鵝不食草配方顆粒指紋圖譜及一測(cè)多評(píng)法研究

【摘要】目的：建立鵝不食草配方顆粒指紋圖譜檢測(cè)方法及一測(cè)多評(píng)含量測(cè)定。方法：采用AgilentPoroshell120SB-Aq色譜柱（2.1mm×150mm，1.9μm），乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.2mL/min；柱溫為25℃；0～60min檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，60～100min檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm。結(jié)果：指紋圖譜確定26個(gè)共有峰，多批次圖譜相似度均大于0.9。建立含量測(cè)定方法線性范圍良好（r2=0.9994～1.000），平均加樣回收率99.6%～101.1%建立相對(duì)校正因子，通過(guò)綠原酸能夠準(zhǔn)確計(jì)算含量，咖啡酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、3，4-二-O-咖啡?？鼘幩?、隱綠原酸、新綠原酸相對(duì)校正因子為1.761、1.387、1.273、0.828、1.141、1.082。結(jié)論：本研究制定的方法能作為檢測(cè)手段簡(jiǎn)便有效、重復(fù)效果好，可為鵝不食草配方顆粒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】鵝不食草配方顆粒；指紋圖譜；一測(cè)多評(píng)法；綠原酸

【中圖分類號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2024）18-0027-08

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.18.zgmzmjyyzz202418007

Abstract：ObjectiveToestablishafingerprintdetectionmethodofCentipedaMinimaDispensingGranules（CMDG）formulaparticlesandamulti-evaluationcontentdetermination.MethodsThechromatographywasperformedonAgilentPoroshell120SB-Aqcolumn（2.1mm×150mm，1.9μm）withacetonitrile-0.1%phosphoricacidasmobilephasebygradientelutionattheflowrateof0.2mL/min.Thecolumntemperaturewas25℃.Thedetectionwavelengthof0-60minutesis325nm，andthedetectionwavelengthof60-100minutesis225nm.ResultsThe26commonpeakswereidentifiedbyfingerprint，andthesimilarityofmultiplebatcheswasgreaterthan0.9.Thelinearrangeofthemethodwasgood（r2=0.9994-1.000），andtheaveragerecoveryratewas99.6%-101.1%.Therelativecorrectionfactorsofcaffeicacid，3，5-O-DicaffeoylquinicAcid，4，5-O-DicaffeoylquinicAcid，3，4-O-DicaffeoylquinicAcid，CryptochlorogenicacidandNeochlorogenicacidwere1.761，1.387，1.273，0.828，1.141，1.082.ConclusionThemethoddevelopedinthisstudycanbeusedasasimpleandeffectivedetectionmethodwithgoodrepeatability，andcanprovideabasisforthequalitycontrolandevaluationofCMDG.

Key wMGezuHhobkptLpC7UzuD46/1h2oo0ynrsIDb3lLiIw4=ords：CentipedaMinimaDispensingGranules;Fingerprints;QAMS;ChlorogenicAcidEtc

鵝不食草為菊科植物鵝不食草Centipedaminima（L.）A.Br.EtAschers.的干燥全草［1］。用于風(fēng)寒頭痛，咳嗽痰多，鼻塞不通，鼻淵流涕［2-6］。鵝不食草中分含有酚酸類、黃酮類、萜類、揮發(fā)性成分等［7-10］。配方顆粒以傳統(tǒng)中醫(yī)藥煎為基礎(chǔ)研究供臨床使用的單味藥顆粒劑，遵循中醫(yī)辨證論治，保持原中藥的特性［11］。目前鵝不食草配方顆粒劑鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有顆粒劑標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4，5-O-二咖啡?；鼘幒俊Ｖ兴幩M分復(fù)雜［12-13］，簡(jiǎn)單含量檢測(cè)方法無(wú)法滿足中藥現(xiàn)代化檢測(cè)要求。本研究將指紋圖譜方法與一測(cè)多評(píng)方法（QAMS）相結(jié)合，同時(shí)測(cè)定鵝不食草配方顆粒劑中7個(gè)有機(jī)酸類成分，客觀評(píng)價(jià)不同批次間的品質(zhì)差異，同時(shí)節(jié)省檢測(cè)成本［14-15］。以期為鵝不食草配方顆粒中藥現(xiàn)代化的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。

1儀器與試藥

WatersH-Class型超高液相色譜儀；XSR304型電子天平（METTLER-OLEDO儀器公司）；KQ500DE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ULUPURE超純水儀器。18批鵝不食草配方顆粒（批號(hào)：1605001W、1609001W、1701001W、1702001W、1708001W、1710001W、1806001W、1805001W、1806001W、1909001S、1806001S、1911001W、2003001W、2005001W、2007001W、2007001S、2108001S、2109001S）；乙腈（色譜純），默克股份有限公司；其他試劑均為分析純。

對(duì)照品成分代號(hào)及信息見(jiàn)表1。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件采用AgilentPoroshell120SB-Aq色譜柱（2.1mm×150mm，1.9μm），流動(dòng)相A為乙腈、B為0.1%磷酸，按照程序進(jìn)行洗脫（0～15min，3%A→8%A；15～20min，8%A→12%A；20～50min，12%A→20%A；50～60min，20%A；60～70min，20%A→25%A；70～90min，25%A→30%A；90～100min，30%A→35%A），流速為每分鐘0.2mL；柱溫為25℃；0～60min檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，60～100min檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm，進(jìn)樣量1μL。

2.2對(duì)照品溶液制備取對(duì)照品適量，精密稱定，轉(zhuǎn)移至容量瓶里，加甲醇制成每1mL各含50μg的溶液。

2.3供試品溶液制備取鵝不食草配方顆粒研成粉末，取約0.4g，精密稱定，放進(jìn)三角錐形瓶中，精密移取50%甲醇25mL加入樣品里面，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻率53kHz）30min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4指紋圖譜的建立

2.4.1精密度試驗(yàn)取同一制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一制備供試品溶液，分別于0h、2h、8h、10h、12h、24h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)取按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5指紋圖譜分析與評(píng)價(jià)

2.5.1樣品測(cè)定取18批鵝不食草配方顆粒樣品按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定進(jìn)樣測(cè)定，記錄UPLC圖譜。

2.5.2指紋圖譜建立采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.0版），18批鵝不食草配方顆粒結(jié)果圖譜以S1圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)對(duì)照譜圖生成法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1，多點(diǎn)校正，全譜峰匹配，生成指紋圖譜共有模式，計(jì)算相似度結(jié)果。標(biāo)定共有峰26個(gè)。以峰9（綠原酸）為參照峰S1峰，計(jì)算峰1～峰8、峰10～峰12的相對(duì)保留時(shí)間；峰18（3，5-二-O-咖啡?？鼘幩幔閰⒄辗錝2峰，計(jì)算峰13～峰17、峰19～峰22相對(duì)保留時(shí)間；峰26（短葉老鸛草素A）為參照峰S3，計(jì)算峰23～峰25的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算18批鵝不食草配方顆粒各特征峰相對(duì)保留時(shí)間為0.01%～0.80%，由此可見(jiàn)，建立的特征圖譜各特征峰出峰時(shí)間較穩(wěn)定。18批次鵝不食草配方顆粒與對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度為0.952～0.997，均大于0.900，如圖1、圖2及表2所示。該圖譜可做為鵝不食草配方顆粒的指紋圖譜。

2.5.3化學(xué)成分指認(rèn)對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，將對(duì)照品保留時(shí)間與供試品保留時(shí)間等信息進(jìn)行比對(duì)分析，一共確定12個(gè)已知成分，分別為XL（峰5）、KS（峰7）、YL（峰8）、LS（峰9）、LD（峰14）、SN（峰16）、YB（峰17）、YA（峰18）、YC（峰20）、SZ（峰24）、XS（峰25）、DA（峰26）。對(duì)照品及供試品色譜定位圖如圖3所示。

2.6QAMS法測(cè)定指標(biāo)成分含量

2.6.1色譜條件及供試品溶液制備同“2.1”“2.3”項(xiàng)下。

2.6.2線性關(guān)系考察分別精密稱取LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA對(duì)照品10.133mg、10.231mg、10.556mg、11.566mg、12.843mg、10.433mg、10.074mg分別放進(jìn)容量瓶?jī)?nèi)，加入少量甲醇使溶解后，定容至刻度，作為對(duì)照品貯備液。取10mL容量瓶，分別精密吸取0.01mL、0.1mL、1mL、2mL、5mL上述對(duì)照品液放入，并定容，即得線性溶液。將上述溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄檢測(cè)結(jié)果，以峰面積和對(duì)照品濃度（μg/mL）來(lái)計(jì)算回歸方程及線性范圍，見(jiàn)表3。

2.6.3精密度試驗(yàn)分別精密吸取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA面積RSD，結(jié)果分別為0.13%、1.90%、0.93%、0.32%、0.28%、0.12%、0.20%，表明儀器的精密度良好。

2.6.4穩(wěn)定性試驗(yàn)分別精密吸取同一供試品溶液，分別于0h、2h、8h、10h、12h、24h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA峰面積RSD，結(jié)果分別為0.35%、1.02%、0.93%、0.32%、0.51%、0.32%、0.43%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5重復(fù)性試驗(yàn)按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，計(jì)算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA含量RSD，結(jié)果分別為1.13%、0.96%、0.48%、1.30%、1.11%、1.19%、1.56%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.6.6加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的鵝不食草配方顆粒0.2g，共9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每組分別加入LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA對(duì)照品溶液，加入量為鵝不食草配方顆粒中各成分含量的50%、100%和150%，制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6.7相對(duì)校正因子計(jì)算計(jì)算各目標(biāo)成分的相對(duì)校正因子，根據(jù)公式f=W/A，以綠原酸為內(nèi)參物質(zhì)，根據(jù)公式fis=fi/fs=（Ai/Wi）/（As/Ws），確定相對(duì)校正因子，f為絕對(duì)校正因子，W為質(zhì)量濃度，A為峰面積，fi為內(nèi)參物i的絕對(duì)校正因子，fs為待測(cè)物s的絕對(duì)校正因子，Wi為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，Ai為內(nèi)標(biāo)峰面積，Ws為待測(cè)物質(zhì)量濃度，As為待測(cè)物峰面積［15］。

取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，進(jìn)行測(cè)定，以綠原酸為內(nèi)參物，根據(jù)公式分別計(jì)算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.6.8相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察分別精密吸取同一供試品溶液，考察不同耐用性條件的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.6.9待測(cè)色譜峰定位采用待測(cè)成分與綠原酸保留時(shí)間的相對(duì)值作為定位標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算不同耐用性條件下的LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA酸的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果各待測(cè)成分保留時(shí)間RSD均小于3%，表明重現(xiàn)性較好，見(jiàn)表7。

2.6.10QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較取18批鵝不食草配方顆粒樣品，進(jìn)行檢測(cè)，分別采用外標(biāo)法和相對(duì)校正因子進(jìn)行計(jì)算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA的含量。結(jié)果表明，用兩種不同的檢測(cè)方法進(jìn)行計(jì)算測(cè)得實(shí)測(cè)值無(wú)明顯不同，見(jiàn)表8。

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇本研究比較不同濃度的磷酸0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%。0.01%、0.02%磷酸條件下，部分色譜峰重疊，分離度較差。在0.1%磷酸至0.4%磷酸之間體系下考察，同時(shí)測(cè)定各成分含量。結(jié)果顯示各特征峰基線分離度較好，峰型較好，出峰順序一致。該方法重現(xiàn)性良好，且適用于含量測(cè)定。出于對(duì)儀器及色譜柱的保護(hù)，因此選定濃度相對(duì)較低的0.1%磷酸作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇采用PDA檢測(cè)器在進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，0～60min中7個(gè)成分最大吸收波長(zhǎng)存在一定差異，在325nm指標(biāo)成分色譜峰響應(yīng)值較高，且各特征峰之間分離度較好。故選擇325nm下檢測(cè)LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA。60～100min多為萜類成分，在檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm下響應(yīng)較好，基線較平，雜峰較少。結(jié)合含量測(cè)定方法。最終確定0～60min檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，60～100min檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm。

3.3耐用性考察的選擇本研究考察了考察柱溫（23℃、25℃、27℃）、流速（0.19mL/min、0.20mL/min、0.21mL/min）對(duì)色譜分離的影響。不同柱溫條件下，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值范圍為0.01%～1.71%，不同流速條件下，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值范圍為0.01%～2.49%，該方法對(duì)不同柱溫、流速具有良好的耐用性。

根據(jù)文獻(xiàn)［7-8，13-18］報(bào)道，目前各產(chǎn)地市售鵝不食草藥材有機(jī)酸、黃酮等成分的含量差異較大，由此會(huì)導(dǎo)致鵝不食草配方顆粒質(zhì)量存在的差異。采用外標(biāo)法及QAMS法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果平均偏差為0.01%～3.88%，18批次樣品的含量顯示（見(jiàn)表9），鵝不食草顆粒中各批次成分含量差異較大，本研究所建立的鵝不食草QAMS方法能夠有效對(duì)成分進(jìn)行檢測(cè)，并能夠有效對(duì)顆粒質(zhì)量進(jìn)行控制。鵝不食草對(duì)照指紋圖譜是以18批鵝不食草配方顆粒擬合建立的，共標(biāo)定26個(gè)共有特征峰，相對(duì)保留時(shí)間RSD值0.01%～0.80%，各圖譜相似度均大于0.9。說(shuō)明該指紋圖譜具有對(duì)照意義，專屬性強(qiáng)，這對(duì)于鵝不食草配方顆粒質(zhì)量的有效控制及合理應(yīng)用都具有一定的意義。

鵝不食草配方顆粒指紋圖譜及QAMS方法采用現(xiàn)代科技手段進(jìn)行質(zhì)量控制。兩種方法的結(jié)合能夠簡(jiǎn)化檢測(cè)，節(jié)約時(shí)間、利益成本。為鵝不食草配方顆粒中藥現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)控制提供了研究依據(jù)，對(duì)藥品質(zhì)量起到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、客觀化描述和評(píng)價(jià)。

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（收稿日期：2023-12-15編輯：劉斌）

基金項(xiàng)目：深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JSGG20191129093418578）。

作者簡(jiǎn)介：李璐（1993—），男，漢族，碩士，助理工程師，研究方向?yàn)橹兴庯嬈爸兴幣浞筋w粒研究。E-mail：LILU210@999.com.cn

通信作者：江斌（1989—），男，侗族，碩士，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴庯嬈爸兴幣浞筋w粒研究。Email：JIANGBIN51@999.com.cn