍體幼苗的葉鞘為紫色，植株高大、生長勢強。

（三）單倍體加倍

自然加倍：在吉林試驗點和海南試驗點進行正常田間播種，使植株正常生長，并統(tǒng)一管理，當雄穗有花粉但花藥不開裂時人為破壞花藥，讓花粉散出進行自交授粉。

除草劑加倍：以濃度為2.5%的二甲基亞砜（DMSO）作為助滲劑，將安磺靈、炔苯酰草胺原液制成濃度分別為40、60、80和100 μmol·L-1 的溶液并將試劑瓶放置在陰暗避風處保存待用。以九單525和九單186作為除草劑處理對象。浸芽法：將種子浸泡6h，用毛巾卷發(fā)芽法30℃催根，待根尖長至1cm時，從毛巾卷中取出種子，降低溫度到24℃，將種子放入搪瓷盤中，噴水保持濕度，用薄膜密封催芽。當幼芽長至1.5cm時，將幼芽頂端芽鞘切掉1-2 mm，露出1個小口。將其在室溫下密閉浸泡在藥劑溶液中，浸泡后用清水沖洗60min，清洗后將其種在育苗盤中，幼苗長到4-5片葉時移栽至大田。生長期間進行數據調查、記錄和收集，秋季收獲自交果穗，計算加倍率。針刺生長點法：將上述準單倍體籽粒種植于田間，得到單倍體植株。待單倍體幼苗生長到三葉期時，選擇生長良好、一致的幼苗，分別用濃度為40、60、80和100 μmol·L-1 的除草劑+2.5%DMSO混合液1 mL，用微量移液器注射于幼苗莖稈盾片節(jié)處的生長點。

（四）統(tǒng)計分析

根據統(tǒng)計自然加倍法和除草劑加倍法中存活單倍體總株數與結實單倍體植株數，計算兩種方法的加倍率。加倍率計算公式如下：加倍率=（結實單倍體植株數/存活單倍體總株數）×100%。采用DPS7.1統(tǒng)計軟件處理試驗數據。

二、結果分析

（一）單倍體自然加倍率分析

4個單倍體材料在兩個試驗點的加倍效果如表1所示，通過數據比較發(fā)現，海南試驗點的加倍效果明顯好于吉林試驗點。九單525與九單186在吉林試驗點的加倍率均低于0.5%，而在海南試驗點能夠達到1%-4%。在4個材料之中，九單525的自然加倍效果最好，在吉林試驗點的平均自然加倍加倍率為0.3%，在海南進行自然加倍可以使平均自然加倍率提升至3%。九單186的自然加倍效果次之，在吉林試驗點的加倍效果與九單525基本相似，但在海南試驗點比九單186的平均加倍率低1.6%，僅僅只有1.4%。而九單918與九單200的加倍效果最差，九單200在兩個試驗點的加倍率均為0%，說明九單200不適合進行自然加倍。九單918雖然在吉林試驗點的加倍率為零，但在海南的加倍率能夠達到0.6%，說明優(yōu)良的氣候環(huán)境更有利于自然加倍。結果顯示，在不同的地點玉米單倍體植株加倍率出現明顯差異，導致加倍率出現明顯差異的原因可能是不同地點的氣候和光照等自然環(huán)境條件影響玉米單倍體的自然加倍，吉林試驗點晝夜溫差較小的逆境生態(tài)條件不利于單倍體雄穗加倍。

（二）不同基礎材料的自然加倍率

由表1可知，進行試驗的4個單倍體材料通過2年自然加倍得到的自然加倍率以九單525（1.65%）最高，九單186（1.8%）較高，九單918（0.3%）次之，九單200單倍體無論是在吉林試驗點還是在海南試驗點的自然加倍均未加倍成功，由此可以體現出基礎材料對單倍體自然加倍至關重要，對單倍體自然加倍率有重要影響。通過表1中也可以得出結論，4個材料由于遺傳背景的差異導致基因型不同，每個基礎材料對自然加倍的適應程度不同。但從九單918可以看出，優(yōu)良的氣候條件對單倍體的加倍具有幫助。不同基因型基礎材料通過基因的控制，通常導致雄穗育性恢復能力較差，易出現花期不遇的現象，從而導致玉米單倍體的加倍率差異。

（三）單倍體除草劑加倍率分析

表2可知，單倍體加倍過程中經除草劑處理的單倍體加倍率要極顯著高于未經除草劑處理的。根據不同的除草劑濃度分析，炔苯酰草胺是以80 μmol·L-1的加倍率最高，安磺靈以60 μmol·L-1的加倍率最高，濃度60 μmol·L-1的炔苯酰草胺和濃度40 μmol·L-1的安磺靈次之，炔苯酰草胺和安磺靈均是以濃度100 μmol·L-1的最低。高濃度的除草劑毒性大，對植株幼苗損傷較大，導致植株生長發(fā)育受阻甚至死亡，單倍體加倍率低。經針刺生長點法處理的單倍體加倍率較浸芽法處理的單倍體加倍率稍高，可能是因為針刺生長點法是在玉米單倍體幼苗的生長點處進行針刺，然后注射除草劑，使除草劑直接作用于生長點，從而使單倍體達到加倍，這種方法處理精確，作用更強。在 80 μmol·L-1濃度下，炔苯酰草胺處理的單倍體加倍率要極顯著高于安磺靈處理的（表3），說明了炔苯酰草胺更適宜于九單525和九單186單倍體加倍。

（四）不同基礎材料的除草劑加倍率

在用80μmol·L-1的炔苯酰草胺處理九單525與九單186時，發(fā)現該濃度下的炔苯酰草胺的加倍效果最好，但 80 μmol·L-1的 炔苯酰草胺對九單186的加倍效果明顯高與九單525的加倍效果。80 μmol·L-1的 炔苯酰草胺處理下，九單186的平均加倍率為27.2%。而九單525的平均加倍率為20.1%，加倍效果較好但在平均單倍體加倍率上還是以7.1%的差值低于九單186。并且與自然加倍法相比，九單186單倍體加倍率平均增加了136倍，而九單525的加倍率增加了 67倍（表 4）。說明不同的基礎材料對除草劑的加倍率高低有重要影響，用炔苯酰草胺處理時，九單186比九單525更為敏感。

三、討論

（一）不同基因型對單倍體加倍率的影響

本研究用吉科誘115在相同栽培環(huán)境下對4個基礎材料進行單倍體誘導，再對4個基礎材料進行單倍體加倍。通過自然加倍和除草劑加倍的結果可以發(fā)現，無論是經過自然加倍或者除草劑加倍，四個基礎材料的單倍體加倍率均不同。根據前人的研究發(fā)現，不同基因型的基礎材料會對單倍體的加倍率產生影響，這與本試驗結論一致。不同遺傳背景的材料對除草劑的適應程度不同，以及具有影響加倍的基因不同，導致部分基礎材料的加倍率較高適合加倍，而部分的材料則很難進行單倍體的加倍[7-8]。為促進玉米單倍體育種技術的進一步發(fā)展，研究母本基因型對單倍體加倍率的影響成為主要方向之一。

（二）不同加倍劑對單倍體加倍效果的影響

玉米單倍體育種技術中自然加倍法的加倍率較低，無法滿足大規(guī)模加倍的需求，化學加倍法中常用的秋水仙素毒素強，影響單倍體植株的生長發(fā)育和生態(tài)環(huán)境安全。通常采用能夠通過抑制植物細胞微管組裝形成來有效干擾細胞有絲分裂的除草劑替換秋水仙素，同樣能夠達到與秋水仙素相同的加倍效果，但單倍體的加倍效果也受除草劑種類、濃度和處理方式的影響[9]。本研究比較了炔苯酰草胺和安磺靈分別用浸芽法和針刺生長點法處理玉米單倍體的加倍效果，表明炔苯酰草胺的濃度為80 μmol·L-1時倍效果更好，而安磺靈的濃度為60 μmol·L-1時效果更好。高濃度安磺靈的加倍率明顯低于高濃度炔苯酰草胺的加倍率，說明安磺靈的毒性更高。

四、討論

本研究表明，采用自然加倍法時，海南試驗點的氣候環(huán)境更有利于種植單倍體，獲得更高的單倍體加倍率，說明優(yōu)良的氣候環(huán)境更有利于自然加倍；采用除草劑加倍時，使用濃度為 80 μmol·L-1的炔苯酰草胺比安磺靈的加倍效果更好，本試驗中的九單186比九單525更為敏感。后續(xù)可以應用濃度為 80 μmol·L-1的炔苯酰草胺，采用針刺生長點法處理單倍體九單186，提高其結實率，促進形成表現一致的穩(wěn)定DH系，加快育種進程。

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