基于SCoT標記的油菜高油自交系材料遺傳多樣性分析

摘要：為了明確陜南地區(qū)自交系油菜材料間的親緣關系，為油菜自交系材料的合理利用、優(yōu)良雜交親本選配、提高油菜育種效率提供理論依據(jù)，以72份高油油菜自交系材料為試驗材料，運用筆者所在實驗室篩選的28條多態(tài)性高、條帶清晰的SCoT引物，進行遺傳多樣性分析。采用NTSYS-pc2.10e軟件中的UPGMA法構建聚類圖，用Structure軟件進行群體結(jié)構分析。結(jié)果顯示，28條SCoT引物共擴增出327條條帶，其中多態(tài)性條帶為289條，多態(tài)性條帶占比為88.38%，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.70～0.94，平均為0.85。Structure群體結(jié)構分析與UPGMA聚類結(jié)果的一致性較高，說明SCoT標記能有效揭示油菜材料間的親緣關系。72份油菜自交系材料在遺傳相似系數(shù)0.64處被分為3類，遺傳相似系數(shù)主要分布在0.62～0.78之間，占86.85%。表明供試油菜材料間親緣關系較近，應進一步發(fā)掘新的自交系材料，豐富現(xiàn)有油菜材料的遺傳多樣性，為油菜雜交育種提供優(yōu)良的遺傳資源。

關鍵詞：油菜；SCoT標記；遺傳多樣性；自交系；高油油菜

中圖分類號：S634.303.2 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0109-07

收稿日期：2024-09-24

基金項目：陜西省科技廳項目（編號：2023-YBNY-070）；陜西理工大學人才啟動項目（編號：SLGRCQD2115）。

作者簡介：張曉娟（1982—），女，陜西咸陽人，博士，副教授，碩士生導師，主要從事油菜分子遺傳研究。E-mail：zxj12162001@163.com。

油菜是我國第一大油料作物，也是國產(chǎn)植物油的最大油源。提升油菜產(chǎn)量對我國食用油供給、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及國民經(jīng)濟具有重要意義。利用雜種優(yōu)勢可以有效提升油菜產(chǎn)量。油菜雜交育種實踐表明，雙親間適宜的遺傳差異有助于提高雜交后代的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性。因此，明確油菜自交系材料的遺傳背景，分析材料間的遺傳差異及親緣關系，科學地進行油菜雜交親本的選配，有助于優(yōu)異油菜自交系材料的挖掘及合理利用^［1］，對于油菜雜交育種具有重要意義。由于國內(nèi)各育種單位間材料的頻繁交流，導致油菜材料的系譜關系錯綜復雜，傳統(tǒng)分類方式難以準確區(qū)分育種材料。DNA分子標記為油菜種質(zhì)資源的遺傳背景和多樣性分析提供了有利工具。DNA分子標記是根據(jù)不同個體遺傳物質(zhì)DNA序列多態(tài)性開發(fā)的遺傳標記，能準確反映不同個體的遺傳差異，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定、快速等優(yōu)點，已被廣泛用于遺傳基礎分析、基因定位與克隆、指紋圖譜構建、種質(zhì)資源鑒定及遺傳育種等研究^［2］。

目標起始密碼子多態(tài)性標記，即SCoT（start codon targeted polymorphism）標記是由Collard等開發(fā)的一種新型分子標記技術^［3］。該標記屬于目的基因分子標記，根據(jù)基因起始序列的保守性設計引物對2個基因間的區(qū)域進行PCR擴增，其原理是基因翻譯的起始區(qū)都有7個固定不變的核苷酸，即起始密碼子ATG（+1、+2、+3）以及接下來+4位的G，+7位的A，+8、+9位的2個C；其余位置為填充序列，體現(xiàn)了不同個體的多態(tài)性。與SSR等二代DNA分子標記相比^［4］，該標記的多態(tài)性更高。此外，SCoT標記還具有穩(wěn)定性好、引物通用性高等優(yōu)點。

目前，SCoT分子標記已成功應用于多種植物，如茶樹^［5］、獼猴桃^［6］、梔子^［7］、龍眼^［8］、枸杞^［9］、月季^［10］等的種質(zhì)鑒定、親緣關系、基因作圖及遺傳多樣性研究^［11］。張羽等對油菜資源遺傳分析的結(jié)果表明，SCoT標記檢測的多態(tài)性條帶數(shù)量高于SRAP標記和SSR標記^［12］；SCoT標記的聚類結(jié)果和SRAP標記近似，SCoT標記的多態(tài)性高于SRAP標記，且SCoT標記比SRAP標記更能準確反映材料的親緣關系^［13］。

陜南地區(qū)是陜西省油菜高產(chǎn)及優(yōu)生區(qū)，其油菜種植面積約占陜西省油菜種植總面積的一半。該地區(qū)油菜種質(zhì)資源的鑒定分析以及油菜新品種的選育對于陜西省油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分重要。本研究以漢中市農(nóng)業(yè)科學研究所（即漢中市農(nóng)業(yè)技術推廣與培訓中心）選育的72份油菜高油自交系材料為研究對象，利用28條多態(tài)性良好的SCoT引物，進行遺傳多樣性分析，旨在為油菜雜交育種、自交系材料的利用及優(yōu)異種質(zhì)資源的挖掘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

72份油菜高油自交系材料由漢中市農(nóng)業(yè)科學研究所提供，材料于2022年9月種植于漢中市農(nóng)業(yè)科學研究所試驗田（33°09′30.38″N，106°58′53.95″E），分小區(qū)種植，行長為2 m，行寬為40 cm，株距為15 cm。供試材料基本信息見表1。

主要試劑：2×Taq Master Mix（Dye）（康為世紀生物科技有限公司）、40% Arc-Bis、AgNO₃、過硫酸銨、TEMED、NaOH、甲醛、CTAB、Tris、硼酸、EDTA、瓊脂糖等。

1.2 試驗方法

1.2.1 改良的CTAB法提取油菜基因組DNA

2023年3月30日采集供試油菜材料幼嫩葉片，-80 ℃ 保存。通過改良CTAB法提取油菜基因組DNA^［14］，分別使用0.8%的瓊脂糖凝膠和NanoDrop超微量分光光度計檢測基因組DNA的完整性和濃度。

1.2.2 SCoT引物擴增

利用28條SCoT引物對供試72份油菜自交系材料進行PCR擴增。SCoT引物序列見表2。

PCR反應總體系10 μL：2×Taq Master Mix 5 μL，10 μmol/L的引物1 μL，100 ng/μL DNA模板1 μL，ddH₂O補足體系。PCR擴增采用復性變溫法，程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，10個循環(huán)；94 ℃變性30 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 電泳及染色

SCoT引物擴增產(chǎn)物分離采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后將凝膠下角切去少許以標記方向，置于硝酸銀染色液中搖床染色8 min，蒸餾水漂洗3次，加入顯色液搖床顯色至有清晰條帶，倒去顯色液后拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計SCoT標記電泳圖譜中的清晰、可重復條帶。圖譜中每條引物擴增的每個位點，有帶標記為“1”，無帶標記為“0”，建立數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)矩陣計算簡單匹配系數(shù)（SMC），SMC=a/（n-d），其中a是2個種質(zhì)之間共有的條帶數(shù)，n是矩陣中的條帶數(shù)，d是2個種質(zhì)中不存在的條帶數(shù)^［15］。根據(jù)Smith等報道的方法^［16］計算多態(tài)性信息含量（PIC）值。利用NTSYS-pc2.10e軟件中的UPGMA算法^［17］繪制樹狀聚類圖，使用Dcenter、Eigen程序進行主成分分析（PCA）。運用軟件Structure 2.3.4對72份油菜自交系材料進行群體結(jié)構分析^［18］，將MCMC（markov chain monte carlo）、Burn-in均設為10 000次，K=1～10，每個K值重復5次，運行結(jié)果上傳至Structure Harvester在線網(wǎng)站得到最佳K值。采用Popgene 1.32軟件^［19］對數(shù)據(jù)矩陣進行分析，計算等位基因數(shù)（N_a）、有效等位基因數(shù)（N_e）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon’s信息指數(shù)（I）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT引物擴增結(jié)果

SCoT引物對供試油菜自交系材料擴增的電泳圖譜清晰、結(jié)果穩(wěn)定（圖1）。28條SCoT引物在72份供試油菜自交系材料中共檢測出327個條帶，其中多態(tài)性條帶為289條，多態(tài)性條帶占比為88.38%。SCoT引物的PIC值范圍為0.70～0.94，平均為0.85。根據(jù)Botstein等^［20］提出的觀點，當PICgt;0.5時，該基因座為高度多態(tài)基因座，表明本試驗的SCoT引物多態(tài)性豐富。引物的N_a值在1.33～2.00之間，平均為1.86；N_e值在1.09～1.73之間，平均為1.35；H值在0.13～0.56之間，平均為0.34；I值在0.07～0.40之間，平均為0.22（表3）。遺傳多樣性的相關指數(shù)可反映基因的多樣性及分化程度^［21］，其中，I值主要反映物種的居群遺傳多樣性的高低，該值越大，則居群遺傳多樣性越高。由此得出，供試油菜自交系材料的遺傳多樣性水平不高。

2.2 材料間遺傳相似系數(shù)分析

SCoT標記分析得出，供試的72份油菜自交系材料間遺傳相似系數(shù)介于0.31～0.95之間，平均值為0.68。其中，材料14號與72號的遺傳相似系數(shù)最?。?.310），材料25號與26號的遺傳相似系數(shù)最大（0.946）。

對供試材料的兩兩遺傳相似系數(shù)共計 2 556 個數(shù)值進行次數(shù)分布分析，得出遺傳相似系數(shù)在0.69處分布密度最大（圖2）。遺傳相似系數(shù)≥0.69的有1 436個（占56.18%），＜0.69的有1 120個（占43.82%）。遺傳相似系數(shù)主要集中在0.62～0.78之間，占86.85%。

2.3 SCoT標記的聚類分析

SCoT標記構建的聚類圖如圖3所示，在相似系數(shù)為0.64處分為3類。第Ⅰ類為最大的一類，包含69個材料。第Ⅱ類只含72號這1個材料。第Ⅲ類包含2個材料（13、14）。第Ⅰ類中，具有中雙11背景的材料優(yōu)先聚在一起，如材料51號與58號、2號與3號、35號與54號、44號與63號；有共同親本來源的4、20號材料聚在一起，這2個材料都來源于浙72、滬16。親緣關系近的材料在聚類圖中相距較近，說明SCoT標記準確揭示了油菜自交系材料之間的親緣關系。第Ⅱ類只有72號材料，該材料為引進的抗根腫病材料，在聚類圖中與其他自交系材料得以區(qū)分。聚類結(jié)果顯示，72號材料與第Ⅰ類材料的親緣關系較第Ⅲ類材料近。第Ⅲ類中的13、14號材料，分別為漢中小青菜、白菜型油菜，因與其他自交系油菜遺傳背景較遠，在聚類圖中單獨聚為一類。這2個材料可用于新自交系材料的創(chuàng)制，以提高油菜自交系材料的遺傳差異。

2.4 SCoT標記的主成分分析

主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，第1主成分占總變異的9.17%，第2主成分占總變異的6.31%（圖4）。PCA圖中13、14號材料聚為一類，與其他材料明顯區(qū)分開來，對應于聚類分析中第Ⅲ類。聚類圖第Ⅰ類中的材料在PCA圖中也聚在一起。主成分分析中，聚類圖第Ⅱ類中唯一的72號材料與聚類圖中第Ⅲ類材料（13、14號）區(qū)分， 但未能與第Ⅰ類材料區(qū)分，這是由于72號材料與聚類圖中的第Ⅰ類材料親緣關系較近導致。主成分分析結(jié)果與NTSYS-pc2.10e軟件構建的聚類結(jié)果基本一致。

2.5 群體結(jié)構分析

當K=4時，ΔK值最大，表明72份油菜材料聚為4類合適（圖5）。 第Ⅰ類包括7份材料， 第Ⅱ類包含20份材料，第Ⅲ類包含43份材料。第Ⅳ類包含2個材料（13、14號），這2個材料在聚類分析中也歸為一類。Structrue分析中，第Ⅰ類（7號材料除外）對應于聚類分析圖中第Ⅰ類中紅色線條標記部分，第Ⅲ類主要對應于聚類圖第Ⅰ類中藍色線條標記部分。綜上所述，Structure群體結(jié)構分析結(jié)果與UPGMA聚類結(jié)果一致性較高。

3 討論與結(jié)論

油菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，有助于挖掘優(yōu)異的油菜育種材料，擴充現(xiàn)有油菜遺傳背景。分析油菜自交系材料的親緣關系及遺傳差異，有效利用油菜雜種優(yōu)勢，具有重要的理論指導價值。目前，油菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析主要采用SSR、SRAP、RAPD等分子標記^［22］。新型分子標記——SCoT標記是針對基因的開放閱讀框設計的，相對于主要分布于非編碼區(qū)（包括著絲粒、端粒以及內(nèi)含子、3′UTR等）的SSR標記，與表型更為相關，更容易成為功能標記。SCoT分子標記為單引物，成本低廉、操作簡便，非常適合種質(zhì)資源的篩選、鑒定和遺傳背景分析等。研究表明，SCoT標記在多態(tài)性條帶數(shù)量（NPB）、多態(tài)條帶百分比（PPB）、分辨能力（Rp）、有效多重比率（EMR）、標記指數(shù)（MI）方面，較EST-SSR標記、SRAP標記更具優(yōu)勢^［23］。

本研究所用28條SCoT引物的平均PIC值為0.85，多態(tài)性信息含量均＞0.5，說明本研究選用的SCoT引物多態(tài)性豐富，可用于油菜遺傳多樣性分析?；谶z傳距離的聚類分析將供試油菜材料分為3類。第Ⅰ類包含材料最多，分析這些材料來源發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ類中很多材料具有中雙11或者其衍生系背景，材料間遺傳基礎較為接近。第Ⅲ類的13、14號材料分別為漢中小青菜、白菜型油菜，與其他自交系油菜遺傳背景差異較大，因此單獨聚為一類。在油菜雜交育種中，應避免在同一類親緣關系較近的材料中挑選父母本。雜交親本應選擇親緣關系較遠的2個材料。例如，可選擇第Ⅲ類中的材料與第Ⅰ類中的材料進行雜交。此外，為避免油菜骨干親本反復多次利用而導致的油菜育種資源遺傳背景變窄，可適當引入與現(xiàn)有育種材料遺傳背景差異大的油菜材料，將其作為親本，通過雜交，豐富后代的遺傳背景。本研究中，主成分分析及群體結(jié)構分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果符合度較好，說明NTSYS-pc2.10e軟件構建的聚類結(jié)果能有效反映材料間的親緣關系，可為油菜育種實踐提供理論參考。

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