多胺對荔枝胚性愈傷組織增殖與體胚發(fā)生的影響

摘要： 為探討外源多胺（PAs）對荔枝胚性愈傷組織（EC）增殖及體胚發(fā)生的影響機制，該研究以“妃子笑”荔枝EC為材料，采用單因素法在增殖培養(yǎng)基中添加腐胺（Put）、亞精胺（Spd）及精胺（Spm），分析了不同PAs處理后EC的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、內(nèi)源PAs含量及相關(guān)酶指標(biāo)的變化。結(jié)果表明：（1）外源Put、Spd和Spm處理均顯著提高了EC增殖率，減少了體胚誘導(dǎo)及萌發(fā)數(shù)量。經(jīng)外源PAs處理增殖的EC胚性細胞大小較一致，染色深且均勻，多細胞原胚減少，可見已經(jīng)分化完全的早期子葉胚。（2）外源PAs處理均顯著提高了EC中內(nèi)源PAs含量，其中Put處理的EC中各類內(nèi)源PAs及總PAs含量最高；當(dāng)在含外源PAs培養(yǎng)基上增殖的EC轉(zhuǎn)入不含外源PAs的培養(yǎng)基上增殖時（恢復(fù)培養(yǎng)），EC中的Put含量仍然顯著高于對照，內(nèi)源Spd和Spm則顯著降低。（3）外源Put處理顯著提高了EC中的鳥氨酸脫羧酶（ODC）、精氨酸脫羧酶（ADC）和二胺氧化酶（DAO）活性，而外源Spd、Spm處理顯著降低了EC中的ODC及ADC活性，外源Spd顯著提高了多胺氧化酶（PAO）活性；恢復(fù)培養(yǎng)后，EC中ADC和DAO活性比恢復(fù)培養(yǎng)前顯著降低，ODC和PAO無顯著性差異。綜上認(rèn)為，外源PAs可以通過調(diào)節(jié)PAs代謝相關(guān)酶活性影響內(nèi)源PAs含量，進而影響荔枝EC增殖和體胚誘導(dǎo)。該研究結(jié)果為進一步研究PAs調(diào)節(jié)荔枝體胚發(fā)生機制及提高荔枝離體再生效率提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 荔枝， 離體再生， 組織切片， 多胺， 酶活性

中圖分類號： Q942.5文獻標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1307-12

Influences of polyamines on embryogenic callus proliferationand somatic embryogenesis in Litchi chinensis

WANG Guo1， LIU Yaoting1，2， LI Huanling1， WANG Shujun1， LI Fang1， WANG Jiabao1*

（ 1. Environments and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/National Key Laboratory for TropicalCrop Breeding， Danzhou 571737， China， Hainan； 2. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou 570228， China ）

Abstract： To explore the effect of exogenous polyamines （PAs） on embryogenic callus （EC） proliferation and somatic embryogenesis of litchi， the morphology， structure， endogenous PA content and related enzyme activities of EC were systematically investigated using the ‘Feizixiao’ ECs as materials subcultured on the medium supplemented with exogenous putrescine （Put）， spermidine （Spd）， and spermine （Spm）. The results were as follows： （1） Exogenous Put， Spd and Spm treatments significantly increased the EC proliferation rate and reduced the amount of induced somatic embryos and number of germinations. The proliferated EC cells after exogenous PA treatments were more consistent in size and stained deeply and evenly. Furthermore， multicellular proembryos in EC were reduced， and fully differentiated early cotyledon embryos could be seen. （2） All the exogenous PA treatments significantly increased the endogenous PA content in EC. Among them， Put treatment had the highest content of each endogenous PA component and total PA. When the EC proliferated on the medium containing exogenous PAs was transferred to the medium without exogenous PAs （recovery culture） for proliferating， the Put content in the EC was still significantly higher than the control， however， the endogenous Spd and Spm were significantly decreased. （3） Exogenous Put treatment significantly increased the activities of ornithine decarboxylase （ODC）， arginine decarboxylase （ADC）， and diamine oxidase （DAO） in EC， while exogenous Spd and Spm treatments significantly reduced the activities of ODC and ADC in EC， and exogenous Spd significantly increased the polyamine oxidase （PAO） activity. When transferred to the recovery culture medium， the ADC and DAO activities of newly proliferated EC were significantly lower than those of EC cultured with exogenous PAs， but there was no significant difference in ODC and PAO activities. In summary， the exogenous PAs can affect endogenous PAs content by regulating the activities of enzymes related to PAs metabolism， thereby affecting EC proliferation and somatic embryo induction in litchi. These results provide a basis for further study on the mechanism of PAs regulating embryogenesis， and improve litchi regeneration efficiency in vitro.

Key words： litchi （Litchi chinensis）， plant regeneration， histological section， polyamines， metabolic enzymes

荔枝（Litchi chinensis）是我國華南重要的南亞熱帶果樹，是助推鄉(xiāng)村振興重要產(chǎn)業(yè)之一（陳厚彬等，2023）。荔枝產(chǎn)期集中，病蟲危害嚴(yán)重等限制著產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展，選育不同熟期、優(yōu)質(zhì)、多抗等優(yōu)良品種是解決這些問題的根本途徑。傳統(tǒng)育種方式如雜交育種、實生選種等，具有耗費大、周期長、效率低等不足，基因編輯等生物技術(shù)可克服這些不足，是荔枝育種的重要發(fā)展方向（Das & Rahman，2010）。高效的離體再生技術(shù)體系是生物育種的前提，但在荔枝上，經(jīng)體胚發(fā)生途徑獲得再生植株的報道鮮少，主要是體胚誘導(dǎo)率低、畸形胚多導(dǎo)致萌發(fā)率低（Das et al.，2016； Wang et al.，2016； 秦雅琪，2019），阻礙了生物育種的應(yīng)用。因此，研究提高荔枝離體再生效率的技術(shù)并探索其作用機制，對促進荔枝生物育種發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。

已有較多關(guān)于影響荔枝胚性愈傷組織（embryogenic callus，EC）增殖和體胚發(fā)生的因素的研究，如基本培養(yǎng)基和碳源（Raharjo & Litz，2007；Das et al.，2016），2，4-D、玉米素及激動素等生長調(diào)節(jié)因子（Puchooa，2004；Ma et al.，2008；秦雅琪，2019），有機附加物（Yu et al.，2000；Wang et al.，2023；王果等，2023）等，但鮮見多胺（polyamine，PA）調(diào)控荔枝離體再生的報道。PA是一類廣泛存在于原核生物及真核生物中，具有強烈生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，在植物生長發(fā)育及離體再生中起著重要作用（Rakesh et al.， 2021）。Sathish等（2019）研究發(fā)現(xiàn)外源PAs促進了甘蔗（Saccharum spp. Hybrid）的體胚發(fā)生及再生效率的提高，分別提高了2倍和3倍以上。Eldawayati等（2018）發(fā)現(xiàn)棗椰（date palm）EC在含亞精胺（spermidine， Spd）固體培養(yǎng)基上發(fā)育最好，體胚發(fā)生數(shù)量在含腐胺（putrescine，Put）的液體培養(yǎng)最多。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，“妃子笑”荔枝（Litchi chinensis cv. Feizixiao）愈傷組織多胺氧化酶（polyamine oxidase， PAO）活性與體胚發(fā)生呈正相關(guān)（吉訓(xùn)志，2019）。進一步研究表明，PAs和相關(guān)代謝酶的內(nèi)源性變化與荔枝EC增殖及體胚誘導(dǎo)的不同發(fā)育階段（從愈傷組織到EC、早期體胚誘導(dǎo)）的結(jié)構(gòu)相一致；Put及精胺（spermine，Spm）是荔枝EC中的主要PAs，體胚誘導(dǎo)過程中的Put及Spd含量整體上高于EC增殖階段；Spm含量相反，EC增殖過程中的Spm平均含量高于體胚誘導(dǎo)階段。PAO及二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性與Put含量呈正相關(guān)（王果等，2021a）。更進一步研究發(fā)現(xiàn)，在EC增殖階段添加3類PAs會抑制荔枝體胚發(fā)生，而多胺抑制劑（D-精氨酸或環(huán)己胺）則顯著促進EC增殖及體胚發(fā)生；在體胚發(fā)生階段中添加Put、Spm或環(huán)己胺抑制荔枝體胚發(fā)生及萌發(fā)，而D-精氨酸或Spd則促進體胚發(fā)生及萌發(fā)（王果等，2021b）。這些結(jié)果表明PAs在荔枝EC增殖及體胚發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，但其機制尚不清晰。本研究以“妃子笑”荔枝EC為材料，采用單因素法，通過在增殖培養(yǎng)基中添加不同PAs，擬探討以下問題：（1）進一步證實不同PAs是否會影響荔枝EC的增殖及體胚發(fā)生能力；（2）外源PAs影響EC增殖及體胚發(fā)生的作用機制。

1材料與方法

1.1 材料

“妃子笑”荔枝EC于2015年3月采用花藥誘導(dǎo)獲得，在M3（MS為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 1 mg·L-1）和M4培養(yǎng)基上（MS為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 1 mg·L-1、KT 0.5 mg·L-1和AgNO3 5 mg·L-1）以30 d為1個周期交替繼代保存（李煥苓，2009）。

1.2 方法

1.2.1 含PAs的培養(yǎng)基對EC增殖、體胚發(fā)生及萌發(fā)的影響將在M4培養(yǎng)基上繼代30 d的EC，分別轉(zhuǎn)接于M3（CK）、P3（M3培養(yǎng)基附加Put 15 mg·L-1）、S2（M3培養(yǎng)基附加Spd 10 mg·L-1）和S7（M3培養(yǎng)基附加Spm 15 mg·L-1）培養(yǎng)基（王果等，2021b），稱重初始接種量（G0）。培養(yǎng)3周后稱重EC重量（G1），EC增殖率=（G1-G0）/（G0）。

將在上述4種培養(yǎng)基上增殖的EC，分別接種于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基T3（MS為基本培養(yǎng)基，附加NAA 0.1 mg·L–1及KT 5 mg·L–1）上，培養(yǎng)7周后記錄體胚發(fā)生情況，計算每克EC誘導(dǎo)獲得的體胚總量和雙子葉體胚數(shù)量。

上述獲得的所有乳白色體胚接種在C19培養(yǎng)基（MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加ABA 1 mg·L–1和IAA 0.5 mg·L–1）上進行成熟，8周后轉(zhuǎn)接于R7萌發(fā)培養(yǎng)基（1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加 GA3 1 mg·L–1），12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)，8周后統(tǒng)計每克EC體胚的萌發(fā)數(shù)量及形態(tài)等。

1.2.2 恢復(fù)培養(yǎng)對EC增殖、體胚發(fā)生及萌發(fā)的影響將在M3、P3、S2和S7上培養(yǎng)3周的EC，分別轉(zhuǎn)接到不含PAs的M3培養(yǎng)基上 ［處理編號分別為M3M3（CK）、P3M3、S2M3和S7M3］。培養(yǎng)3周后，這些處理的EC再分別轉(zhuǎn)接于T3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚。各項指標(biāo)統(tǒng)計同1.2.1。

以上各處理培養(yǎng)基pH值均調(diào)至5.8。EC增殖及萌發(fā)培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g·L–1和瓊脂7 g·L–1，體胚誘導(dǎo)和成熟培養(yǎng)基均添加蔗糖60 g·L–1和瓊脂10 g·L–1。如無特殊說明，均為（25±2） ℃下黑暗培養(yǎng)。

1.2.3 EC形態(tài)與結(jié)構(gòu)觀察取少量上述各處理培養(yǎng)3周后的EC輕放在載玻片上，滴清水，采用牙簽輕攪混勻，蓋上蓋玻片后，在超景深顯微鏡（KEYENG VHX-5000，大阪，日本）下觀察EC細胞形態(tài)。

石蠟切片的制作主要參照吉訓(xùn)志（2019）的方法，EC采用Ehrlich蘇木素染色，制片后在超景深三維顯微系統(tǒng)下觀察記錄。

1.2.4 EC中PAs含量及PAs代謝酶活性測定取在M3、P3、S2、S7及M3M3、P3M3、S2M3和S7M3共8種培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周的EC，液氮速凍后置于-80 ℃保存。

稱取0.1 g上述各處理EC，參考吉訓(xùn)志（2019）的方法，提取PAs并采用液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（Thermo scientific， Exactive plus，馬薩諸塞州，美國）測定PAs含量。

稱取2 g上述各處理EC，參照吉訓(xùn)志（2019）、趙福庚和劉友良（2000）的方法，提取粗蛋白，測定PAO、DAO、精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）和鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）的活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析1.2.1和1.2.2均重復(fù)2批次。每批次每處理各15皿，以每5皿為1個重復(fù)，重復(fù)3次。結(jié)果用2批次6次重復(fù)的平均值表示。1.2.4用第二批次EC進行測定，重復(fù)3次。采用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s多重比較（唐啟義，2010）。

2結(jié)果與分析

2.1 不同PAs對EC增殖率及細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 培養(yǎng)基添加PAs對EC增殖的影響含PAs培養(yǎng)基EC增殖率都顯著高于對照（M3）（表1）。其中，S2處理上的EC增殖率最高，是初始接種量的14.14倍；其次分別為S7及P3，EC增殖率分別是初始接種量的12.47和10.79倍；M3處理上的EC增殖率最低，是初始接種量的9.71倍。

含PAs培養(yǎng)基的EC顆粒較細小，僅在EC頂部或者邊緣部位分化個別原胚及非胚性愈傷組織（non-embryonic callus，NEC）；而M3處理上的EC顆粒稍粗且混雜較多原胚及NEC，較難挑出EC（圖1：A，M3）。

M3處理的EC細胞多為橢圓或圓形，處于同時分裂分化狀態(tài)；S2及S7處理的EC細胞多為長圓形，分裂旺盛；P3處理的EC細胞幾乎都為圓形且細胞外緣較厚（圖1：B，紅色箭頭）。

切片觀察發(fā)現(xiàn)含PAs培養(yǎng)基的EC細胞大多數(shù)分裂旺盛，含有早期子葉胚等。M3處理的EC細胞分裂分化同時進行，分化較多多細胞原胚或者早期球形胚（圖1：C，紅框）；P3處理的EC染色較濃且均勻，NEC染色較淺，極易區(qū)分；S2處理的EC有早期子葉胚等分化（圖1：C，黃框）；S7處理的內(nèi)部EC胚性細胞染色較深（圖1：C，黃箭頭），分裂旺盛，外緣非胚性細胞染色較淺（圖1：C，綠箭頭）。

2.1.2 恢復(fù)培養(yǎng)對EC增殖的影響將上述4種培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周獲得的EC分別重新轉(zhuǎn)接到不含PAs的M3培養(yǎng)基，培養(yǎng)3周后發(fā)現(xiàn)，S2M3處理的EC增殖率最高，是初始接種量的10.75倍；S7M3和P3M3處理的EC增殖率分別為初始接種量的9.70、9.67倍；M3M3的EC增殖率仍最低，為初始接種量的8.72倍。增殖率由高到低為S2M3、S7M3、P3M3，增殖趨勢與S2、S7、P3的相同且恢復(fù)培養(yǎng)（P3M3、S2M3及S7M3）的EC增殖率仍顯著高于對照M3M3（表2），低于含PAs的培養(yǎng)基（P3、S2及S7），說明添加的外源PAs對EC增殖的促進作用，在培養(yǎng)基中去掉PAs后被部分削弱。

與含PAs培養(yǎng)基相比較，恢復(fù)培養(yǎng)的EC分化乳白（圖2：A，黃箭頭）或者透明的原胚（圖2：B，紅箭頭）數(shù)量增多，P3M3及S2M3處理的EC分化的原胚較多（圖2：A，紅箭頭）。M3M3、P3M3及S7M3處理的EC細胞多為圓形或橢圓形，分裂分化交織成團，細胞聚集，夾雜多細胞原胚（圖2：B，黃框）；S2M3處理的EC細胞呈橢圓形，細胞質(zhì)體較多（圖2：B，S2M3）。切片觀察發(fā)現(xiàn)，PAs來源的EC恢復(fù)培養(yǎng)后，原胚形成層細胞裂解凋亡，無體胚發(fā)生，胚性細胞染色均勻，大小一致，與含PAs培養(yǎng)基上的EC以細胞分裂為主的現(xiàn)象一致。而M3M3處理的EC分化較多早期體胚（圖2：C，黃框）。

2.2 不同PAs培養(yǎng)基對體胚發(fā)生及萌發(fā)的影響

2.2.1 培養(yǎng)基添加不同PAs對體胚發(fā)生及萌發(fā)的影響含PAs培養(yǎng)基上增殖的EC體胚誘導(dǎo)效率顯著降低（表1），尤其是S2處理的體胚誘導(dǎo)效率最低，每克EC僅誘導(dǎo)出約32個體胚，遠遠低于對照（226個體胚）。其次為S7及P3處理，每克EC僅分別獲得56個、78個體胚。

PAs均顯著降低了體胚誘導(dǎo)效率，但對雙子葉胚誘導(dǎo)效應(yīng)不同（表1）。Put顯著提高了雙子葉胚的誘導(dǎo)效率，P3處理的每克EC可誘導(dǎo)40個雙子葉胚；S2和S7處理的雙子葉胚誘導(dǎo)效率顯著低于對照，每克EC僅分別產(chǎn)生7個、8個雙子葉胚。

M3處理的EC誘導(dǎo)獲得的多數(shù)為球形胚（圖3：M3，藍框）、子葉形胚（圖3：M3，綠框）等較多不同步體胚，P3處理的EC僅分化少量簇生球形胚（圖3：P3，藍框）及子葉胚（圖3：P3，綠框），而S2及S7處理的EC分化的幾乎都為簇生的鮮亮乳白球形胚（圖3：S2及S7，藍框）。含PAs培養(yǎng)基上的EC誘導(dǎo)的體胚飽滿，胚體呈現(xiàn)部分紅色（圖4：藍框）。

含PAs培養(yǎng)基上的EC誘導(dǎo)的體胚萌發(fā)數(shù)量顯著少于M3（表1），尤其是S2和S7處理的體胚萌發(fā)數(shù)量最少，每克EC僅有1個體胚萌發(fā)，P3處理下每克EC誘導(dǎo)獲得的體胚僅萌發(fā)3個，這些植株莖節(jié)間短小、粗壯、葉片深綠、較易移栽成活（圖4：B）。

2.2.2 恢復(fù)培養(yǎng)對體胚發(fā)生及萌發(fā)的影響經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的EC體胚和雙子葉胚的發(fā)生數(shù)量、體胚萌發(fā)數(shù)量均顯著低于對照（M3M3）（表2），P3M3處理的EC體胚和雙子葉胚的發(fā)生數(shù)量、體胚萌發(fā)數(shù)量仍高于S2M3和S7M3?；謴?fù)培養(yǎng)獲得的體胚鮮乳白色，狀態(tài)飽滿，然而在光下轉(zhuǎn)綠時間較長，萌發(fā)相對較緩慢。

如表2所示，恢復(fù)培養(yǎng)后的EC體胚誘導(dǎo)效率比P3、S2、S7培養(yǎng)基處理大幅提升，S2M3、S7M3處理的雙子胚發(fā)生效率大幅高于S2及S7處理，但P3M3處理的雙子葉胚發(fā)生效率反而低于P3處理。S2M3處理的體胚及雙子葉胚發(fā)生數(shù)量恢復(fù)最高，分別是S2處理的3.88和2.14倍；S7M3處理的體胚及雙子葉胚發(fā)生數(shù)量分別是S7處理的1.93和1.25倍；P3M3處理的體胚發(fā)生數(shù)量是P3處理的2.18倍，但P3M3處理的雙子葉胚數(shù)量（28個雙子葉胚/EC）低于P3處理（40個雙子葉胚/EC）。

P3M3、S2M3、S7M3處理的EC誘導(dǎo)的體胚萌發(fā)數(shù)量分別高于P3、S2及S7處理（表2）。P3M3處理獲得的體胚萌發(fā)數(shù)量最高，每克EC可獲得16株組培苗，顯著高于S2M3和S7M3處理。

2.3 不同PAs培養(yǎng)基上EC內(nèi)源PAs含量及其相關(guān)酶活性差異

2.3.1 不同PAs培養(yǎng)基上EC內(nèi)源PAs含量含PAs及恢復(fù)培養(yǎng)基上EC的Put含量都顯著高于對照，P3處理的Put含量最高，其次為S7處理，S2處理最低?；謴?fù)培養(yǎng)后，含PAs來源的EC的Put含量仍顯著高于M3M3處理，S2M3處理的Put含量顯著高于S2處理，而P3M3、S7M3處理的Put含量分別顯著低于P3、S7處理（圖5：A）。

含PAs培養(yǎng)基的Spd含量顯著高于M3及恢復(fù)培養(yǎng)處理，S2處理的Spd含量最高，其次為P3和S7處理?；謴?fù)培養(yǎng)后，PAs來源的EC的Spd含量都相應(yīng)降低，與M3M3差異顯著；P3M3處理的Spd含量最低，與S2M3和S3M3處理的Spd含量差異顯著，而S2M3處理的Spd含量和S3M3的無顯著性差異（圖5：B）。

與Spd含量變化一致，含PAs培養(yǎng)基的EC中Spm含量顯著高于M3處理，3種PAs處理的Spm含量差異顯著，其中S7處理的Spm含量最高，其次為P3和S2?；謴?fù)培養(yǎng)后，PAs來源的EC的Spm含量都相應(yīng)降低，顯著低于M3M3；S7M3處理的Spm含量最高，其次分別為S2M3和P3M3，3種處理的Spm含量差異顯著（圖5：C）。

含PAs培養(yǎng)基的PAs總量變化與Put一致且顯著高于M3處理；P3處理的PAs總量最高，其次為S7和S2處理?；謴?fù)培養(yǎng)后，P3M3、S2M3處理的總胺含量與對照無差異，僅S7M3處理的PAs總量顯著高于M3M3、P3M3和S2M3處理（圖5：D）。

2.3.2 不同PAs培養(yǎng)基上EC PAs代謝相關(guān)酶活性P3、S7處理的ODC活性與對照（M3）無顯著性差異，但P3、S7、M3處理的ODC活性與S2處理的差異顯著（圖6：A）?；謴?fù)培養(yǎng)后，P3M3處理的ODC活性顯著低于M3M3處理，S2M3和S7M3處理的ODC活性僅略低于M3M3處理；P3M3和S7M3處理的ODC活性分別較P3和S7處理降低，S2M3處理的ODC活性反而高于S2處理。

P3處理的ADC和DAO活性顯著高于M3處理，S7處理的ADC活性顯著低于M3處理，S2處理的ADC活性、S2和S7處理的DAO活性僅略低于M3處理。恢復(fù)培養(yǎng)后，含PAs培養(yǎng)基的ADC和DAO活性都降低且顯著低于M3M3處理；P3M3和S2M3處理的ADC活性顯著高于S7M3，而P3M3和S7M3處理的DAO活性顯著高于S2M3（圖6：B，C）。

S2處理的PAO活性顯著高于M3、P3和S7處理，M3處理的PAO活性僅略高于P3和S7處理?；謴?fù)培養(yǎng)后，S2M3、S7M3處理的PAO活性變化相反，S2M3處理的PAO活性顯著降低，S7M3處理的PAO活性顯著升高，P3M3處理的PAO活性僅略降低；P3M3處理的PAO活性與M3M3、S2M3及S7M3處理的PAO活性差異顯著，但S2M3和S7M3處理的PAO活性僅略高于M3M3處理（圖6：D）。

3討論

大量研究證實，PAs在EC的增殖、誘導(dǎo)體胚發(fā)生和萌發(fā)等離體再生過程中起著重要作用（Rakesh et al.， 2021）。本研究發(fā)現(xiàn)外源PAs均明顯促進荔枝EC增殖，這一結(jié)果與Paul等（2009）和Satish等（2015）分別在苦瓜（Momordica charantia）、小米（Eleusine coracana）上的研究一致。Paul等（2009）研究表明外源Put將苦瓜EC的鮮重及體胚發(fā)生數(shù)量分別提高了5倍和2.5倍，Satish等（2015）研究指出外源Spd明顯促進小米的EC增殖及體胚發(fā)生，提高了再生頻率，說明不同PAs在EC增殖及體胚發(fā)生中起積極作用。但在本研究中，外源PAs反而抑制荔枝體胚發(fā)生，EC增殖率越高時其體胚發(fā)生數(shù)量就越低，可能是由于EC增殖較快，消耗大量營養(yǎng)，造成營養(yǎng)競爭，導(dǎo)致EC不能分化原胚或者原胚分化能力減弱。這與甜瓜（muskmelon）（薛淑媛，2013）、菊花（Chrysanthemum）（郭俊娥，2014）等報道相似。本研究還發(fā)現(xiàn)Put促進荔枝體胚同步發(fā)生，這一現(xiàn)象與張佳琪等（2022）的研究結(jié)果一致，張佳琪等指出適宜濃度PAs均能顯著提高黑果枸杞（Lycium ruthenicum）體胚誘導(dǎo)率及同步化發(fā)生指數(shù)，而較高濃度PAs則會抑制黑果枸杞的體胚誘導(dǎo)率，可能與PAs在一定程度上促進EC增殖，消耗營養(yǎng)引起饑餓效應(yīng)，導(dǎo)致EC都保持在一個相對一致的胚性狀態(tài)有關(guān)。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)PAs可改善EC狀態(tài)，這與戴亞楠等（2015）在棉花（cotton）上的研究現(xiàn)象相似，戴亞楠等發(fā)現(xiàn)PAs處理后的棉花EC表現(xiàn)出利于分化體胚的棕色稀泥狀態(tài)，而多胺抑制劑處理下的EC嚴(yán)重褐變；胡文等（2010）研究也指出PAs降低了秈稻EC的褐化率，說明PAs在維持EC細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)上起重要作用。

Berberich等（2015）研究指出PAs的含量與外界環(huán)境關(guān)系密切，當(dāng)植物受到非生物逆境脅迫時，內(nèi)源PAs濃度迅速發(fā)生變化，刺激相關(guān)代謝酶活性，提高植物體內(nèi)PAs的含量，增強脅迫條件下膜的穩(wěn)定性。在本研究中，外源PAs增加了3種內(nèi)源PAs的含量，提高了EC的增殖率，與高娃（2008）和Fu等（2019）的研究結(jié)果一致，高娃（2008）報道了外源Put提高沙地云杉（Picea mongolica）EC中各類PAs含量，F(xiàn)u等（2019）也指出Spd能提高水稻（rice）內(nèi)源Spd和Spm的含量。這可能是由于內(nèi)源性PAs對非生物應(yīng)激的保護反應(yīng)，或者內(nèi)源性PAs參與其他代謝途徑，如氮代謝，以及與激素或信號分子的相互作用（Baron & Stasolla，2008），為EC的生長發(fā)育提供營養(yǎng)。本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)PAs處理過的EC恢復(fù)培養(yǎng)后，Put含量仍顯著高于對照，而Spd和Spm含量均顯著低于對照，這可能與植物生長需要大量Put，因此急需合成Put有關(guān)（Kiekowska & Adamus， 2021）；或者由于PAs刺激后，EC受殘存外源PAs影響，內(nèi)源Put含量短暫居高，但由于解除PAs作用后，內(nèi)源Put分解途徑減弱，因此下游Spd和Spm含量降低。

Rakesh等（2021）研究表明底物的增加加快了內(nèi)源PAs的轉(zhuǎn)化率，在ADC或ODC的催化下，精氨酸和鳥氨酸分別通過ADC和ODC途徑合成Put，然后通過亞精胺合酶和精胺合酶合成Spd和Spm。本研究發(fā)現(xiàn)外源Put刺激荔枝EC中的ADC和ODC活性總體上呈上升趨勢，ADC反應(yīng)迅速，并保持較高的增長速率，而Put對ODC活性增加的影響要小得多，說明ADC途徑是荔枝EC中合成Put的主要路徑，這與Mengoli等（1989）和Sun等（2021）在胡蘿卜（Daucus carota）、紅掌（Anthurium andraeanum cv. Alabamb）中的研究結(jié)果一致，他們都指出ADC活性的增強是內(nèi)源PAs合成的主要原因。然而，也有報道稱內(nèi)源PAs的積累主要是通過增加ODC活性來實現(xiàn)（Saos & Hourmant，2001）。這些結(jié)果表明，Put的合成途徑與不同的外源物質(zhì)或脅迫有不同的反應(yīng)，也可能具有物種特異性。另外，在本研究中，Spd和Spm處理降低了ADC和ODC活性，推測是由于EC利用外源Spd和Spm引起內(nèi)源Spd和Spm含量過高，反饋抑制了Put分解，導(dǎo)致ADC和ODC活性降低；恢復(fù)培養(yǎng)解除PAs效應(yīng)后，ADC和ODC活性隨著Put含量下降而減弱，這可能與PAs或作物的種類有關(guān)，這些結(jié)果可以幫助我們更好地了解不同種類PAs在荔枝EC增殖及體胚發(fā)生中的特異性作用。

較多研究表明，外源PAs含量的增加加速了內(nèi)源PAs的代謝，DAO或PAO活性升高，促使Spd或Spm降解活動活躍，為作物生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，更好地平衡了轉(zhuǎn)化和代謝（Agudelo-Romero et al.， 2013；程文翰，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)P3處理的DAO及S2處理的PAO活性顯著高于對照，而其他處理的DAO和PAO活性與對照無顯著差異，陳小飛（2005）的研究則指出Put提高了石刁柏（Asparagus officinalis cv. UC800）EC中的PAO活性，這可能與不同作物EC生長時所需的PAs種類及含量不同有關(guān)，導(dǎo)致PAs分解酶活性存在差異。另外，本研究中Spm處理的分解酶DAO和PAO活性變化不大，而恢復(fù)培養(yǎng)后S7M3處理的PAO活性反而升高，推測與Spm是Put及Spd的下游產(chǎn)物，其積累及分解代謝相對滯后相關(guān)，或者與EC生長所需含量相對較低有關(guān)（Tiburcio & Alcázar， 2017），其作用機理有待進一步驗證。

4結(jié)論

外源PAs可通過影響PAs代謝相關(guān)酶活性來改變內(nèi)源PAs含量，進而提高荔枝EC增殖效率，促進體胚同步發(fā)生，但降低了體胚誘導(dǎo)效率。這些結(jié)果為進一步研究PAs調(diào)節(jié)荔枝EC的增殖和體胚發(fā)生機制提供了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯周翠鳴）