超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定涼茶中茶堿等五種化學(xué)藥物

關(guān)鍵詞：食品檢驗(yàn)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法涼茶非法添加化學(xué)藥物

0引言

涼茶以其獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值而深受大眾喜愛。一般地，涼茶被認(rèn)為是起源于嶺南地區(qū)，以天然植物（主要是草藥）為原材料制成，對(duì)人體健康具有多種益處的一類飲料的統(tǒng)稱[1]。通常人們會(huì)使用單種或多種不同的天然植物原料，熬制出不同類型的涼茶，以實(shí)現(xiàn)預(yù)防疾病和保健的目的。相關(guān)研究表明，涼茶中普遍含有多酚類、黃酮類、萜類、揮發(fā)油、生物堿、有機(jī)酸和多糖等多種有效成分[2-7]。因此，涼茶在抗氧化、消炎抑菌、抑制病毒和免疫激活等方面具有一定的效用[8-11]。經(jīng)過多年的發(fā)展和沉淀，廣東涼茶在2006年5月獲國務(wù)院批準(zhǔn)，列入第一批國家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，成為中醫(yī)保健文化的重要組成部分。

然而，一些商家受利益驅(qū)使在涼茶中違規(guī)添加多類西藥成分，如茶堿、氨溴索、甲硝唑、異丙嗪和愈創(chuàng)甘油醚等[12，13]，以此提高所售涼茶的療效，從而吸引更多消費(fèi)者，這些非法添加藥物對(duì)人體健康存在巨大的風(fēng)險(xiǎn)。

茶堿和氨溴索具有止咳、止痛和平喘等效果，常被違法添加到止咳茶、感冒茶和清熱解毒茶等涼茶中，研究表明，長期過量使用茶堿和氨溴索可能會(huì)對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致人體出現(xiàn)癲癇、心律失常和腸道功能紊亂[14-16]；甲硝唑?qū)捬跫?xì)菌有較好的抑制作用，因此常被違法添加在痤瘡茶或牙痛茶中，但使用不當(dāng)可能會(huì)引起皮膚過敏和肝臟損傷[17-19]；異丙嗪常用于緩解惡心和嘔吐癥狀、過敏性疾病、暈動(dòng)病和普通感冒，以及作為鎮(zhèn)靜劑在短期治療失眠使用，易被違法添加在感冒茶、咳喘茶和安神茶等涼茶中，長期過量服用可能對(duì)中樞神經(jīng)和肝腎功能產(chǎn)生副作用[20，21]；愈創(chuàng)甘油醚具有祛痰、肌肉松弛和安神定驚的作用，容易被不良商家違法添加到安神茶、化痰茶等涼茶中，但長期過量服用可能導(dǎo)致急性雙側(cè)輸尿管梗阻和潛在發(fā)育毒性[22，23]。一般而言，商家對(duì)涼茶的非法添加的藥物劑量沒有概念，消費(fèi)者在不知情的狀態(tài)下長期飲用此類含有非法添加化學(xué)藥物的涼茶，會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生巨大的風(fēng)險(xiǎn)。

盡管國家食品藥品監(jiān)督管理總局已于2017年發(fā)布了食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS201713《飲料、茶葉及相關(guān)制品中對(duì)乙酰氨基酚等59種化合物的測(cè)定》和BJS201714《飲料、茶葉及相關(guān)制品中二氟尼柳等18種化合物的測(cè)定》，但對(duì)于消炎、止咳類等化學(xué)藥物的監(jiān)管和限制仍存在較大的優(yōu)化空間[24]。

現(xiàn)階段，針對(duì)涼茶中西藥等化學(xué)藥物成分違法添加的檢測(cè)手段主要集中在高效液相色譜法、薄層色譜-表面拉曼光譜法、近紅外光譜法、液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫分析法等[25-30]。其中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法最為普遍，該方法靈敏度高，適用性強(qiáng)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)，適于普及和推廣。因此，本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了涼茶中非法添加茶堿、氨溴索、甲硝唑、異丙嗪和愈創(chuàng)甘油醚等5種化學(xué)藥物的快速測(cè)定方法，為涼茶的日常監(jiān)督提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

茶堿、氨溴索、甲硝唑、異丙嗪和愈創(chuàng)甘油醚標(biāo)準(zhǔn)品（濃度均為100μg/mL）。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純），所有溶液采用超純?nèi)ルx子水（電阻率＞18.2MΩ·cm）配制。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配ESI源）；色譜柱；3-18K低溫高速離心機(jī)；渦旋振蕩器；超純水系統(tǒng)；天平（感量0.01g）；

涼茶樣品為隨機(jī)購于廣東省內(nèi)零售市場(chǎng)的感冒茶、止咳茶、牙痛茶等共50份。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為100mg/L，開封后貯存于–18℃冰箱中，有效期6個(gè)月。使用時(shí)用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白樣品基質(zhì)溶液配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3樣品處理

準(zhǔn)確稱取1g試樣（精確至0.01g）置于50mL容量瓶中，用甲醇水溶液（體積比，1∶1）定容至刻度，渦旋振搖2min，9000r/min離心2min，取上清液經(jīng)微孔濾膜（0.45μm，有機(jī)相）過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.4色譜條件

分析柱：WatersAcquityUPLCBEHC181.7μm（2.1mm×100mm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液；B為乙腈；洗脫梯度見表1；流速：0.3μL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2μL。

1.5質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI源）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；掃描方式：正離子掃描；毛細(xì)管電壓：5500V；脫溶劑溫度：500℃；氣簾氣壓力：35psi1；霧化氣壓力：55psi；輔助氣壓力：55psi；參考監(jiān)測(cè)離子對(duì)和參考參數(shù)見表2。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣的方式，將5種化合物質(zhì)量濃度為100ng/mL的混合標(biāo)液注入離子源，在ESI正離子的模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到母離子和子離子。優(yōu)化其電噴霧電壓、碰撞氣、脫溶劑溫度、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、干燥氣壓力等參數(shù)。采用MRM監(jiān)測(cè)模式，對(duì)已獲得的離子對(duì)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎裂，得到最優(yōu)錐孔電壓和碰撞能量，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的組成和比例直接影響物質(zhì)的分離和靈敏度[31]。由于甲酸相對(duì)分子量小，更利于離子化和質(zhì)譜的解析。同時(shí)考慮到5種化合物均為正離子模式，流動(dòng)相中添加適量甲酸可增強(qiáng)目標(biāo)分析物離子化效率，提高靈敏度。本研究比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水3種流動(dòng)相體系。其中使用甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，均出現(xiàn)了峰型變寬和拖尾現(xiàn)象，此外，茶堿定性離子（m/z181.0/96.0）響應(yīng)較低且不穩(wěn)定，未能達(dá)到檢測(cè)要求。同時(shí)，對(duì)0.1%、0.05%、0.01%這3種不同濃度的甲酸添加量作對(duì)比，結(jié)果表明，對(duì)于正離子化合物，甲酸濃度越低，靈敏度越低，峰型越差。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，愈創(chuàng)甘油醚的響應(yīng)偏低，且受甲酸濃度影響。因此，選用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，5種化合物均能達(dá)到較優(yōu)的響應(yīng)。

2.3基質(zhì)效應(yīng)研究

在質(zhì)譜定量方法中，基質(zhì)效應(yīng)普遍存在，它由基質(zhì)中的干擾物與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電離所致[32]，選用空白基質(zhì)曲線校正法可有效提高目標(biāo)化學(xué)物的回收率。研究發(fā)現(xiàn)，在陰性涼茶中分別添加3個(gè)水平的待測(cè)物，各水平進(jìn)行6次平行測(cè)定，比較溶劑曲線校正法和基質(zhì)曲線校正法，甲硝唑的平均回收率從65.4%提高至94.7%；氨溴索的平均回收率從77.5%提高至90.6%。其余3種化合物使用基質(zhì)曲線校正法均可達(dá)到滿意的回收率。故本實(shí)驗(yàn)選用陰性涼茶樣品配制空白基質(zhì)曲線，5種化合物定量離子對(duì)質(zhì)量色譜圖見圖1～圖5。

2.4方法學(xué)驗(yàn)證

以待測(cè)化合物定量離子的色譜峰面積作為縱坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在相應(yīng)線性范圍內(nèi)，5種化合物線性關(guān)系良好，r均大于0.994。檢出限為0.5mg/kg，S/N均大于3，定量限為1mg/kg，S/N均大于10。在陰性涼茶樣品中分別添加1mg/kg、2mg/kg和10mg/kg等3個(gè)水平的待測(cè)物，各水平進(jìn)行6次平行測(cè)定，考察方法的回收率和精密度。結(jié)果顯示，本研究方法回收率為87.2%～98.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.05%～3.47%，如表3、表4所示。

2.5實(shí)際樣品檢測(cè)情況

在廣東省內(nèi)零售市場(chǎng)隨機(jī)購買，標(biāo)稱為感冒茶、止咳茶、牙痛茶等50份樣品。所有涼茶均未檢出茶堿、氨溴索、甲硝唑、異丙嗪和愈創(chuàng)甘油醚成分。

3結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定涼茶中的茶堿、氨溴索、甲硝唑、異丙嗪和愈創(chuàng)甘油醚等5種化合物。能在5min內(nèi)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行快速篩查。本方法操作簡(jiǎn)單、高效，峰型較優(yōu)，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果滿意，可以滿足日常檢測(cè)要求，能為涼茶非法添加化學(xué)藥物情況的監(jiān)管提供可靠技術(shù)支撐。