蒙藥當瑪-5片劑對功能性消化不良模型小鼠腸道菌群的調節(jié)作用研究

【摘 要】 目的：探討蒙藥當瑪-5片劑干預后功能性消化不良模型小鼠腸道菌群的結構及功能變化。方法：將小鼠隨機分為正常組、模型組、蒙藥當瑪-5片劑組，采用隔日飲食加稀鹽酸喂養(yǎng)的方法連續(xù)造模10d，第11天開始連續(xù)灌胃給藥7d。第17天麻醉，收集糞便樣本。擴增腸道菌群16S rRNA基因的V3+V4區(qū)，采用高通量測序分析門水平和屬水平的物種組成和組間差異，進行功能基因預測分析。結果：給予蒙藥當瑪-5片劑可以增加功能性消化不良小鼠腸道菌群物種多樣性及豐度。在門水平上，蒙藥當瑪-5片劑干預后厚壁菌門、放線菌門相對豐度減少，擬桿菌門、變形菌門相對豐度增加；在屬水平上，蒙藥當瑪-5片劑干預后Veillonellaceae、Bacteroidaceae和Ruminococcaceae的豐度比模型組低1.47%、14.19%、1.61%，Lachnospiraceae的豐度比模型組高17.51%。COG分析示蒙藥當瑪-5片劑組差異較明顯的信號通路有信號轉導機制（signal transduction mechanisms）、細胞周期控制（cell cycle control）、未知功能（function unknown）、轉錄（transeription）、防御機制 （defense mechanisms）。KEGG分析：蒙藥當瑪-5片劑組差異較明顯的途徑有氨基酸代謝（amino acid metabolism）、global and verview maps、轉錄（translation）、膜轉運（membrane transport）。結論：本研究結果表明，蒙藥當瑪-5片劑能調節(jié)失衡的菌群，并使之相對豐度恢復正常水平。

【關鍵詞】 蒙藥當瑪-5片劑，功能性消化不良，腸道菌群

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2024）20-0026-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.20.zgmzmjyyzz202420007

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是指具有餐后飽脹不適、早飽感、上腹痛、上腹燒灼感中的一項或多項的癥狀［1］。FD為臨床常見病、多發(fā)病，病程長、易反復發(fā)作，不同程度地影響著患者的生活質量。FD的發(fā)病機制尚不明確，目前認為FD與胃腸動力障礙、內臟高敏感性、腦腸軸、遺傳免疫等有關。腸道菌群作為“新起之秀”，被認為可以影響胃腸的感覺、動力及免疫功能［2］，有改變內臟敏感度、胃腸動力、影響消化吸收等作用，因此FD發(fā)生與腸道微生態(tài)有密切關系［3］。腸道菌群通過與宿主共代謝，調控腸道微生態(tài)的動態(tài)平衡，在維持人類健康中發(fā)揮重要的作用。一旦腸道內環(huán)境發(fā)生改變，腸道菌群出現失調，則會引發(fā)消化系統(tǒng)疾病、內分泌系統(tǒng)疾病、中樞神經系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等［4］。蒙藥當瑪-5片劑是由石榴、紅花、豆蔻、肉桂和蓽茇等5味藥組成，具有開欲消食、暖胃的功能，用于食欲不振、消化不良、胃脘冷痛、滿悶噯氣、腹脹泄瀉等病癥。石榴可緩解炎癥性腸?。?］；紅花多糖對小鼠的腸道菌群失調具有調節(jié)作用［6］；豆蔻可促進胃腸蠕動，防止腸粘連［7］；肉桂改善小腸通透性，提高小腸屏蔽功能［8］；適當劑量的蓽茇提取物通過促進大鼠腸道內有益菌屬的增長、防止腸道粘膜屏障的破壞［9］。其單味藥對胃腸功能、腸道菌群有一定的調節(jié)作用，所以本研究將蒙藥當瑪-5片劑給予FD模型小鼠后觀察腸道菌群的變化，為進一步深入研究提供實驗依據。

1 實驗材料

SPF級KM小鼠（雄性）45只，購于北京國家動物中心；蒙藥當瑪-5片劑由奧特奇蒙藥股份有限公司提供的中式成品。

2 實驗方法

2.1 建立模型和藥物干預 將小鼠隨機分為3組，即正常組、模型組、蒙藥當瑪-5片劑組，每組15只。除正常組外，其余組均采用隔日飲食加稀鹽酸喂養(yǎng)的方法造模。逢單日正常進食，逢雙日禁食，自由飲水，水中加入鹽酸（每升飲用水中加入10 mol/L 鹽酸 10 mL）以破壞胃內酸堿平衡，連續(xù)10 d；正常組常規(guī)喂養(yǎng)。造模第11天開始蒙藥當瑪-5片劑組小鼠灌胃溶于蒸餾水的蒙藥當瑪-5片劑溶液，給藥劑量為2.0 g/kg（濃度為0.2 g/mL），正常組和模型組給予蒸餾水，1次/日，連續(xù)給藥7 d。第16天灌胃給藥后，各組小鼠禁食不禁水24 h，之后乙醚麻醉動物，劍突下切口約2 cm打開腹腔，取結腸糞便，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 16S rDNA 擴增子測序（16S rDNA Amplicon Sequencing） 采用QIAamp快速DNA糞便迷你試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany），按說明書從解凍糞便樣品中提取總DNA。然后進行16S rDNA 擴增子測序。測序得到原始數據（Raw Data），首先對原始數據進行拼接和過濾，排除實驗及測序過程中帶來的干擾和誤差，使信息分析結果更加準確、可靠。之后對有效數據進行 OTUs（operational taxonomic units）聚類和物種注釋分析。高變區(qū)及常用擴增引物信息如下：①338F-806R（V3-V4區(qū)）或515F-907R（V4-V5區(qū)）。②PCR 引物：515F∶[KG-*3/5]（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）and 806R∶[KG-*3/5]（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），使用具有 12 nt獨特條形碼的特異性引物擴增16S rRNA基因。

2.3 物種多樣性和差異分析 在物種注釋的基礎上，通過稀疏曲線計算每組樣本在門和屬水平上的豐度柱形累加圖；根據結果，選取每個樣品在各分類水平上豐度排名前10的OTU，生成相對豐度柱形累加圖，以觀察各樣品在不同分類水平上的豐度，比較三組的OTUs、微生物多樣性和豐富度。在97%相似性的水平上對序列進行聚類（USEARCH，version 10.0），測序所有序列數時以0.005%作為閾值過濾 OUT［10］。

2.4 腸道菌群物種注釋及功能預測 采用PICRUSt （phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states） 工具通過KEGG （kyoto encyclopedia of genes and genomes）代謝途徑分析差異途徑，通過COG（clusters of orthologous groups of proteins）分析蛋白功能分類。

2.5 統(tǒng)計分析 所有統(tǒng)計分析均采用SPSS17.0版本。使用Welch T檢驗比較組間的微生物門和屬濃度。

3 結果

3.1 腸道菌群的結構與組成 應用PacBio SMRT測序技術對糞便樣本中微生物進行了分析。40份糞便樣本共獲得3006612條高質量完整的16S rRNA基因序列，每個樣品平均序列為75165條。根據序列的97％相似度水平劃分操作分類單元后，共得到8178個具有代表性的OTUs。稀釋曲線和香農指數曲線（如圖1）結果顯示，曲線隨測序量增加而逐漸趨向平坦，各樣本物種數量（Sobs）或多樣性指數（Shannon）并不會隨測序數量的增加而顯著增多，說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中的所有物種，獲得數據可用于分析。正常組、模型組和蒙藥當瑪-5片劑組之間共同變化的益生菌有266個，其中上調189個，下調77個。

A.正常組；B.模型組；C.蒙藥當瑪-5片劑組

3.2 腸道菌群結構變化 所有樣本共檢測到11個細菌菌門，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（proteobacteria）為主要成分，與正常組相比模型組的厚壁菌門/擬桿菌門比例升高，同時放線菌門（Actinobacteria）相對豐度增加。與模型組相比，蒙藥當瑪-5片劑組厚壁菌門、放線菌門相對豐度減少，擬桿菌門、變形菌門相對豐度增加。

氏球菌科（Veillonellaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）等4個菌屬的豐度占比達82.0%。模型組腸道中Veillonellaceae、Bacteroidaceae和Ruminococcaceae的豐度比蒙藥當瑪-5片劑組高1.47%、14.19%、1.61%，模型組腸道中Lachnospiraceae的豐度比蒙藥當瑪-5片劑組低17.51%。如圖2所示。

3.3 腸道菌群的功能化分析 COG分析數據顯示，與正常組相比，模型組的COG樣本豐度顯著增加，增加的細胞通路有輔酶轉運和代謝（coenzyme transport and metabolism）、細胞壁（cell wall）、無機物的運輸和代謝（inorganic in transport and metabolism）、信號轉導（signal transduction）、細胞運動 （ cell motility）、僅通過基因功能預測（general function prediction only）。蒙藥當瑪-5片劑組差異較明顯的信號通路有信號轉導機制（signal transduction mechanisms）、細胞周期控制（cell cycle control）、未知功能（function unknown）、轉錄（transeription）、防御機制 （defense mechanisms）。

KEGG分析數據顯示，模型組與正常組相比，有顯著差異的細胞通路有氨基酸代謝（amino acid metabolism）、膜轉運（membrane transport）、信號轉導（signal traansduction）、細胞運動（cell motility）。蒙藥當瑪-5片劑組差異較明顯的途徑有氨基酸代謝（amino acid metabolism）、global and verview maps、轉錄（translation）、膜轉運（membrane transport） 。如圖3所示。

4 討論

當前FD的治療主要分為促動力和PPI抑酸，已有研究［4］發(fā)現長期使用PPI可能會導致小腸細菌過度生長，加重消化不良癥狀，而使用益生菌或不可吸收的腸道抗生素利福昔明能改善消化不良癥狀，因此若以腸道菌群作為新的研究切入點，將有助于探索FD新的防治方法。

本實驗中通過16S rDNA 高通量測序發(fā)現，給予蒙藥當瑪-5片劑可增加 FD 大鼠腸道菌群物種多樣性及豐度。厚壁菌門可以維持宿主的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)［11］。毛螺菌科將多糖轉化成乙酸，含量過高就會損害腸道內壁，引發(fā)腸炎; 普氏菌屬的含量過高易引起胃腸道疼痛反應［12-13］。胃瘤球菌可以抑制有害菌感染，能改善發(fā)育不良小鼠的生長及代謝異常［14-15］。在門水平上，FD 大鼠厚壁菌門/擬桿菌門比例升高，同時放線菌門（Actinobacteria）相對豐度增加；在屬水平上，FD 大鼠Veillonellaceae、Bacteroidaceae和Ruminococcaceae的豐度增加，Lachnospiraceae豐度降低；蒙藥當瑪-5片劑可逆轉這些菌群變化，表明蒙藥當瑪-5片劑可調節(jié)失衡的菌群并使之相對豐度恢復正常水平，從而發(fā)揮治療作用。

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（收稿日期：2024-01-29 編輯：劉 斌）

基金項目：內蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導項目（No.KCBJ2018044）。

作者簡介：好畢斯哈拉圖（1977—），男，蒙古族，碩士，主任醫(yī)師，研究方向為蒙醫(yī)藥學研究。E-mail：jnhbs@163.com