浙江紅花油茶 × 廣寧紅花油茶雜交子代的表型性狀及其SSR分子鑒定

摘要： 浙江紅花油茶（Camellia chekiangoleosa）種仁含油率和油酸含量高，廣寧紅花油茶 （C. semiserrata） 具有較強(qiáng)的生長勢和抗性。為了利用浙江紅花油茶和廣寧紅花油茶的優(yōu)點(diǎn)，培育優(yōu)良種質(zhì)材料，該研究對浙江紅花油茶與廣寧紅花油茶的45個F1雜交子代進(jìn)行表型性狀分析，以掌握雜交子代的表型性狀情況，同時利用SSR標(biāo)記對其進(jìn)行雜種真?zhèn)舞b定，并篩選可用于油茶雜交子代鑒定的SSR標(biāo)記。結(jié)果表明：（1）浙江紅花油茶 × 廣寧紅花油茶的F1子代表現(xiàn)為樹形高大、生長迅速且其葉脈、萼片、柱頭均傾向于父本廣寧紅花油茶的性狀，而花和葉片形態(tài)等性狀與母本浙江紅花油茶接近，葉片顏色與大小等特征介于雙親特征之間。（2）從32個SSR標(biāo)記中篩選出了8個可區(qū)分雙親且能明確雜交子代來源的完全互補(bǔ)型標(biāo)記，用于開展雜交子代鑒定，其中7個標(biāo)記雜種鑒定效率高達(dá)100%，1個標(biāo)記雜種鑒定效率為55.56%；8個標(biāo)記相互補(bǔ)充鑒定出45個雜交子代全是真雜種。（3）8個SSR標(biāo)記對雜交子代進(jìn)行的鑒定能力驗證表明，利用這些SSR標(biāo)記鑒定油茶雜交子代是可行的。該研究結(jié)果為油茶物種間的雜交育種提供了參考，同時也為后續(xù)油茶物種間的雜交子代SSR標(biāo)記鑒定提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 紅花油茶， 雜交子代鑒定， SSR標(biāo)記， 表型性狀， 雜交育種

中圖分類號： Q943文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1269-09

Phenotypic traits and SSR molecular identification of hybridprogenies of Camellia chekiangoleosa × C. semiserrata

ZHOU Wencai1 ， TIAN Qianqian1，2， LI Tian1， HUANG Bin1， WEN Qiang1*

（ 1. Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Oil Tea Resources of Jiangxi Province， Jiangxi Academy ofForestry， Nanchang 330013， China; 2. Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China ）

Abstract： Camellia chekiangoleosa has high oil concentration and oleic acid content， while C. semiserrata has strong growth vigor and resistance. In order to make the utmost of the advantages of C. chekiangoleosa and C. semiserrata and cultivate excellent germplasm materials， the phenotypic traits of 45 F1 hybrid progenies of C. chekiangoleosa and C. semiserrata were analyzed to grasp the phenotypic traits of the hybrid progenies. In addition， SSR markers were used to identify hybrids， and SSR markers that could be used to identify the hybrid progenies of oil tea were screened. The results were as follows：（1） The F1 hybrids of C. chekiangoleosa × C. semiserrata showed tall tree and rapid growth， and their leaf veins， sepals and stigmas were all tended to the traits of the male parent C. semiserrata， while flower and leaf morphologies and other traits were similar to the female parent C. chekiangoleosa， and the characteristics of leaf color and size were between those of the parents. （2） From the 32 SSR markers， eight fully complementary markers that could distinguish parents and determine the origin of offspring were screened out for identification of hybrid progenies， among which the hybrid identification rates of seven markers were as high as 100%， and the hybrid identification rate of one marker was 55.56%. And 45 hybrid progenies were all true hybrids identified by the complementarity of eight markers. （3） The eight SSR markers were used to verify the ability to identify the hybrid progenies， indicating that it is feasible to use these SSR markers to identify the authenticity of the hybrid progenies of oil tea. This study results provide a reference for interspecies cross breeding of oil tea， and also provide a reference for the SSR marker identification of hybrids of oil tea.

Key words： Camellia chekiangoleosa， hybrid progeny identification， SSR markers， phenotypic traits， cross breeding

油茶泛指山茶科山茶屬植物中具有較高油用價值的木本油料作物，其茶油中含有大量對人體有益的油酸、亞油酸以及生育酚、角鯊烯等活性物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的功能性食用油（羅曉嵐和朱文鑫，2010；秦聲遠(yuǎn)等，2018；田仟仟等，2021）。浙江紅花油茶（Camellia chekiangoleosa）和廣寧紅花油茶 （C. semiserrata） 是油茶中的主栽品種（孫佩光等，2012）。浙江紅花油茶又名浙江紅山茶，喜夏涼、冬寒、不耐熱，主要分布于江西、浙江、湖南、湖北、皖南等山區(qū)海拔600～1 400 m的山地。廣寧紅花油茶，即南山茶，喜溫暖濕潤，耐半陰，具有較強(qiáng)的生長勢，主要分布于廣東和廣西。與其他油茶物種相比，無論是種仁脂肪酸含量，還是種仁營養(yǎng)成分價值，紅花油茶都有著較大的優(yōu)勢，尤其是浙江紅花油茶，其油酸含量平均在80%以上，種仁含油率在60％以上，顯著高于普通油茶（含量40%左右）（吳雪輝等，2016；周文才等，2019；賀義昌等，2020），而種仁含油率和油酸含量是產(chǎn)量和品質(zhì)的重要指標(biāo)。此外，其相對含量高低不受果實(shí)采收時期的影響，具有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的特性，為高種仁含油率、高品質(zhì)的油茶優(yōu)良材料（田瀟瀟等，2018；周文才等，2019）。

雜交育種試驗成本低、后代性狀分離廣且雜交子代兼具雙親優(yōu)良性狀，是培育油茶新品種的重要途徑（李凌，2016）。因此，利用油用性狀優(yōu)良的浙江紅花油茶與生長勢和抗性強(qiáng)的廣寧紅花油茶進(jìn)行雜交，有望培育性狀更加優(yōu)良的高產(chǎn)雜交子代。周盛等（2001）研究表明油茶物種間的雜交子代性狀多表現(xiàn)為雙親性狀中間型，但有傾向于某一親本的趨勢。楊志玲等（2004）以浙江紅花油茶為母本與其他紅山茶組物種進(jìn)行雜交發(fā)現(xiàn)，浙江紅花油茶與廣寧紅花油茶的雜交組合獲得的雜交結(jié)實(shí)率最高。目前，浙江紅花油茶與廣寧紅花油茶的雜交子代性狀情況相關(guān)研究未見報道。

油茶屬蟲媒異花授粉植物，其遺傳雜合度高，存在雜交育種周期長以及雜交過程中易發(fā)生混雜致使F1子代出現(xiàn)假子代等問題。SSR標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，對二倍體材料擴(kuò)增后，可根據(jù)F1子代基因型來鑒定真假子代。表現(xiàn)具有雙親特征條帶或具父本特征條帶的子代樣本為真雜種，而只表現(xiàn)為母本特征條帶無父本特征條帶的為假雜種（胡文舜等，2015）。有學(xué)者認(rèn)為浙江紅花油茶是宛田紅花油茶或廣寧紅花油茶演化到山茶品種群的過渡物種，又或是廣寧紅花油茶到香港紅山茶（C. hongkongensis）演化過程中一個至關(guān)重要的物種（Yusuke，1988），這就不難解釋自然條件下浙江紅花油茶與廣寧紅花油茶等近緣種間的生殖隔離不明顯，會產(chǎn)生雜交子代的現(xiàn)象（顧志建和孫先鳳，1997）。另外，在實(shí)施人工雜交育種的過程中也存在外來花粉污染造成子代混雜的可能，而明確F1子代的真實(shí)性是構(gòu)建遺傳圖譜、開展子代測定等的前提（周文才等，2015）。因此，有必要對雜交子代進(jìn)行早期鑒定，以提高育種效率，節(jié)約成本。

子代鑒定的方法主要有形態(tài)特征、染色體計數(shù)、熒光原位雜交和分子標(biāo)記等。根據(jù)雜交子代的表型來判斷子代的真實(shí)性是最基本的方法。該方法具有直觀便捷的優(yōu)點(diǎn)，但鑒定周期長且易受觀察者主觀和栽培環(huán)境影響，無法保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性（Ye et al.，2013；Dridi et al.，2018）。細(xì)胞學(xué)方法中的熒光原位雜交及染色體計數(shù)具有較高的鑒定效率，但操作繁雜、費(fèi)時費(fèi)力。分子標(biāo)記鑒定不僅具有鑒定效率高、操作簡便、不受栽培環(huán)境和生長發(fā)育條件的影響等優(yōu)點(diǎn)，還可明確子代和親本的基因型，從基因組的水平上揭示子代與雙親間的遺傳差異（Yang et al.，2010；Khajudparn et al.，2012；Khan et al.，2013）。分子標(biāo)記中的簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記，由于具有共顯性、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，因此也已被廣泛應(yīng)用于茶樹（雷雨等，2021）、沙田柚（韓國輝等，2010）、菊花（劉穎鑫等，2019）等物種的雜種鑒定。然而，由于油茶雜交群體不易獲得，有關(guān)雜種后代鑒定的研究鮮有報道，只是在同屬的物種中有利用SSR標(biāo)記鑒定雜交子代的研究報道，徐晶等（2009）利用分別來自葉綠體DNA、rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和核基因組共5個SSR標(biāo)記，對金花茶（C. nitidissima） × 七星白（C. japonica）以及金花茶 × 茶梅（C. sasanqua）的6個雜交子代進(jìn)行雜種鑒定，鑒定效率為83.33%。

本研究以油茶雜交育種及品種分子鑒定為研究區(qū)域，以浙江紅花油茶為母本，廣寧紅花油茶為父本，采用人工雜交獲得45株F1子代，通過對雜交子代進(jìn)行表型測定，同時篩選SSR標(biāo)記并利用該標(biāo)記開展雜交子代的鑒定，擬探討：（1）浙江紅花油茶 × 廣寧紅花油茶的雜交子代表型偏向父本或母本，還是介于父母本之間；（2）能否獲得適于油茶種間雜種鑒定的特異SSR標(biāo)記；（3）SSR標(biāo)記能否對浙江紅花油茶 × 廣寧紅花油茶雜交子代進(jìn)行真?zhèn)舞b定及其鑒定效率。以期為油茶物種間的雜交育種提供參考，同時也為后續(xù)油茶物種間的雜交子代SSR標(biāo)記鑒定提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料和DNA提取

以廣寧紅花油茶為父本，浙江紅花油茶為母本經(jīng)常規(guī)雜交后獲得45株F1子代。雜交子代為5年生實(shí)生苗，栽植于江西省林業(yè)科學(xué)院試驗基地。每份樣本采集3～5片嫩葉，并保存于-80 ℃超低溫冰箱待用。利用改良CTAB法（溫強(qiáng)等，2006）提取DNA后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，Nanodrop 2000 （Thermo Scientific， USA）檢測DNA的濃度和純度，將DNA濃度稀釋至100 ng ·μL-1，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 SSR引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增

基于浙江紅花油茶全長轉(zhuǎn)錄組序列，利用Primer 3.0軟件進(jìn)行SSR引物設(shè)計。引物PCR 擴(kuò)增體系為10 μL：10 × Buffer 1.0 μL，Mg2 +（25 mmol·L-1） 1.0 μL，dNTPs （10 mmol·L-1） 1.0 μL，10 μmol·L-1的 Primer-F、Primer-R 各0.4 μL，Taq酶 （5 U·μL-1） 0.1 μL，DNA模板（100 ng·μL-1） 0.5 μL，加滅菌ddH2O補(bǔ)齊到10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57～60 ℃（因不同引物而異）退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，150 V電壓電泳90 min后進(jìn)行銀染顯色，并拍照記錄。

1.3 引物的篩選和可靠性驗證

經(jīng)過初步PCR擴(kuò)增篩選出32個條帶清晰、多態(tài)性好的標(biāo)記。經(jīng)2個親本以及6個雜交子代樣本篩選出可區(qū)分雙親和子代并能明確子代位點(diǎn)來源的SSR標(biāo)記，用于后續(xù)的45個F1子代樣本的擴(kuò)增。為確保雜交子代鑒定試驗結(jié)果的可靠性，選取3個廣寧紅花油茶樣本 （非父本）和3個浙江紅花油茶樣本（非母本）對雜交子代鑒定效率低的SSR標(biāo)記進(jìn)行可靠性驗證。雙親和雜交子代的等位基因用A、B、C、D 英文字母表示。

2結(jié)果與分析

2.1 雜交子代表型性狀

浙江紅花油茶 × 廣寧紅花油茶的F1子代在表型上表現(xiàn)為親本性狀中間型，從整體看樹形高大、生長迅速更傾向于父本廣寧紅花油茶的性狀（表1，圖1）。F1子代的枝、葉及葉柄光滑無毛，老枝灰白色，新梢紅色；葉片綠色略偏黃，薄革質(zhì)，橢圓或長橢圓形，側(cè)脈約8對，葉脈明顯，邊緣3/4有鋸齒；子代播種種植后第4年開花，花頂生單花，紅色， 花冠直徑7～8 cm，花瓣7～8片， 柱頭5裂、中裂；苞片及萼片早期黃綠色被毛，后期淡褐色被毛，9～10片，宿存。

2.2 雜交子代鑒定的引物篩選

初步篩選出的32對SSR引物在雙親和6個雜交子代（10號、12號、13號、28號、33號和40號）中均可擴(kuò)增，其中親本間表現(xiàn)為多態(tài)性的引物有20對，多態(tài)性比例為62.5%。從中選擇8對擴(kuò)增條帶清晰并呈現(xiàn)共顯性的SSR引物，用于45株雜交子代鑒定，詳細(xì)引物信息見表2。

2.3 雜交子代的SSR分子鑒定

通過8對SSR引物對45個 F1子代進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明所有子代均為真子代，單對引物的雜種鑒定效率為55.56% ～100% （表3）。引物CC_eSSR152、CC_eSSR174和CC_eSSR296在親本擴(kuò)增出2個等位基因，基因型為純合互補(bǔ)型 （AA × BB），擴(kuò)增出的F1子代的基因型均為AB型，鑒定出45個真雜種，鑒定效率為100%，對真假子代的鑒定最為直觀有效。引物CC_eSSR162、CC_eSSR165、CC_eSSR171、CC_eSSR270和CC_eSSR292在親本中的基因型表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)型，其中引物CC_eSSR165 （AB × CC）、CC_eSSR171 （AA × BC）、CC_eSSR270 （CC × AB） 和CC_eSSR292 （AA × BC） 擴(kuò)增出3個等位基因，引物CC_eSSR162 （AB × CD） 擴(kuò)增出4個等位基因。引物CC_eSSR162、CC_eSSR165、CC_eSSR171和CC_eSSR270在45個F1子代中擴(kuò)增出的帶型均具雙親特征帶，真雜種的鑒定效率均為100%。引物CC_eSSR292在F1子代中有25個子代擴(kuò)增出基因型為AB或AC，即繼承了分別來自雙親（父本AA、母本BC）各1個等位基因，鑒定為真雜種，其余20個樣本的基因型（BB、CC）僅繼承了母本的等位基因而未出現(xiàn)父本等位基因，鑒定為假子代，因此其鑒定效率為55.56% （表3，圖2）。

2.4 雜交子代鑒定結(jié)果驗證

另外，選取3個非父本的廣寧紅花油茶個體（G1、G2、G3）和3個非母本的浙江紅花油茶個體（Z1、Z2、Z3）檢測引物CC_eSSR292對真假子代的鑒定結(jié)果。由圖3：A可知，引物CC_eSSR292擴(kuò)增的真子代的基因型為雜合型，能夠完美地繼承父母本各1個等位基因；由圖3：B可知，引物CC_eSSR292擴(kuò)增的非雜交子代的6個個體并未繼承雙親的等位基因，而是擴(kuò)增出新的等位基因，為假雜種，表明引物CC_eSSR292對雜交子代的鑒定結(jié)果可靠。3討論與結(jié)論

3.1 雜交子代表型分析

雜交育種的目的是通過雜交獲得綜合雙親優(yōu)良性狀的雜交子代，是當(dāng)前培育油茶新品種的重要途徑。本研究中，我們選擇浙江紅花油茶 × 廣寧紅花油茶的雜交組合進(jìn)行人工雜交，其中作為母本的浙江紅花油茶（GHY26） 材料是我們團(tuán)隊篩選出具有亞油酸含量高 （7.31%）、果實(shí)產(chǎn)量高 （平均冠幅產(chǎn)量達(dá)2.12 kg·m-2）等優(yōu)良性狀的植株（董樂等，2021），我們期望選育出具有雙親優(yōu)良性狀的高產(chǎn)油茶新品種。

前人以浙江紅花油茶作母本獲得的雜交子代在表型性狀上更偏向于母本特征，如王湘南等（2020）對浙江紅花油茶和滇山茶雜交得到的子代進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)在開花、枝葉及樹體生長等表型性狀較大程度地遺傳到母本的特征。在花瓣數(shù)量及花型上，高繼銀等（2016）培育的浙江紅花油茶與杜鵑紅山茶雜交子代同樣偏向于母本。本研究中，我們得到的F1雜交子代在花和葉片形態(tài)等表型性狀上與母本浙江紅花油茶接近，葉片顏色、大小等特征處于雙親特征之間，葉脈、萼片、柱頭、生長勢更接近父本廣寧紅花油茶，與前人的研究結(jié)果有所不同。本研究中F1雜交子代較好地結(jié)合了雙親的優(yōu)點(diǎn)，并且父本廣寧紅花油茶對子代的表型有較大影響，為今后利用父本廣寧紅花油茶的優(yōu)點(diǎn)開展浙江紅花油茶雜交品種選育提供了依據(jù)。至于子代的果實(shí)產(chǎn)量和亞油酸含量等特征的傾向性還有待于后續(xù)進(jìn)一步試驗驗證。

3.2 雜交子代鑒定的SSR引物篩選

浙江紅花油茶在表型上與同組內(nèi)的廣寧紅花油茶、閃光紅山茶（C. lucidissima）相近且在種內(nèi)存在豐富的表型變異，尤其是葉片形態(tài)差異顯著，僅僅依據(jù)形態(tài)特征很難鑒定雜種的真實(shí)性（溫強(qiáng)等，2015）。另外，由于浙江紅花油茶自交不親和，長期異交，遺傳背景高度雜合，因此對其進(jìn)行雜種鑒定時，宜選擇合適且有效的共顯性標(biāo)記才能避免誤判。韓國輝等（2010）認(rèn)為，不同SSR標(biāo)記對雜交子代的鑒定能力不盡相同，相較于雜合型的SSR標(biāo)記，純合型標(biāo)記的鑒定效率更高，僅用一個標(biāo)記就可以鑒定出所有的雜交后代。周寧寧等（2017）根據(jù)SSR標(biāo)記在月季雜交子代中的鑒定能力劃分為三種類型：第一種是純合顯性標(biāo)記AA × BB型，雜種鑒定效率能夠達(dá)到100%；第二種是AB × CC、AA × BC和AB × CD基因型標(biāo)記，鑒定能力次之；第三種是鑒定能力最差的AA × AB、AB × BB、AB × AC等類型標(biāo)記。尹寶穎等（2019）對蘋果雜交子代進(jìn)行鑒定，將9個SSR標(biāo)記分為了完全互補(bǔ)型（AA × BB、AB × CD和AB × CC型）和不完全互補(bǔ)型（AA × AB和AB × BC型）兩大類，前者標(biāo)記的鑒定效率較高，后者標(biāo)記的鑒定效率較低，需要進(jìn)一步驗證。以上報道均認(rèn)為AA × BB、AB × CC、AA × BC和AB × CD類型的SSR標(biāo)記的鑒定效率較高，理論上僅需要1個標(biāo)記就可以鑒定出所有雜交子代，其中AA × BB和AB × CD型標(biāo)記的雜種鑒定效果最好，可以大大提高鑒定效率。本研究中用于油茶雜交子代鑒定的8個SSR標(biāo)記均為完全互補(bǔ)型，其中CC_eSSR152、CC_eSSR174和CC_eSSR296的基因型為AA × BB類型，CC_eSSR162的基因型為AB × CD，這4個標(biāo)記的雜種鑒定效率同前人的研究結(jié)果一致，都達(dá)到了100%。不同的是，CC_eSSR165 （AB × CC）、CC_eSSR171 （AA × BC）和CC_eSSR270 （CC × AB） 標(biāo)記的鑒定效率也高達(dá)100%，表明油茶雜交子代鑒定的SSR引物篩選范圍較大，這為今后開展油茶其他物種雜交子代鑒定等相關(guān)研究提供參考。

3.3 SSR標(biāo)記鑒定雜交子代能力分析

韓國輝等（2010）認(rèn)為對于雜合的顯性標(biāo)記至少要5個父本特異標(biāo)記才能鑒定出97%的真雜種，我們從32個SSR標(biāo)記中篩選出8個具有較高雜種鑒定效率的標(biāo)記，經(jīng)F1子代群體驗證，有7個均能一次性單獨(dú)鑒定所有雜交子代，無論是篩選效率還是鑒定效率都比較高。雜交子代真假性的鑒定過程中除了考慮最大程度確保鑒定的準(zhǔn)確性外，還要考慮試驗工作量的問題。雷雨等（2021）從32個SSR標(biāo)記中各篩選出3個標(biāo)記對福鼎大白茶 × 保靖黃金茶1號以及安徽1號 × 保靖黃金茶1號茶樹的2個雜交子代群體進(jìn)行子代鑒定，雜種鑒定效率分別為85.42%和79.55%。尹寶穎等（2019）從35個SSR標(biāo)記中篩選出了9個標(biāo)記用于鑒定雞冠和富士蘋果F1代，有225株為真雜種，鑒定效率為93%。李文秀等（2021）僅選用3個多態(tài)性SSR標(biāo)記就可以完成35株橡膠樹雜交子代的真實(shí)性鑒定且這3個標(biāo)記都具有較高的雜種鑒定效率。本研究中，我們利用8個共顯性標(biāo)記對浙江紅花油茶和廣寧紅花油茶的45株F1子代進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定，其中CC_eSSR152、CC_eSSR162、CC_eSSR165、CC_eSSR171、CC_eSSR174、CC_eSSR270和CC_eSSR296這7個標(biāo)記的雜交子代鑒定效率高達(dá)100%，CC_eSSR292標(biāo)記的鑒定效率為55.56%。綜合SSR標(biāo)記的鑒定結(jié)果，判定45個F1子代都是真雜種。因此，我們選用的8個SSR標(biāo)記鑒定油茶雜交子代完全可行。同時，針對SSR引物鑒定雜交子代結(jié)果的可靠性驗證也表明SSR標(biāo)記適用于油茶雜交子代的鑒定。

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（責(zé)任編輯李莉王登惠）