藥用植物穿心蓮離體培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展

摘要： 穿心蓮為我國重要的南藥之一，用于清熱解毒、涼血消腫，其主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯具有抗癌、抗HIV病毒、抗炎、保肝等功效。然而，穿心蓮內(nèi)酯人工合成難度較大，主要從人工栽培的植物原料中提取，栽培植物原料的質(zhì)量因受土壤、氣候、水肥管理等各種因素的影響而參差不齊，穿心蓮生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且占用土地資源。植物離體培養(yǎng)技術(shù)在種苗快繁及活性成分積累等方面都具有顯著優(yōu)勢(shì)，是實(shí)現(xiàn)穿心蓮活性成分快速、高效生產(chǎn)的重要途徑之一。穿心蓮組織離體再生技術(shù)體系日益完善，從外植體到完整植株的組織離體再生技術(shù)日漸成熟，已在種苗繁育、倍性育種等方面有了一定的應(yīng)用。同時(shí)，在穿心蓮愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、不定根培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)過程中，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和使用適宜的誘導(dǎo)子可大幅增加培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯等活性成分的積累。該文分別從穿心蓮組織、細(xì)胞、不定根及毛狀根培養(yǎng)等方面，全面系統(tǒng)地綜述了近年來國內(nèi)外關(guān)于穿心蓮離體培養(yǎng)技術(shù)以及其生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯的研究進(jìn)展，以期促進(jìn)穿心蓮離體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，為離體生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯的研究提供參考。此外，還提出了未來在穿心蓮離體培養(yǎng)技術(shù)及通過該技術(shù)生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯的研究中需重點(diǎn)關(guān)注的3個(gè)方面：（1）熟化完善穿心蓮組織離體再生技術(shù)體系，建立全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系；（2）優(yōu)化培養(yǎng)條件和高效誘導(dǎo)子聯(lián)用，進(jìn)一步提高穿心蓮內(nèi)酯等重要活性成分產(chǎn)量；（3）開展通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯的生物反應(yīng)器培養(yǎng)研究。

關(guān)鍵詞： 穿心蓮， 組織培養(yǎng)， 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)， 穿心蓮內(nèi)酯， 進(jìn)展

中圖分類號(hào)： Q945文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 1000-3142（2024）07-1392-11

Research progress of in vitro culture technology and itsapplication of medicinal plant Andrographis paniculata

CHEN Dongliang1*， ZHONG Chu2， JIAN Shaofen2

（ 1. Institute of Cash Crops， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China; 2. National Center forTMC Inheritance and Innovation， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China ）

Abstract： Andrographis paniculata is one of the most important “Southern Medicines” in China. It is used for clearing heat and detoxifying， cooling blood and reducing swelling. Its main active ingredient andrographolide has functions in anti-cancer， anti-HIV， anti-inflammation and liver protection. Andrographolide is difficult to be synthesized artificially， mainly relying on extraction from cultivated plant materials. However， the quality of cultivated medicinal materials is affected by various factors such as soil， climate， water and fertilizer managements， and A. paniculata has a long growth cycle， occupying land resources. The technology of plant in vitro culture has significant advantages in rapid propagation of seedling and accumulation of active ingredients， which is one of the important ways to achieve production of active ingredients rapidly and efficiently in A. paniculata. The in vitro regeneration technology system of A. paniculata is becoming increasingly perfect， and the in vitro regeneration technology from explants to complete plants is becoming more and more mature， and it has been applied in seedling propagation and ploidy breeding. At the same time， during callus culture， cell suspension culture， adventitious root culture and hairy root culture of A. paniculata， the accumulation of andrographolide and other active ingredients in the culture could be greatly increased by optimizing the culture conditions and using appropriate inducers. This paper comprehensively and systematically reviewed the research advances on the in vitro culture technology of A. paniculata and production of andrographolide from the aspects of tissue， cell， adventitious root， and hairy root cultures. This paper aimed to provide reference for promoting the development and application of in vitro culture technology of A. paniculata， as well as for the study of in vitro production of andrographolide. It also put forward three aspects that need be focused on in future research on in vitro culture technology of A. paniculata and the production of andrographolides by this technology： （1） To mature and improve the tissues in vitro regeneration technology system of A. paniculata， and to establish a comprehensive and systematic evaluation system; （2） To further increase the yield of andrographolide and other important active ingredients by optimizing the culture conditions and its combination with efficient inducers; （3） To carry out researches in bioreactor culture of the production of andrographolide by cell suspension culture technology.

Key words： Andrographis paniculata， tissue culture， cell suspension culture， andrographolide， advances

穿心蓮（Andrographis paniculata ）又名一見喜、印度草、欖核蓮，為爵床科（Acanthaceae）穿心蓮屬（Andrographis）一年生草本藥用植物，其干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、涼血消腫之功效（國家藥典委員會(huì)，2020）。穿心蓮是國家基本藥物婦科千金片、消炎利膽片等中成藥的主要原料，也是穿心蓮內(nèi)酯滴丸、金雞膠囊、穿心蓮片、復(fù)方穿心蓮片、清火梔麥片、玉葉清火膠囊等多種中成藥的主要組分。穿心蓮地上部分主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯是近70年來研究最廣泛的天然產(chǎn)物之一，已經(jīng)大量應(yīng)用于臨床，在抗癌、抗HIV病毒、抗炎、保肝等方面效果顯著（Islam et al.， 2018; Burgos et al.， 2020; Ren et al.， 2021）。隨著對(duì)穿心蓮及其活性成分藥用價(jià)值的不斷開發(fā)，穿心蓮內(nèi)酯等活性成分商業(yè)化需求量巨大。但是，因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、人工合成難度較大，目前主要從人工栽培而來的植物原料中提取。盡管穿心蓮已在印度、巴基斯坦、斯里蘭卡、泰國、馬來西亞、中國和印度尼西亞等國家進(jìn)行了廣泛種植（Kandanur et al.， 2019；陳東亮等，2020），但由于穿心蓮內(nèi)酯的生物合成和積累與栽培種的基因型、栽培模式、氣候因子、地理環(huán)境等有關(guān)（Tajidin et al.， 2019; Rafi et al.， 2020; Dalawai et al.， 2021; 鐘楚等， 2021），加上穿心蓮栽培面積受日益緊縮的土地資源約束，故僅依靠從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)而來的植物原料中提取穿心蓮內(nèi)酯具有一定的局限性。

植物組織、器官、細(xì)胞等離體培養(yǎng)已經(jīng)發(fā)展成為最具吸引力的次生代謝物生產(chǎn)替代途徑之一（Murthy et al.， 2014；Espinosa-Leal et al.， 2018）。植物離體培養(yǎng)技術(shù)包括組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、不定根培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)等技術(shù)，其在保持藥用植物種性、藥用活性成分積累及遺傳轉(zhuǎn)化等研究方面都具有顯著優(yōu)勢(shì)。穿心蓮組織培養(yǎng)技術(shù)研究始于20世紀(jì)70年代，目前技術(shù)體系日益完善，從外植體到完整植株的組織離體再生技術(shù)日漸成熟，已在種苗繁育、倍性育種等方面有了一定的應(yīng)用。同時(shí)，在穿心蓮愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、不定根培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)過程中，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和使用適宜的誘導(dǎo)子可大幅增加培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯等活性成分的積累。

本文從穿心蓮組織、細(xì)胞、不定根及毛狀根培養(yǎng)等方面，全面系統(tǒng)地綜述了近年來穿心蓮離體培養(yǎng)技術(shù)以及通過離體培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)其主要活性成分的研究進(jìn)展，并分析存在的問題，同時(shí)提出了進(jìn)一步研究的方向，旨在促進(jìn)穿心蓮離體培養(yǎng)技術(shù)的研究與應(yīng)用以及進(jìn)一步發(fā)展。

1穿心蓮組織培養(yǎng)

1.1 穿心蓮組織培養(yǎng)技術(shù)研究概況

植物組織培養(yǎng)的效果主要取決于外植體的選擇以及消毒、培養(yǎng)基種類、植物激素的配比、培養(yǎng)條件等因素。

1.1.1 外植體外植體是否能接種成功決定于其取材部位、取材的時(shí)間、消毒方式等因素。在穿心蓮組織培養(yǎng)過程中，植株葉片、腋芽、莖段、帶腋芽莖段及莖尖等部位均可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，但多數(shù)研究認(rèn)為以其葉片和帶腋芽的莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)效果較好（Purkayastha et al.， 2008; Bansi & Rout， 2013; 陳榮珠， 2017; 戴燚等， 2018）。酒精、次氯酸鈉、氯化汞等試劑可用于穿心蓮?fù)庵搀w消毒，但消毒劑的濃度和消毒時(shí)間對(duì)外植體影響較大。陳榮珠（2017）和戴燚等（2018）的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以帶腋芽莖段為外植體時(shí)，先用75%酒精消毒15 s，再用3%次氯酸鈉消毒30 min，其消毒效果最好，存活率高達(dá)56.33%；當(dāng)用種子作為外植體時(shí)，先用75%酒精消毒15 s，再用3%次氯酸鈉消毒20 min，其存活率達(dá)到78.67%。

1.1.2 培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基作為植物組織培養(yǎng)中主要的營(yíng)養(yǎng)來源，其成分以及含量多少都直接影響外植體的生長(zhǎng)和分化增殖狀態(tài)，不同的外植體使用的培養(yǎng)基種類也有所不同。黃格等（2010）研究認(rèn)為MS是最適合穿心蓮芽增殖和生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基，增殖率為83.3%且長(zhǎng)勢(shì)良好。姬璇等（2017）對(duì)比了純瓊脂、MS、1/2MS、MS + 2.0 mg·L-1 6-BA 四種不同的培養(yǎng)基對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)的影響，綜合考慮其萌發(fā)率和成活率，認(rèn)為適合穿心蓮種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS或1/2 MS。閆斌（2016）對(duì)比研究了MS、1/2MS、MT、H、B5五種不同的基本培養(yǎng)基對(duì)穿心蓮無菌苗生長(zhǎng)的影響，認(rèn)為1/2MS更適合穿心蓮種子苗的生長(zhǎng)。姬璇（2018）對(duì)比研究了MS、N6和Nistch培養(yǎng)基對(duì)花藥培養(yǎng)的影響，認(rèn)為N6培養(yǎng)基是最適合作為穿心蓮花藥培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

1.1.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑基本培養(yǎng)基只能維持培養(yǎng)物的生存與最低營(yíng)養(yǎng)需求，在基本培養(yǎng)基中添加一定配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的啟動(dòng)和愈傷組織生長(zhǎng)以及根、芽的分化等。不同種類和配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體脫分化和器官發(fā)生的作用不同。

細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素是常用于植物組織培養(yǎng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞分裂素在組織培養(yǎng)中的作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，刺激細(xì)胞的分化和芽的建成，同時(shí)影響愈傷組織的分化和芽的形成（Loyola-Vargas & Ochoa-Alejo， 2018）；生長(zhǎng)素的作用是促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和延展，與植物的維管束和根的形成有關(guān)（Kuluev et al.， 2015）。在穿心蓮愈傷組織誘導(dǎo)和叢生芽分化時(shí)，將細(xì)胞分裂素（6-BA、KT等）和生長(zhǎng)素（NAA、IAA、IBA、2，4-D等）搭配組合作為添加劑使用效果較好（表1），如戴燚等（2018）研究認(rèn)為，穿心蓮愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素配比為MS + 1.0 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 NAA；陳榮珠（2017）研究發(fā)現(xiàn)，MS + 1.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 2，4-D對(duì)穿心蓮叢生芽誘導(dǎo)效果最佳，增殖系數(shù)達(dá)18.47（增殖系數(shù)=出芽數(shù)/原有芽數(shù)）。然而，在基本培養(yǎng)基上不添加生長(zhǎng)素，僅添加一種或一種以上細(xì)胞分裂素也可以誘導(dǎo)穿心蓮分化出叢生芽，并實(shí)現(xiàn)高效增殖，如Dandin和Murthy（2012）研究發(fā)現(xiàn)，將穿心蓮帶腋芽的莖段接種在MS+0.2 mg·L-1 6-BA的培養(yǎng)基上，外植體的平均叢生芽再生數(shù)可達(dá)9.25個(gè)；進(jìn)一步優(yōu)化激素配比發(fā)現(xiàn)，在MS + 0.2 mg·L-1 6-BA + 1.0 mg·L-1 KT的培養(yǎng)基上平均每個(gè)外植體叢生芽再生數(shù)可達(dá)39.08個(gè)。也有研究表明，將穿心蓮無菌苗的莖段接種在添加2.0 mg·L-1 6-BA 的MS培養(yǎng)基上，平均每個(gè)外植體叢生芽再生數(shù)可達(dá)34.1個(gè)，但誘導(dǎo)出的叢生芽卻無法伸長(zhǎng)生長(zhǎng)；而將再生出的叢生芽轉(zhuǎn)接在含有0.35 mg·L-1 GA3的MS培養(yǎng)基上2周后，叢生芽的伸長(zhǎng)率可達(dá)96%，伸長(zhǎng)長(zhǎng)度高達(dá)3.9 cm（Purkayastha et al.， 2008）。這可能與細(xì)胞分裂素6-BA具有促進(jìn)芽增殖而抑制芽伸長(zhǎng)的作用有關(guān)。硫酸腺嘌呤（adenine sulfate，ADS）為細(xì)胞分裂素合成的前體，可以增加細(xì)胞分裂素的生物合成（Khan et al.， 2014），其作為一種促進(jìn)芽增殖和生長(zhǎng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑已被廣泛應(yīng)用（Rency et al.， 2018）。Bansi和Rout（2013）的研究表明，穿心蓮莖段和葉片在MS+3.0 mg·L-1 6-BA+50 mg·L-1 ADS+1.0 mg·L-1 NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6周有利于愈傷組織的發(fā)育，愈傷組織在同樣的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)6周后，每個(gè)外植體的平均叢生芽數(shù)可達(dá)28.6個(gè)，葉源愈傷組織的芽再生率為75.3%，莖源愈傷組織的芽再生率為63.4%。在生根培養(yǎng)階段，普遍認(rèn)為在MS或1/2MS培養(yǎng)基上分別單獨(dú)添加0.5 mg·L-1 IBA和0.5 mg·L-1 NAA組培苗生根效果較好（表1）。

1.1.4 培養(yǎng)條件在植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)室的光照、濕度、溫度等培養(yǎng)條件均是誘導(dǎo)植物器官發(fā)生的重要因素，都會(huì)在一定程度上影響外植體的分化與生長(zhǎng)。光照是植物組織培養(yǎng)中重要的培養(yǎng)條件之一。姬璇等（2017）研究表明，穿心蓮種子在有光照的條件下萌發(fā)率高于黑暗條件下，黑暗條件下萌發(fā)的穿心蓮幼苗呈黃白色，莖稈細(xì)弱，葉子黃白；光照條件下植株呈綠色，莖稈粗壯，葉子鮮綠。穿心蓮組培苗常用的培養(yǎng)溫度為（25 ± 2） ℃，光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx，光周期為12 h光/12 h暗或16 h光/8 h暗。

1.1.5 煉苗移栽將一直在恒溫、高濕、低光等特殊環(huán)境下生長(zhǎng)的試管苗移栽到外界自然條件下，需要經(jīng)過一個(gè)逐步鍛煉和適應(yīng)的過程。Bansi和Rout（2013）研究表明，將生根的穿心蓮組培苗移植在泥土、沙子和干牛糞1∶1∶1（w/V）的混合基質(zhì)中，經(jīng)溫室進(jìn)行馴化后成活率可達(dá)60%，移栽于大田均能正常生長(zhǎng)。而Dandin和Murthy（2012）研究表明，首先將生根的穿心蓮組培苗移植到含有無菌土壤和蛭石1∶1（w/V）混合的花盆中，在溫度（25±2） ℃， 光周期16 h光/8 h暗，相對(duì)濕度80%和50 μmol·m-2·s-1的光強(qiáng)條件下煉苗2周；然后將其置于蔭蔽環(huán)境下，馴化生長(zhǎng)2周；最后將其置于野外自然環(huán)境下生長(zhǎng)，成活率可達(dá)95%。Purkayastha等（2008）研究認(rèn)為，將穿心蓮組培苗移栽到土壤、蛭石和蚯蚓堆肥（1∶1∶1）混合的花盆中，2周后成活率可達(dá)92%，植株生長(zhǎng)健壯。閆斌等（2016）研究表明，長(zhǎng)有6片真葉的穿心蓮組培苗在河沙與蛭石1∶1混合的基質(zhì)中生長(zhǎng)狀況良好，存活率達(dá)86.7%。

1.2 組織離體再生體系的評(píng)價(jià)

目前，在藥用植物穿心蓮上已建立了從外植體組織到完整植株的組織離體再生技術(shù)體系。Dandin和Murthy（2012）早在2012年就以帶腋芽的莖段為外植體，建立了穿心蓮高效的離體再生技術(shù)體系，并利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）對(duì)再生苗的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，分析結(jié)果表明該體系的再生植株與母體相比未產(chǎn)生任何基因型變異，再生植株葉片和莖器官中穿心蓮內(nèi)酯含量均高于母體。Purkayastha等（2008）、Dandin和Murthy（2012）、Bansi和Rout（2013）同樣以帶腋芽的莖段和葉片為外植體，建立了穿心蓮高效離體快繁技術(shù)體系，但均未對(duì)再生植株的遺傳穩(wěn)定性及藥用成分含量進(jìn)行評(píng)價(jià)。Kadapatti和Murthy（2021）以穿心蓮屬Andrographis alata的帶腋芽莖段為外植體，建立了其高效離體快繁技術(shù)體系，并利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記對(duì)再生苗的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該體系的再生植株與母體相比未產(chǎn)生任何基因型變異；并且，同時(shí)采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)了再生植株中新穿心蓮內(nèi)酯的含量，結(jié)果表明再生植株的新穿心蓮內(nèi)酯含量與母體植株相當(dāng)。

1.3 育種應(yīng)用

穿心蓮種質(zhì)資源多樣性貧乏，新品種選育嚴(yán)重滯后（陳東亮等，2020）。基于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的倍性育種可以為穿心蓮品質(zhì)改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供新途徑。在穿心蓮多倍體誘導(dǎo)方面，閆斌等（2016）以穿心蓮剛萌發(fā)的成熟胚為誘導(dǎo)材料，采用秋水仙堿為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)處理，初步建立了穿心蓮?fù)此谋扼w的誘導(dǎo)與鑒定方法，并獲得了4株穿心蓮的同源四倍體無菌苗，認(rèn)為0.075%的秋水仙堿誘導(dǎo)24 h效果最佳，其四倍體誘導(dǎo)率為3.3%，該研究為后續(xù)穿心蓮的多倍體培育和種質(zhì)創(chuàng)新研究奠定了基礎(chǔ)。佘曉環(huán)等（2022）用0.05%的秋水仙素浸種48 h，穿心蓮種子誘導(dǎo)成活率達(dá)89%，整個(gè)誘導(dǎo)試驗(yàn)獲得8株四倍體植株。在單倍體誘導(dǎo)方面，姬璇（2018）以穿心蓮花藥為外植體，建立了穿心蓮花藥離體培養(yǎng)技術(shù)體系，成功獲得了穿心蓮單倍體胚性愈傷組織，該研究開創(chuàng)了穿心蓮單倍體育種的先河，為純合二倍體的誘導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)。

1.4 愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯

穿心蓮愈傷組織中穿心蓮內(nèi)酯等活性成分含量極低。植物激素NAA、2，4-D、TDZ、6-BA及KT等單獨(dú)或以一定比例搭配使用均可誘導(dǎo)穿心蓮愈傷組織積累穿心蓮內(nèi)酯（Vidyalakshmi & Ananthi， 2013；Jindal et al.， 2016）。Jindal等（2016）以穿心蓮葉片為外植體， 建立了穿心蓮愈傷組織培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)葉片外植體在MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 NAA培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率高達(dá)92%，穿心蓮內(nèi)酯含量也高達(dá)8.34 mg·g-1（fresh cell weight，F(xiàn)CW）。穿心蓮內(nèi)酯是通過胞質(zhì)內(nèi)甲羥戊酸（mevalonate，MAV）途徑和質(zhì)體脫氧木糖磷酸（deoxy-xylulose phosphate，DXP）途徑協(xié)同作用產(chǎn)生的（Singh et al.， 2018; Sinna et al.， 2018; Das & Bandyopadhyay， 2021）。Das和Bandyopadhyay（2021）的研究發(fā)現(xiàn)，用MAV途徑阻斷劑洛伐他?。╨ovastatin）處理穿心蓮愈傷組織后，MAV途徑被阻斷，穿心蓮內(nèi)酯合成向質(zhì)體DXP途徑轉(zhuǎn)移，質(zhì)體DXP途徑被上調(diào)，導(dǎo)致穿心蓮內(nèi)酯的含量顯著增加，同時(shí)愈傷組織變綠；而用DXP途徑阻斷劑膦胺霉素（fosmidomycin）處理愈傷組織后，DXP途徑被阻斷，穿心蓮內(nèi)酯合成向質(zhì)體MAV途徑轉(zhuǎn)移，但質(zhì)體MAV途徑不能單獨(dú)補(bǔ)償產(chǎn)生穿心蓮內(nèi)酯，導(dǎo)致穿心蓮內(nèi)酯產(chǎn)生減少；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，硝酸銀（AgNO3）可誘導(dǎo)穿心蓮愈傷組織產(chǎn)生穿心蓮內(nèi)酯，與硝酸銀和膦胺霉素聯(lián)用相比，聯(lián)用硝酸銀和洛伐他汀處理其愈傷組織后，穿心蓮內(nèi)酯的產(chǎn)量更高，為3.41～3.76 mg·g-1（dry cell weight，DCW），這表明DXP途徑在穿心蓮內(nèi)酯的生物合成中起主導(dǎo)作用。此外，Das和Bandyopadhyay（2021）的研究還發(fā)現(xiàn)，在光照、硝酸銀、生物合成途徑阻斷劑處理過程中，葉綠素含量和穿心蓮內(nèi)酯含量之間呈正相關(guān)。因此，在未來的研究中，通過有目的性地增加組織的葉綠素含量可能成為提升穿心蓮內(nèi)酯產(chǎn)量的又一策略。

2穿心蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)研究的主要內(nèi)容是，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過篩選高產(chǎn)組織或細(xì)胞系、優(yōu)化培養(yǎng)條件及選用高效誘導(dǎo)子等方法，降低成本，并提高其活性成分產(chǎn)量，或者通過對(duì)次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的調(diào)控來達(dá)到相同目的。

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

理想愈傷組織的獲得決定了植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系建立的快速性和高效性。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)應(yīng)選用疏松且易碎的愈傷組織。由于穿心蓮植株葉片積累的二萜內(nèi)酯類活性成分較其他器官多（Mishra et al.， 2010），出于活性成分積累的目的，研究者大多選用其葉片作為外植體來誘導(dǎo)理想的愈傷組織。Gandi等（2012）以3周齡實(shí)生無菌苗植株為材料，對(duì)比分析了選用植株莖、葉、根作為外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，認(rèn)為葉片外植體在MS+2.0 mg·L-1 2，4-D+0.4 mg·L-1 6-BA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織疏松易碎，繁殖率高，適宜用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。Sharma和Jha（2012）以溫室生長(zhǎng)的穿心蓮幼嫩葉片為外植體，在添加1.0 mg·L-1 NAA和1.0 mg·L-1 2，4-D的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織量最大，呈乳白色，疏松易碎，適宜用于穿心蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。Dawande和Sahay（2020）以種子萌發(fā)10 d而來的無菌苗為材料，研究了不同外植體（子葉、初生葉、上胚軸和下胚軸）、培養(yǎng)基（B5、SH）及不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明在含有2.0 mg·L-1 2，4-D和0.1 mg·L-1 6-BA的SH培養(yǎng)基上，子葉和下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生穿心蓮內(nèi)酯

通過優(yōu)化培養(yǎng)條件、使用誘導(dǎo)子誘導(dǎo)等方式可使穿心蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯的積累量大幅提高。Sharma 和 Jha（2012）的研究表明，在MS+1.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 2，4-D液體培養(yǎng)基上的細(xì)胞培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯含量高達(dá)32.4 mg·g-1（FCW），是愈傷組織母體中穿心蓮內(nèi)酯含量的2.4倍，是葉片中穿心蓮內(nèi)酯含量的1.3倍。植物細(xì)胞培養(yǎng)物在受到合適的誘導(dǎo)子脅迫誘導(dǎo)后次生代謝產(chǎn)物的積累量會(huì)得到進(jìn)一步增強(qiáng)（Yue et al.， 2016），這些誘導(dǎo)子包括生物誘導(dǎo)子、非生物誘導(dǎo)子和信號(hào)分子等。Gandi等（2012）首次報(bào)道了穿心蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生穿心蓮內(nèi)酯的方法，發(fā)現(xiàn)生物誘導(dǎo)子（酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、根生農(nóng)桿菌532和農(nóng)桿菌c58）比非生物誘導(dǎo)子（CdCl2、AgNO3、CuCl2、HgCl2）能更有效地誘導(dǎo)穿心蓮懸浮培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯的積累，以酵母誘導(dǎo)為最佳，穿心蓮內(nèi)酯積累量可達(dá)13.5 mg·g-1（DCW），比對(duì)照增加了8.82倍。此外，還有研究表明，用1.5 mL的黑曲霉處理培養(yǎng)物10 d后，由葉源愈傷組織而來的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯積累最大，達(dá)13.2 mg·g-1（DCW），比對(duì)照增加了6.94倍；用0.6%的擴(kuò)展青霉處理培養(yǎng)物8 d后，細(xì)胞培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯積累達(dá)8.1 mg·g-1（DCW），比對(duì)照增加了6.23倍（Vakil & Mendhulkar， 2013a）；用7.0 mg·L-1水楊酸處理培養(yǎng)物24 h后，穿心蓮內(nèi)酯含量達(dá)3.7 mg·g-1（DCW），為對(duì)照的18.5倍；用20 mg殼聚糖處理培養(yǎng)物48 h后，穿心蓮內(nèi)酯含量高達(dá)11.9 mg·g-1（DCW），是對(duì)照的59.5倍（Vakil & Mendhulkar， 2013b）。Sharma等（2014）在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，用1.0 mg·L-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJA）誘導(dǎo)處理培養(yǎng)物24 h后穿心蓮內(nèi)酯含量比對(duì)照增加了5.25倍。Dawande和Sahay（2020）研究認(rèn)為，在含20 g·L-1蔗糖的1/2MS液體培養(yǎng)基上光照20 h·d-1，3周后愈傷組織中穿心蓮內(nèi)酯含量高達(dá)4.60 mg·g-1（DCW），在該培養(yǎng)條件下，用硫酸銅、茉莉酸甲酯、幾丁質(zhì)和真菌菌絲誘導(dǎo)的穿心蓮細(xì)胞培養(yǎng)物穿心蓮內(nèi)酯產(chǎn)量均有顯著提高，其中以80 mg·L-1硫酸銅誘導(dǎo)的穿心蓮內(nèi)酯產(chǎn)量為最高，達(dá)29.42 mg·g-1（DCW）。這表明優(yōu)化培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)子誘導(dǎo)方法聯(lián)用可以顯著提高穿心蓮內(nèi)酯的總體產(chǎn)量。目前，多數(shù)研究認(rèn)為水楊酸（salicylicacid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）這兩種信號(hào)分子在植物的適應(yīng)性調(diào)控方面具有拮抗作用（Brooks et al.， 2005；Zheng et al.， 2012），也有研究表明二者存在協(xié)同作用（Mur et al.， 2006）。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）單獨(dú)使用均可誘導(dǎo)愈傷組織中穿心蓮內(nèi)酯含量的增加（Zaheer & Giri， 2015）。Ahmed和Praveen（2023）研究發(fā)現(xiàn)，SA和JA對(duì)穿心蓮細(xì)胞培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯含量的影響均隨其濃度的增加而增加，其中13.8 mg·L-1 SA誘導(dǎo)的穿心蓮內(nèi)酯含量為0.083 mg·g-1（DCW），比對(duì)照增加了18%，以21.0 mg·L-1 JA處理的穿心蓮內(nèi)酯含量可達(dá)0.211 mg·g-1（DCW），比對(duì)照增加了3倍；此外，以10.35 mg·L-1 SA和15.75 mg·L-1 JA同時(shí)誘導(dǎo)，穿心蓮內(nèi)酯含量可達(dá)0.28 mg·g-1（DCW），比對(duì)照增加了3.8倍。由此可見，在穿心蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，多個(gè)正向誘導(dǎo)子的聯(lián)合使用比單個(gè)正向誘導(dǎo)子單獨(dú)使用效果更好。

3穿心蓮不定根的培養(yǎng)

3.1 不定根培養(yǎng)積累穿心蓮內(nèi)酯

不定根由植物器官受傷或激素、病原微生物等外界因素的刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生，不按正常時(shí)序發(fā)生且出現(xiàn)在非正常的位置，通常在莖、葉和下胚軸位置產(chǎn)生。植物不定根培養(yǎng)通常可積累大量的次生代謝產(chǎn)物，這為藥用植物活性成分的獲得提供了一種新途徑（Paek et al.， 2005）。目前，大部分藥用植物已成功誘導(dǎo)出不定根，并對(duì)其進(jìn)行了搖瓶或生物反應(yīng)器培養(yǎng)（苗佳琪，2022）。在穿心蓮不定根誘導(dǎo)方面，Praveen等（2009）以穿心蓮葉片為外植體，在含1.0 mg·L-1 NAA和含0.3%蔗糖的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出了不定根，在含0.5 mg·L-1 NAA和含0.3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4周后其生物量比對(duì)照高出7倍，穿心蓮內(nèi)酯含量較對(duì)照高出3.5倍。Sharma等（2013）以葉片為外植體，在含1.0 mg·L-1 NAA的改良MS培養(yǎng)基上平均每個(gè)外植體誘導(dǎo)出的不定根數(shù)可達(dá)26.7個(gè)，不定根誘導(dǎo)率達(dá)83%，在相同成分的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5周后，穿心蓮內(nèi)酯含量達(dá)133.3 mg·g-1（DCW），比對(duì)照高3.5～5.5倍。Das和Bandyopadhyay（2015）在含有2.0 mg·L-1 NAA的MS培養(yǎng)基上以葉片和根為外植體直接誘導(dǎo)出不定根，在相同液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后其不定根中穿心蓮內(nèi)酯含量最高，為1.06 mg·L-1（DCW）。

3.2 誘導(dǎo)子誘導(dǎo)積累穿心蓮內(nèi)酯

誘導(dǎo)子誘導(dǎo)不但能使細(xì)胞培養(yǎng)物中穿心蓮內(nèi)酯含量積累增加，而且可在不定根培養(yǎng)過程中誘使穿心蓮內(nèi)酯含量大量積累。Zaheer和Giri（2017）首次報(bào)道了化學(xué)誘導(dǎo)子水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）在穿心蓮不定根培養(yǎng)過程中對(duì)穿心蓮內(nèi)酯積累的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的JA 均可誘導(dǎo)不定根中穿心蓮內(nèi)酯的積累，其中以3.45 mg·L-1 JA誘導(dǎo)為最佳，培養(yǎng)1周后其不定根中穿心蓮內(nèi)酯含量為對(duì)照的10.8倍；而用不同濃度SA及其衍生物誘導(dǎo)穿心蓮不定根1周后發(fā)現(xiàn)，僅15.2 mg·L-1水楊酸甲酯（methyl salicylic acid，MSA）可使不定根中穿心蓮內(nèi)酯的含量比對(duì)照增加2.6倍，表明JA對(duì)穿心蓮不定根培養(yǎng)中穿心蓮內(nèi)酯含量的影響明顯優(yōu)于SA。此外，Srinath等（2022）的研究發(fā)現(xiàn)，乙烯（ethylene，ETH）誘導(dǎo)可顯著促進(jìn)不定根培養(yǎng)物生物量增加4倍，穿心蓮內(nèi)酯含量增加5倍；光照可使穿心蓮內(nèi)酯含量增加4.29倍。由此可見，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)穿心蓮不定根中穿心蓮內(nèi)酯含量增加，但目前已知的可誘導(dǎo)穿心蓮不定根中穿心蓮內(nèi)酯積累的化學(xué)誘導(dǎo)子種類較少，還需進(jìn)一步篩選挖掘。

4穿心蓮毛狀根的培養(yǎng)

毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物后產(chǎn)生的一種病理狀態(tài)，具有生長(zhǎng)快、易于大量培養(yǎng)、激素自養(yǎng)、次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高、生理生化和遺傳性穩(wěn)定等特點(diǎn)，有很大的工業(yè)化潛力。近年來，毛狀根培養(yǎng)技術(shù)作為藥用植物的次生代謝產(chǎn)物開發(fā)新途徑受到人們的重視，已經(jīng)成為繼組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)體系之后的又一培養(yǎng)體系。Marwani等（2015）研究表明，以子葉為外植體，用菌株ATCC 15834侵染2 d，其毛狀根誘導(dǎo)效果最佳，在添加1.0 mg·L-1 IBA的1/2 MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)第2周，穿心蓮內(nèi)酯含量最高，達(dá)5.4 mg·g-1（DCW）。Mahobia和Jha（2015）以MTCC 532為發(fā)根菌株，研究了不同外植體（葉片和根尖分生組織）、不同侵染方式（浸漬和滴注）、不同培養(yǎng)基對(duì)穿心蓮毛狀根誘導(dǎo)的影響，認(rèn)為在添加80.0 mg·L-1乙酰丁香酮和0.3%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基上，采用侵染法共培養(yǎng)3 d，其毛狀根誘導(dǎo)率最高，可達(dá)58.76%。

5存在問題與展望

5.1 存在的問題

雖然有關(guān)穿心蓮組織離體培養(yǎng)再生完整植株的報(bào)道已有很多（Purkayastha et al.， 2008；Dandin & Murthy， 2012；Bansi & Rout， 2013），但要進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，其離體再生效率還需進(jìn)一步提高，激素配比有待進(jìn)一步優(yōu)化。此外，對(duì)于藥用植物而言，再生植株的遺傳穩(wěn)定性及藥效成分含量高低既是其離體再生技術(shù)體系的又一重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，也是該技術(shù)體系能否大規(guī)模進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵和前提（繆劍華等，2017）。然而，目前很少有將再生植株的遺傳穩(wěn)定性及藥效成分含量高低作為再生體系的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，在穿心蓮愈傷組織、細(xì)胞、不定根及毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯相關(guān)報(bào)道中，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和使用誘導(dǎo)子均可顯著提高培養(yǎng)物穿心蓮內(nèi)酯含量，并且多個(gè)誘導(dǎo)子聯(lián)用及優(yōu)化培養(yǎng)條件聯(lián)用還可進(jìn)一步提高培養(yǎng)物穿心蓮內(nèi)酯產(chǎn)量，但鮮有該方面的研究報(bào)道。

5.2 展望

雖然前人已在穿心蓮離體培養(yǎng)方面取得了一定的技術(shù)性突破，組織離體再生技術(shù)體系日漸成熟，愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、不定根及毛狀根培養(yǎng)技術(shù)體系日益完善，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件、使用誘導(dǎo)子誘導(dǎo)等方法，使培養(yǎng)物的活性成分（如穿心蓮內(nèi)酯）的積累量已有了較大提升，但相對(duì)還處于基礎(chǔ)研究階段，距規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用還存在較大差距（Murthy & Dalawai， 2021）。相對(duì)于大宗中藥材而言，在穿心蓮離體培養(yǎng)技術(shù)及其生產(chǎn)活性成分的基礎(chǔ)研究還缺乏系統(tǒng)性，基于植物器官、組織及細(xì)胞離體培養(yǎng)生產(chǎn)重要次生代謝產(chǎn)物的一些關(guān)鍵技術(shù)還有待攻克。其他大宗中藥材在植物離體培養(yǎng)及產(chǎn)生重要活性成分方面的研究思路，尤其是已得到規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用的相關(guān)技術(shù)的研究思路，對(duì)穿心蓮相關(guān)研究具有很高的借鑒價(jià)值。筆者認(rèn)為，未來在穿心蓮離體培養(yǎng)技術(shù)及產(chǎn)生重要活性成分方面應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下3個(gè)方面。

5.2.1 熟化完善穿心蓮組織離體再生技術(shù)體系，建立全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系通過優(yōu)化植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比、種類組合及培養(yǎng)條件等途徑，熟化完善穿心蓮組織離體再生技術(shù)體系，提高組織培養(yǎng)效率。對(duì)其他藥用植物的研究表明，利用ISSR、EST-SSR、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記或2種以上分子標(biāo)記聯(lián)用對(duì)藥用植物再生植株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)是可靠且可行的（Mamdouh et al.， 2021; Sharma et al.， 2022; Babanina et al.， 2023）。因此，未來應(yīng)在使穿心蓮組織離體再生技術(shù)體系高效化的同時(shí)，綜合運(yùn)用多種分子標(biāo)記檢測(cè)手段，加強(qiáng)穿心蓮再生植株遺傳穩(wěn)定性及其主要活性成分跟蹤研究，建立全面系統(tǒng)的穿心蓮組織離體再生技術(shù)評(píng)價(jià)體系。

5.2.2 優(yōu)化培養(yǎng)條件和高效誘導(dǎo)子聯(lián)用，進(jìn)一步提高穿心蓮內(nèi)酯等重要活性成分產(chǎn)量目前，已在人參（Panax ginseng）（Huang et al.， 2013）、肉蓯蓉（Cistanche deserticola）（Cheng et al.， 2005）、貫葉連翹（Hypericum perforatum）（Conceiao et al.， 2006）、水飛薊（Silybum marianum）（Sánchez-Sampedro et al.， 2005）、金盞菊（Calendula officinalis）（Wiktorowska et al.， 2010）等諸多藥用植物上，通過誘導(dǎo)子誘導(dǎo)使其細(xì)胞群的次生代謝產(chǎn)物積累增強(qiáng)。穿心蓮內(nèi)酯的生物合成途徑已逐漸明晰（Das & Bandyopadhyay， 2021；鐘楚等，2021），但針對(duì)其生物合成途徑有目的地調(diào)控穿心蓮內(nèi)酯含量的相關(guān)研究較少。因此，未來在穿心蓮離體培養(yǎng)生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯方面，應(yīng)針對(duì)其生物合成途徑進(jìn)行有目的地優(yōu)化培養(yǎng)條件和高效誘導(dǎo)子聯(lián)用研究，以進(jìn)一步提高其穿心蓮內(nèi)酯等重要活性成分含量，為該技術(shù)的規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用提供可靠且高效的技術(shù)支撐。

5.2.3 通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，開展生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯的生物反應(yīng)器培養(yǎng)研究生物反應(yīng)器培養(yǎng)具有生產(chǎn)規(guī)模大、周年生產(chǎn)、不受季節(jié)及區(qū)域性影響、自動(dòng)化程度高、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，在藥用植物次生代謝產(chǎn)物規(guī)?；a(chǎn)方面應(yīng)用前景廣闊。目前，已在人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（Thanh et al.， 2014）、不定根（Song et al.， 2017）及毛狀根培養(yǎng)（Kochan et al.， 2018）、西洋參毛狀根培養(yǎng)（Kochan et al.， 2017）、白芷不定根培養(yǎng)（Hwang et al.， 2022）等方面，建立了相應(yīng)活性成分生產(chǎn)的生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)體系，人參皂苷等重要活性成分已通過生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)（Thanh et al.， 2014；Luthra et al.， 2021）。相比之下，針對(duì)穿心蓮該方面的研究嚴(yán)重滯后。目前，通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯的研究較為深入，技術(shù)也較為成熟。因此，未來在穿心蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯的生物反應(yīng)器培養(yǎng)研究方面具有廣闊前景。

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（責(zé)任編輯蔣巧媛王登惠）