煙草香氣相關(guān)基因CRISPR/Cas9編輯突變體庫的構(gòu)建

摘要： 為探究CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建煙草突變體庫的可行性，該研究以烤煙品種‘紅花大金元’為實驗材料篩選了100個可能參與煙草香氣代謝的基因，設(shè)計相應(yīng)的100個sgRNA并構(gòu)建了由100個CRISPR/Cas9編輯載體組成的質(zhì)粒庫，獲得轉(zhuǎn)基因材料后分析了載體的共轉(zhuǎn)化率、靶向編輯率和脫靶編輯情況。結(jié)果表明：（1）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)100個sgRNA的共轉(zhuǎn)化后，在172個陽性轉(zhuǎn)化株中檢測到了其中的77個sgRNA，共轉(zhuǎn)化率為77%。（2）在77個攜帶sgRNA的轉(zhuǎn)基因后代中，69個sgRNA對目標(biāo)基因進行了靶向編輯，編輯率為89.6%。（3）脫靶位點測序檢測發(fā)現(xiàn)，只有1個sgRNA在非目標(biāo)靶位點產(chǎn)生了脫靶編輯，表明CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在煙草中的脫靶概率非常低。綜上所述，利用CRISPR/Cas9載體庫共轉(zhuǎn)化對煙草基因進行高通量靶向編輯以構(gòu)建突變體庫的方法切實可行，并且該方法有共轉(zhuǎn)化率高、編輯率高和脫靶編輯概率低等特點。

關(guān)鍵詞： 煙草， CRISPR/Cas9， 煙草香氣， 靶向編輯， 脫靶編輯

中圖分類號： Q943文獻標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1278-11

Construction of a mutant library associated witharoma genes in tobacco using CRISPR/Cas9

ZENG Wanli1， LIANG Gang2， GAO Qian1， LI Yuanchuan3， XU Li1，JIANG Jiarui1， XU Yong1， XIANG Haiying1*

（ 1. Yunnan Key Laboratory of Tobacco Chemistry， R & D Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.， Kunming 650231， China;2. CAS Key Laboratory of Tropical Plant Resources and Sustainable Use， Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academyof Sciences， Kunming 650223， China; 3. Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China ）

Abstract： To explore the feasibility of constructing a tobacco mutant library using the CRISPR/Cas9 gene editing technology， we designed sgRNAs of 100 aroma related genes in tobacco， constructed a plasmid library composed of 100 corresponding CRISPR/Cas9 editing vectors， and analyzed the co-transformation rate， on-target editing rate， and off-target editing of transgenic offspring using the tobacco variety ‘Honghua Dajinyuan’ as experimental material in this study. The results were as follows： （1） After co-transformation of 100 sgRNAs mediated by Agrobacterium tumefaciens， 77 of them were detected in 172 positive transformation strains， with a co-transformation rate of 77%. （2） Among 77 transgenic offspring carrying sgRNA， 69 sgRNAs edited the target genes， with an editing rate of 89.6%. （3） Sequencing detection revealed that only one sgRNA produced off-target editing at a non-target site， indicating a very low probability of off-target editing of CRISPR/Cas9 in tobacco. In summary， it is feasible to construct a mutant library by the co-transformation of a CRISPR/Cas9 vector library to edit a large number of candidate target genes in tobacco. This method has the characteristics of high co-transformation rate， high editing rate， and low probability of off-target editing.

Key words： tobacco， CRISPR/Cas9， tabacco aroma， on-target editing， off-target editing

CRISPR/Cas9基因編輯是一種在基因組水平上對DNA序列進行定點改造的遺傳操作技術(shù)。CRISPR基因編輯系統(tǒng)由Cas9核酸酶和引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）組成。sgRNA的一段（～20 bp）與靶基因互補的DNA序列可以特異性地識別靶DNA，而Cas9核酸酶對靶DNA進行切割，造成雙鏈靶DNA 的斷裂，誘發(fā)內(nèi)源性DNA的非同源末端修復(fù)機制（Jinek et al.， 2012）。DNA修復(fù)過程會引起DNA核苷酸的缺失或增加等錯配，導(dǎo)致基因移碼突變，實現(xiàn)基因敲除。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)也可以對目的基因進行特定修飾（如點突變和基因插入）。例如，在CRISPR基因敲除構(gòu)建策略的基礎(chǔ)上，添加計劃插入修飾的DNA片段即可對特定基因插入和替換遺傳修飾。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)因其低成本、構(gòu)建簡單和高效等優(yōu)點，已經(jīng)在人類、動物和植物等生物體中被廣泛利用，目前已成為基因功能研究和基因定向修飾的一個有效工具（Knott & Doudna 2018; Chen et al.， 2019）。在植物中的應(yīng)用表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅可高效誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA突變，而且誘導(dǎo)的突變可穩(wěn)定遺傳。該技術(shù)可以在基因組水平上對DNA序列進行定點改造以創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)資源。例如：Li等（2023）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將普通煙草中N’基因的抗性核心區(qū)域精準(zhǔn)替換為野生煙中N’alata基因的對應(yīng)區(qū)域，使得栽培煙草獲得了TMV-U1抗性；Qin等（2021）利用CRISPR技術(shù)對NIC基因進行編輯產(chǎn)生了尼古丁含量極低的煙草新種質(zhì)；CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)還可用于水稻和番茄等作物的快速馴化（Lemmon et al.， 2018; Li et al.， 2018; Yu et al.， 2021），為加快新品種的創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在煙草中的成功應(yīng)用（Schachtsiek & Stehle， 2019; Zhang et al.， 2023），預(yù)示著該技術(shù)在未來煙草育種中蘊藏著巨大的潛力。

煙草香味是煙葉及卷煙感官質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。煙草的香氣前體物主要有質(zhì)體色素、西柏烷和賴百當(dāng)類菇醇、酚類化合物、氨基酸和還原糖、脂類、生物堿六大類（汪耀富等，2006）。因其內(nèi)在香氣前體合成相關(guān)基因的表達不同，不同煙草品種的香氣前體種類及含量不同（呂婧等，2014），換言之，煙草香氣前體種類和含量很大程度上由煙草本身的遺傳因素決定。隨著煙草基因組測序的完成，次生代謝產(chǎn)物相關(guān)合成酶的基因注釋也日趨完善。因此，從基因?qū)用嫱诰蚩刂茻煵菹銡馇绑w物的關(guān)鍵基因，通過遺傳操作改變相關(guān)基因的表達水平可以實現(xiàn)定向培育特定香味的煙草品種。利用CRISPR-Cas9對煙葉香味基因進行高通量靶向突變，將為優(yōu)異性狀新種質(zhì)的創(chuàng)建、重要功能基因的批量挖掘以及煙草分子設(shè)計育種奠定基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)煙草育種工作主要靠多親本多組合，也就是將不同優(yōu)良性狀的煙草種質(zhì)資源進行遺傳整合，構(gòu)建優(yōu)質(zhì)煙草新品種。但是，這種傳統(tǒng)的雜交育種方式不僅耗費大量人力及財力，而且要耗費多年時間。一些優(yōu)異性狀因聯(lián)鎖累贅而無法整合在同一品種里，也在一定程度上限制了優(yōu)異品種的創(chuàng)制。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不僅可以不依賴于遺傳雜交對緊密連鎖的基因進行同時編輯，還可以突破傳統(tǒng)雜交育種無法將連鎖優(yōu)異位點進行整合的限制，因此利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)有望加速煙草香味品質(zhì)改良。

盡管基因編輯技術(shù)已被應(yīng)用于構(gòu)建水稻、玉米等突變體庫，但尚未應(yīng)用于煙草基因突變體庫的構(gòu)建。本研究以煙草栽培品種‘紅花大金元’為材料，對其100個可能與煙草香味品質(zhì)相關(guān)的功能基因進行靶向設(shè)計，構(gòu)建CRISPR/Cas9載體庫并進行共轉(zhuǎn)化，獲得了煙草香味品質(zhì)相關(guān)的基因編輯突變體庫?；虬邢蚝兔摪蟹治霰砻鳎肅RISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建煙草突變庫是切實可行的。本研究旨在驗證煙草高通量基因編輯技術(shù)的可行性，為煙草基因功能研究和新種質(zhì)創(chuàng)制提供新方法和新思路。

1材料與方法

1.1 實驗材料

本文以烤煙品種‘紅花大金元’為實驗材料。

1.2 靶位點序列設(shè)計

香味相關(guān)候選基因的注釋參考煙草基因組數(shù)據(jù)庫NCBI Nicotiana tabacum Annotation Release 100（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_euk/Nicotiana_tabacum/100/）。利用在線工具CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/; Xie et al.， 2017）設(shè)計目標(biāo)基因的特異靶位點，從候選靶位點中選擇位于基因編碼區(qū)前端的靶點。依據(jù)靶位點設(shè)計和克隆原則設(shè)計引物，正向引物為5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTT-3′，反向引物為5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATC-3′。其中，正向引物的20個N是靶位點序列，反向引物的20個N是靶位點序列的反向互補序列，引物退火后的黏性末端恰好與載體Bsa I線性化后的載體形成堿基互補配對。

1.3 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建方法

以克隆一個基因的CRISPR/Cas9 載體為例：（1）按照上述的引物設(shè)計原則，合成相應(yīng)的正向引物和反向引物；（2）將正向引物和反向引物進行退火反應(yīng)，形成雙鏈DNA ［退火反應(yīng)體系：5×Annealing Buffer for DNA Oligos 4 μL，上下游引物各4 μL（50 μmol·μL-1），Nuclease-free water 補至20 μL。反應(yīng)程序： 95 ℃ 5 min，每8 s 下降0.1 ℃，直至25 ℃（約90 min），4 ℃保存］；（3）將退火反應(yīng)得到的產(chǎn)物連接到經(jīng)Bsa I 酶切的CRISPR/Cas9載體pORE-Cas9/ gRNA上 ［連接體系：退火產(chǎn)物2 μL，酶切產(chǎn)物3 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase（400 U·μL-1）1 μL，無菌水補至20 μL］；（4）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α受態(tài)細胞，利用菌落PCR篩選陽性克?。ㄉ嫌我餅閁6-F：5′-GATCTCCCAGTCACGACGTT-3′，下游引物為目的基因上靶位點的反向互補序列）；（5）擴繁陽性菌斑，提取質(zhì)粒，進行測序驗證。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化

將100個質(zhì)粒的濃度均調(diào)整為l00 ng·μL-1，每個取1 μL，混勻，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301，涂布在含有卡那霉素和慶大霉素的YEB培養(yǎng)基上，黑暗條件下28 ℃培養(yǎng)3 d。用液體YEB培養(yǎng)基洗脫全部菌落，-80 ℃凍存，作為后期轉(zhuǎn)化煙草的CRISPR-Cas9編輯菌種。煙草種子播種于育苗培養(yǎng)皿中育苗，待長到4片葉子（約30 d），便可將其移入培養(yǎng)瓶中，于26 ℃、16 h 光/8 h暗條件繼續(xù)培養(yǎng)30 d，備用。 在超凈工作臺中，用打孔器將葉片打成直徑5 mm大小的圓形葉盤。用40 mL MS液體培養(yǎng)基將YEB培養(yǎng)基活化的CRISPR-Cas9編輯菌種懸浮成菌液（OD600： 0.6～0.8）置于50 mL離心管內(nèi)。將葉盤轉(zhuǎn)移到盛有菌液的 50 mL離心管內(nèi)，浸泡侵染10 min，再平鋪于MS固體培養(yǎng)基上，28 ℃，黑暗， 共培養(yǎng)3 d。之后將葉盤下表面接觸培養(yǎng)基，放置于含NAA（0.02 μg·mL-1）、6-BA（0.5 μg·mL-1）、羧芐青霉素（500 μg·mL-1）、卡那霉素（100 μg·mL-1）的MS培養(yǎng)基上，在（28 ℃，光照16 h）/（25 ℃，黑暗8 h）條件下培養(yǎng)，至長出分化芽（約2個月后），切下分化芽（1～2 cm）插入含有羧芐青霉素和卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，分化芽約10 d后出根。

1.5 編輯素材的鑒定

為每個煙草單株編號，每個單株取少許葉片提取DNA。用公共引物 （正向：5′- CTTCAAAAGT

CCCACATCGCTTAG-3′； 反向： 5′-TGCAGGACTAG

TGGATCAGC-3′）進行PCR，并用正向引物對產(chǎn)物進行測序。通過序列比對，提取相應(yīng)單株的靶位點序列。根據(jù)靶點序列匹配相應(yīng)的靶基因，并在靶位點兩側(cè)設(shè)計靶基因的特異性引物，進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物測序。通過序列比對分析相應(yīng)單株的靶位點是否被編輯。

2結(jié)果與分析

2.1 靶位點設(shè)計

根據(jù)煙草基因組的功能注釋以及文獻調(diào)研，本研究選擇了100個可能參與煙草香氣前體物質(zhì)合成相關(guān)的基因（圖1），它們編碼的蛋白參與次生代謝產(chǎn)物合成，離子吸收轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。CRISPR/Cas9編輯技術(shù)可用來對特定基因進行編輯以創(chuàng)制功能缺失突變體。CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)由Cas9蛋白和sgRNA組成，其中Cas9負責(zé)剪切DNA，而sgRNA前端20個堿基通過堿基互補配對的方式識別靶位點。靶位點的3′端還應(yīng)包含一個由3個堿基NGG（N代表4種堿基中的一種）組成的原間隔相鄰基序 （protospacer adjacent motif，PAM）基序。同一個基因通常有多個靶位點可以選擇。為保證對特定基因的編輯特異性，本研究利用CRISPR/Cas9設(shè)計工具CRISPR-GE為每個基因設(shè)計了特異性的靶位點。為確保通過CRISPR/Cas9編輯獲得的突變體為功能缺失型突變體，靶位點設(shè)計在目標(biāo)基因靠前的外顯子編碼區(qū)區(qū)域（圖1）。針對同一個基因存在多個不同轉(zhuǎn)錄本情況，靶位點選擇在這些轉(zhuǎn)錄本的共有外顯子編碼區(qū)域。煙草屬于異源四倍體植物，某些基因通常存在一個序列高度相似的同源基因。對一些存在序列高度相似同源序列的基因，設(shè)計工具有時無法設(shè)計靶向單一基因的sgRNA（單靶點sgRNA）。針對這種情況，本研究選擇了可以同時靶向兩個同源基因的sgRNA（雙靶點sgRNA）。由于靶位點的GC含量比例增加可以提高編輯率，所以當(dāng)存在多個可選靶位點時，本研究選擇了GC含量最高的靶位點（圖1）。

2.2 CRISPR/Cas9載體庫構(gòu)建

在本研究所用的基因編輯載體中，煙草花葉病毒的35S啟動子用來驅(qū)動Cas9基因，擬南芥的U6-26啟動子用來驅(qū)動sgRNA骨架達。載體上的sgRNA前端預(yù)留了一段20 bp的插入序列，該序列包含兩個Bsa I酶切位點（圖2）。載體經(jīng)Bas I酶切后，產(chǎn)生兩個特異性的黏性末端，可用來連入20 bp的靶位點序列。根據(jù)方法中提及的靶位點引物設(shè)計原則合成一對包含20 bp反向互補序列的引物，這一對引物經(jīng)過退火反應(yīng)后形成的雙鏈DNA包含兩個與載體匹配的黏性末端。由于該DNA的兩個黏性末端恰好可以與編輯載體的黏性末端完全匹配（圖2），所以可以通過T4 DNA酶將片段與載體連接。連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性板篩選菌斑，PCR擴增鑒定陽性克隆，測序正確后提取質(zhì)粒。通過該流程，本研究總共構(gòu)建了100個CRISPR/Cas9質(zhì)粒，這些質(zhì)粒按等比例混合后形成了一個CRISPR/Cas9載體庫。

2.3 CRISPR/Cas9編輯分析

為了構(gòu)建突變體庫，本研究將上述的CRISPR/Cas9載體庫轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，再利用抗生素篩選后獲得陽性轉(zhuǎn)基因煙草幼苗。由于轉(zhuǎn)基因植物攜帶了U6-26/sgRNA骨架，因此可以在U6-26啟動子區(qū)和sgRNA區(qū)分別設(shè)計上、下游引物并通過PCR測序獲取陽性轉(zhuǎn)基因植物的靶位點序列（圖3）。根據(jù)提取的靶位點序列找到其對應(yīng)的靶位點及靶基因。在靶位點兩側(cè)設(shè)計特異性引物，PCR擴增后測序，然后通過序列比對分析判斷靶基因是否在靶位點附近被編輯。本研究從172個轉(zhuǎn)基因植株中鑒定到77個不同sgRNA的植株。收獲T0代陽性植株的種子后，種植T1代植株，然后從每個sgRNA株系中選擇7個單株進行靶位點測序分析。

測序結(jié)果表明，在61個單靶點sgRNA中，55個有靶向編輯，6個沒有靶向編輯；在16個雙靶點sgRNA中，13個靶向編輯了雙靶基因，1個靶向編輯了2個靶基因的其中1個，2個未靶向編輯靶基因（表1）。sgRNA的靶向編輯率為89.6%（69/77）。

2.4 CRISPR/Cas9脫靶編輯分析

為了評估編輯植株中是否存在脫靶編輯的情況，本研究利用BLAST軟件預(yù)測了77個sgRNA的潛在脫靶位點。已有研究表明，sgRNA與脫靶位點的堿基錯配數(shù)量大于1個就可以阻止該位點被編輯，而1個堿基錯配仍有較大可能會導(dǎo)致脫靶編輯發(fā)生（Naeem et al.， 2020），因此本研究只分析了存在1個錯配堿基的脫靶位點是否被編輯。在獲得的77個sgRNA中，20個sgRNA有1個脫靶位點，1個sgRNA有2個脫靶位點（表1）。在脫靶位點兩側(cè)設(shè)計特異性引物后進行PCR擴增測序，結(jié)果表明只有1個sgRNA的脫靶位點被編輯（圖4）。

3討論

煙草的香味來源于在煙葉片中合成并累積的香味化學(xué)成分。香味相關(guān)成分的含量和種類受到相關(guān)代謝途徑基因的類型及表達水平的控制。受限于煙草種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)方面的研究不足，煙草香味品質(zhì)相關(guān)代謝物合成的基因尚未被大規(guī)模鑒定。煙草基因組測序和基因功能注釋的完成為煙草香味的研究提供了新動力。本研究利用生物信息學(xué)分析獲得了100個與煙草香味品質(zhì)相關(guān)的基因，研究這些基因的功能可為后續(xù)改善煙草香味品質(zhì)提供基因資源。

確定某個基因是否與煙草香味相關(guān)并對其功能進行解析很大程度上依賴于相關(guān)基因突變體的研究。基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)日趨成熟，利用該技術(shù)研究和創(chuàng)制不同香味品質(zhì)的煙草種質(zhì)資源對于煙草工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展尤為重要。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)高通量構(gòu)建突變體庫已經(jīng)應(yīng)用于水稻（Lu et al.， 2017; Meng et al.， 2017; Chen et al.， 2022）、番茄（Jacobs et al.， 2017）、玉米（Liu et al.， 2020）和大豆（Bai et al.， 2020）等二倍體植物。本研究成功將CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于四倍體植物煙草突變體庫的構(gòu)建。最近，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已成功應(yīng)用于油菜突變體庫的構(gòu)建（He et al.， 2023），這也是該技術(shù)首次應(yīng)用于十字花科的異源四倍體植物。本研究的編輯對象煙草是茄科的異源四倍體植物，該突變體庫的成功構(gòu)建為在茄科多倍體植物中開展高通量靶向編輯提供了一個成功的案例。

在利用農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化獲得CRISPR-Cas9基因編輯突變體庫的方法中，共轉(zhuǎn)化率、編輯率和脫靶編輯率是研究人員比較關(guān)注的問題。本研究結(jié)果表明，煙草的共轉(zhuǎn)化率可以達到77%，因此可以獲得大多數(shù)載體的轉(zhuǎn)基因煙草，這保證了煙草基因突變體庫的高覆蓋率。煙草的轉(zhuǎn)基因通過愈傷組織轉(zhuǎn)化實現(xiàn)，單次轉(zhuǎn)化的基因編輯率高。本研究證明，共轉(zhuǎn)化多基因編輯載體同樣可以實現(xiàn)較高的基因編輯率（89.6%）。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)潛在的脫靶作用是制約其應(yīng)用的一個主要因素。本研究進行了脫靶位點分析，結(jié)果顯示，77個sgRNA中只有1個位點產(chǎn)生了脫靶編輯，這說明CRISPR-Cas9對靶位點的識別具有很強的特異性。由于本研究未進行全基因組測序分析，所以不能排除編輯植株仍然存在脫靶編輯的可能性。值得提及的是，在編輯植物中總能篩選到Cas9基因與編輯位點位于不同染色體上的植株，在育種實踐中可以通過遺傳分離和純化選擇去除轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽或脫靶編輯位點。

4結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了煙草香味相關(guān)基因的突變體庫，表明CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)高通量編輯煙草基因可用于構(gòu)建煙草突變體庫，該方法具有共轉(zhuǎn)化率高、靶向編輯率高和脫靶編輯率低等特點。本研究為煙草香味功能基因的研究提供了遺傳資源，為煙草香味重要性狀的分子改良提供了種質(zhì)資源。該技術(shù)方法并不是僅限于構(gòu)建煙草香味品質(zhì)相關(guān)基因的突變體庫，而是可用于在煙草中構(gòu)建研究人員感興趣的任何性狀的基因突變體庫，這將加速煙草功能基因的研究。

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（責(zé)任編輯周翠鳴）