利用雙重實時熒光重組酶輔助擴增技術(shù)快速檢測肉制品中鼠源性成分

摘 要：為實現(xiàn)肉制品中大鼠和小鼠源性成分的同步檢測，基于實時熒光重組酶輔助擴增（real-time recombinase-aided amplification，Rt-RAA）技術(shù)，以大鼠COX3基因和小鼠16S rRNA基因序列保守區(qū)域為靶標(biāo)，分別設(shè)計相應(yīng)的Rt-RAA引物和探針，通過反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化確定最佳雙重Rt-RAA檢測反應(yīng)條件。進一步對建立的雙重Rt-RAA檢測方法進行特異性、靈敏度及穩(wěn)定性評估，并應(yīng)用該方法對模擬市售肉制品進行檢測。結(jié)果表明，所建立的雙重Rt-RAA檢測方法特異性強、穩(wěn)定性好，大鼠和小鼠源性成分的檢出限分別為0.5%和0.2%，同步檢測2 種源性成分檢出限為0.5%，同步檢測混合模擬市售樣品檢出限仍低至0.5%，雙重Rt-RAA與實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)對市售樣品和模擬樣品檢測結(jié)果高度一致。因此，本研究建立的雙重Rt-RAA檢測方法適用于大鼠和小鼠源性成分的檢測，為肉制品摻假檢測提供了一種快捷、高效及準確的新方法。

關(guān)鍵詞：大鼠；小鼠；肉制品；實時熒光重組酶輔助擴增技術(shù)；肉制品摻假

Rapid Detection of Mouse-Derived Components in Meat Products by Duplex Real-Time Recombinase-Aided Amplification

LIU Mingming， ZHOU Zhaoxu， YAN Haiyan， TIAN Biying， LI Genrong*

（National Center of Quality Supervision & Inspection Agricultural Processed Products and Condiments，

Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection， Chongqing 400020， China）

Abstract： In this study， real-time recombinase-aided amplification （Rt-RAA） was used for the synchronous detection of rats- and mice-derived components in meat products. Primers and probes targeting the conserved sequences of the COX3 gene in rats and those of the 16S rRNA gene in mice were designed. The reaction parameters were optimized to establish the optimal reaction conditions for duplex Rt-RAA detection. Furthermore， the specificity， sensitivity and stability of the established duplex Rt-RAA method were evaluated， and it was applied to simulated commercial meat products. The results showed that this method had strong specificity and stability. The detection limits for rats- and mice-derived components were 0.5% and 0.2%， respectively. The detection limits for their synchronous detection were both 0.5%， and the detection limits for synchronous detection of rats- and mice-derived components mixed in simulated commercial meat samples were still as low as 0.5%. Using duplex Rt-RAA and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （real-time PCR）， highly consistent results were obtained for commercially available samples and simulated samples. Therefore， the duplex Rt-RAA method is suitable for the detection of rats- and mice- derived components in meat products， providing a fast， efficient， and accurate new method for the detection of meat product adulteration.

Keywords： rats; mice; meat products; real-time recombinase-aided amplification; meat product adulteration

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240522-122

中圖分類號：TS251.7 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）09-0015-06

引文格式：

劉明明， 周朝旭， 顏海燕， 等. 利用雙重實時熒光重組酶輔助擴增技術(shù)快速檢測肉制品中鼠源性成分[J]. 肉類研究， 2024， 38（9）： 15-20. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240522-122. http：//www.rlyj.net.cn

LIU Mingming， ZHOU Zhaoxu， YAN Haiyan， et al. Rapid detection of mouse-derived components in meat products by duplex real-time recombinase-aided amplification[J]. Meat Research， 2024， 38（9）： 15-20. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240522-122. http：//www.rlyj.net.cn食品摻假是指在未注明標(biāo)簽的情況下，添加或減少某些改變食品成分、影響營養(yǎng)價值甚至不被社會接受的物質(zhì)[1]。目前，肉制品是提供人體氨基酸和蛋白質(zhì)等必需營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源之一，隨著國內(nèi)外生活水平的不斷提升，其消耗量逐年遞增，一些制造商為追逐更高利潤，用廉價肉代替或摻入優(yōu)質(zhì)肉類但并未注明標(biāo)簽進行銷售，如在牛肉產(chǎn)品中摻加馬肉和豬肉[2]、羊肉產(chǎn)品中摻加鼠肉[3]等。故肉類摻假不僅使消費者利益受損，且威脅健康，特別是鼠肉，因鼠類對生存環(huán)境要求較低，常攜帶大量病毒，且可能食用毒鼠藥物中毒[4]。因此，不真實的肉制品標(biāo)簽可能避開檢驗檢疫，使人畜共患的病毒傳入人體，造成嚴重的公共衛(wèi)生風(fēng)險[5]。雖然我國的食品安全監(jiān)管部門對于肉類摻假方面嚴格篩查，但相應(yīng)的檢測標(biāo)準仍有待完善[6]，尤其是鼠肉這種特殊成分的鑒定。此外，現(xiàn)有的檢測方法難以滿足肉類快速消費下大批量產(chǎn)品的檢測需求。因此，亟需建立快速、有效、準確和高通量的檢測技術(shù)，以防止摻假肉制品的非法銷售。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是大多數(shù)生物體的遺傳物質(zhì)，相比于蛋白質(zhì)具有更高的穩(wěn)定性和特異性，因此基于DNA的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)在現(xiàn)有的肉類摻假檢測方法中應(yīng)用最為廣泛[7]，如傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time PCR）和數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）等[8-9]。傳統(tǒng)PCR技術(shù)具有操作簡單、成本低廉的優(yōu)點，但其檢測時間長且不能定量分析。雖然real-time PCR和dPCR實現(xiàn)了實時定量或定性檢測，但其設(shè)備昂貴，對人員專業(yè)程度要求較高[10-11]。近年來，隨著等溫擴增技術(shù)的發(fā)展，如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)已被應(yīng)用于加工肉制品中肉的種類鑒定[12]，該技術(shù)在恒溫條件下可擴增目標(biāo)DNA，但需4～6 條擴增引物，易出現(xiàn)假陽性，且擴增時間長（1 h以上）[13]。

實時熒光重組酶輔助擴增（real-time recombinase- aided amplification，Rt-RAA）作為近年來新興的擴增技術(shù)，克服了傳統(tǒng)PCR等PCR技術(shù)檢測時間長且需依賴變溫儀器的缺點，在恒溫條件下即可實時快速擴增目的DNA[14]。此外，相比于LAMP，Rt-RAA僅需1 對引物和1 條中間修飾的探針，避免了因引物二聚體導(dǎo)致的假陽性。因其具有恒溫、快速、準確及操作簡便的優(yōu)點，在本研究中基于Rt-RAA檢測技術(shù)建立同步鑒定大鼠、小鼠源性成分的檢測方法，并評估其特異性、靈敏度和穩(wěn)定性，實現(xiàn)這2 種成分在肉制品中的快速檢測，旨在為肉類摻假提供更有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠、小鼠活體購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。鴨肉、牛肉、馬肉、羊肉、豬肉、雞肉、鵝肉購自當(dāng)?shù)兀ㄖ貞c）超市，除馬肉外其他通過外觀確認。馬肉與購自京東和淘寶的駱駝肉、馬鹿肉、梅花鹿肉、驢肉的真實性通過相關(guān)檢測標(biāo)準進行鑒定。

RAA熒光核酸擴增試劑盒 杭州眾測生物科技有限公司；通用型核酸提取試劑盒 成都TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JXFSTPRP-32組織研磨儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；CFX96 Touch熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Nanodrop ONEc超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司；ME403千分之一電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；GR85DA高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

羊肉、豬肉、牛肉作為日常食用的肉類，并且為紅肉，與鼠肉相似，故本研究將此3 種鮮肉充分粉碎混合作為后續(xù)實驗樣本基底肉（以下稱基底肉）。將基底肉與大鼠和小鼠肉按照不同的質(zhì)量比進行混合，以確定混合肉制品中大鼠和小鼠源性成分檢出限。

實際的深加工或熟肉制品（如肉串、火腿腸等）中，通常存在多種肉混合的情況。為了模擬檢測市售深加工或熟肉制品，將新鮮的羊肉、豬肉、牛肉與大鼠和小鼠肉按照不同的質(zhì)量比進行混合，并通過高壓滅菌鍋121 ℃、20 min進行高壓蒸熟處理。

1.3.2 樣本DNA提取

參考試劑盒使用說明書進行提取，取25～100 mg組織樣本置于含鋼珠的離心管中，將裂解液加入其中進行充分研磨，隨后加入相應(yīng)的蛋白酶和RNA酶于56 ℃水浴鍋中至樣品組織完全溶解，后續(xù)通過吸附、離心、洗滌和洗脫得到總基因組DNA。采用超微量分光光度計在260 nm和280 nm波長處測定DNA濃度和純度，將純度（A260 nm/A280 nm）為1.7～1.9的樣本基因組DNA稀釋至約150 ng/mL，并于－20 ℃保存，備用。

1.3.3 雙重Rt-RAA引物、探針設(shè)計與合成

基于小鼠16S rRNA基因序列（序列號：GU332589.2）和大鼠細胞色素c氧化酶亞基III（cytochrome c coxidase subunit III，COX3）基因（基因ID：26204），根據(jù)Rt-RAA引物和探針設(shè)計原則，使用Snap Gene軟件設(shè)計大鼠、小鼠特異性引物各1 對，從引物區(qū)間擴增子序列區(qū)域設(shè)計RAA探針各1 條（表1）。引物和探針均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.4 大鼠和小鼠雙重Rt-RAA檢測條件

首先對雙重Rt-RAA方法的引物和探針濃度、反應(yīng)溫度等檢測條件進行測試與優(yōu)化。通過Rt-RAA核酸擴增試劑（熒光型）說明書運行程序，測試雙重Rt-RAA反應(yīng)體系中不同的引物和探針濃度，最終優(yōu)化得到最佳反應(yīng)體系包括400 nmol/L COX3-F、-R引物，200 nmol/L COX3-P探針，200 nmol/L 16S rRNA-F、-R引物，60 nmol/L

16S rRNA-P探針，25 μL水化緩沖液，2.5 mL MgAc緩沖溶液（280 mmol/L），DNA模板各1 μL，用雙蒸水補齊至50 μL。在此體系下，設(shè)置31～41 ℃的溫度梯度進行反應(yīng)，最終確立39 ℃為最佳反應(yīng)溫度。每組實驗設(shè)置3 個平行。

雙重Rt-RAA檢測條件反應(yīng)程序為：30 s/循環(huán)，40 個循環(huán)。

1.3.5 雙重Rt-RAA特異性實驗

按照1.3.4節(jié)確立的最終雙重Rt-RAA檢測條件，對建立的方法進行特異性驗證實驗，以提取的鴨肉、牛肉、馬肉、羊肉、豬肉、雞肉、鵝肉、駱駝肉、馬鹿肉、梅花鹿肉及驢肉DNA為特異性實驗驗證的非目標(biāo)擴增序列，以大鼠肉和小鼠肉的DNA為陽性對照，并用雙蒸水作為空白對照，以確定所建立方法的特異性。

1.3.6 雙重Rt-RAA靈敏度實驗

將大鼠肉和小鼠肉分別與基底肉混合，制成大鼠肉和小鼠肉質(zhì)量分數(shù)均分別為20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的2 組混合模擬樣品，按照1.3.2節(jié)提取DNA，按照1.3.4節(jié)最佳反應(yīng)條件及反應(yīng)程序進行恒溫擴增，以確定所建立的方法分別對大鼠肉、小鼠肉的檢測靈敏度和同步檢測大鼠肉、小鼠肉的靈敏度，并與BJS 201904《食品中多種動物源性成分檢測實時熒光PCR法》中real-time PCR方法檢測靈敏度進行對比。

1.3.7 雙重Rt-RAA穩(wěn)定性實驗

以1.3.6節(jié)確定的大鼠肉、小鼠肉的檢出限進行6 次平行實驗，按照1.3.4節(jié)最佳反應(yīng)條件及反應(yīng)程序進行雙重Rt-RAA擴增，以確定該檢測方法的穩(wěn)定性。

1.3.8 模擬市售樣品實驗

按照1.3.1節(jié)方法制備1.3.6節(jié)質(zhì)量比模擬樣品，制得同時含有大鼠肉和小鼠肉且各自所占質(zhì)量分數(shù)分別為10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的7 種混合模擬市售熟肉制品，按照1.3.2節(jié)提取DNA，按照1.3.4節(jié)最佳反應(yīng)條件及反應(yīng)程序進行擴增，以確定該方法對實際樣品中大鼠肉、小鼠肉同步檢檢測的可靠性。

1.3.9 市售樣品和模擬樣品實驗

在燒烤店和燒烤擺位購買25 份樣品，按照1.3.1節(jié)方法制作模擬樣品，大鼠、小鼠肉質(zhì)量分數(shù)均為0.5%。按照1.3.2節(jié)提取DNA，利用本研究建立的雙重Rt-RAA方法和real-time PCR方法進行鼠源性成分檢測，對比分析并評價實驗結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用PowerPoint軟件作圖。采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重Rt-RAA檢測條件的建立與優(yōu)化

本研究主要對引物和探針濃度進行優(yōu)化，最大限度地提高雙重Rt-RAA檢測方法擴增效率。如表2所示，在雙重反應(yīng)體系中大鼠和小鼠的引物（400 nnmol/L）和探針（120 nmol/L）濃度相同的條件下，小鼠的熒光擴增曲線對大鼠的熒光擴增曲線表現(xiàn)出一定的抑制。因此，通過降低小鼠的引物和探針濃度，并增加大鼠的引物和探針濃度，對雙重擴增體系進行優(yōu)化。最終確定小鼠的引物和探針濃度分別為200 nmol/L和60 nmol/L，大鼠的引物和探針濃度分別為400 nmol/L和200 nmol/L，并得到雙重Rt-RAA最佳檢測循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值。

為了優(yōu)化雙重Rt-RAA檢測方法反應(yīng)溫度，在31～41 ℃進行溫度梯度實驗。如表3所示，在31～39 ℃，隨著溫度的升高，檢測大鼠和小鼠的Ct值逐漸降低。在41 ℃時，熒光擴增曲線則呈現(xiàn)出延遲，其中大鼠延遲幅度最大。因此，為了使雙重Rt-RAA方法實現(xiàn)快速檢測，將39 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.2 雙重Rt-RAA的檢測特異性

按照優(yōu)化的檢測條件對雙重Rt-RAA方法進行特異性驗證。如圖1所示，提取的鴨肉、牛肉、馬肉、羊肉、豬肉、雞肉、鵝肉、駱駝肉、馬鹿肉、梅花鹿肉及驢肉等非目標(biāo)DNA和空白對照均未出現(xiàn)擴增，只有大鼠和小鼠樣品DNA出現(xiàn)了擴增曲線，表明雙重Rt-RAA檢測方法具有良好的特異性。

2.3 雙重Rt-RAA的檢測靈敏度

如圖2所示，大鼠和小鼠源性成分的檢測靈敏度分別為0.5%和0.2%。

A.檢測大鼠源性成分靈敏度；B.檢測小鼠源性成分靈敏度。

根據(jù)其檢測靈敏度，仍以羊肉、豬肉、牛肉粉碎混合作為基底肉，制備同時含有大鼠肉和小鼠肉，其質(zhì)量分數(shù)均分別為5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的6 種混合樣品，結(jié)果表明，利用雙重Rt-RAA方法同步檢測大鼠和小鼠源性成分的靈敏度仍低至0.5%（圖3A），real-time PCR方法檢測靈敏度則為2%（圖3B）。表明本研究建立的鼠源性雙重Rt-RAA檢測方法靈敏度較傳統(tǒng)的real-time PCR檢測方法得到進一步的提升，為檢測更低質(zhì)量比鼠源性成分提供了新的方法。

A.雙重Rt-RAA方法；B. real-time PCR方法。

2.4 雙重Rt-RAA的檢測穩(wěn)定性

為了確定雙重Rt-RAA方法同步檢測大鼠和小鼠源性成分的穩(wěn)定性，本研究對同時含有大鼠肉與小鼠肉且各自所占質(zhì)量分數(shù)均為0.5%的模擬樣品進行同步檢測。如圖4

所示，對設(shè)置的6 個平行，均能同步擴增出大鼠和小鼠DNA，表明所建立的雙重Rt-RAA方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 模擬市售樣品測定結(jié)果

如圖5所示，本方法對于大鼠肉和小鼠肉質(zhì)量分數(shù)為0.5%的混合模擬市售熟肉制品仍能檢出大鼠和小鼠源性成分。因此，表明本研究所建立的雙重Rt-RAA方法可用于實際檢測。

2.6 市售樣品和模擬樣品測定結(jié)果

為進一步驗證本研究所建立的檢測方法的適用性，用雙重Rt-RAA方法和BJS 201904中real-time PCR方法對25 份市售樣品進行檢測，結(jié)果高度一致，如表4所示。由于檢出陽性樣本數(shù)較少，在實驗中增加了模擬樣品進行對比檢測，2 種方法檢測結(jié)果符合率為100%。

3 討論與結(jié)論

在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，肉制品摻假屢禁不絕，不僅給消費者帶來經(jīng)濟損失，且可能會對身體造成危害和引發(fā)疫病傳染風(fēng)險[15]。從歐洲的“馬肉風(fēng)波”至近年來被曝光的亞洲“鼠肉丑聞”事件，肉制品的摻假問題已經(jīng)成為社會公眾關(guān)注的焦點。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，其摻假檢測技術(shù)也在不斷趨于完善。DNA作為絕大多數(shù)生物體遺傳物質(zhì)，具有高穩(wěn)定性和保守性的特點，基于此建立的PCR檢測技術(shù)[16]、real-time PCR檢測技術(shù)[17]及等溫擴增技術(shù)[18]等逐漸成為動物源性成分檢測的國家標(biāo)準或行業(yè)標(biāo)準。目前，Ahamad等[19]建立多重PCR以區(qū)分兔肉、大鼠肉和松鼠肉。Suryawan等[20]基于細胞色素b（Cytb）基因開發(fā)了單重PCR方法，特異性檢出印尼牛肉丸中的大鼠源性成分。王學(xué)政等[21]同樣通過Cytb基因序列，設(shè)計針對鼠源性成分的熒光PCR法特異性引物。Duan Siqi等[4]建立并驗證一種基于物種特異性PCR技術(shù)快速鑒別肉制品中鼠肉真?zhèn)蔚脑噭┖?。陳珍金等[22]分別開發(fā)了大鼠和小鼠源性成分的LAMP檢測技術(shù)，用于羊肉制品中鼠源性成分的檢測。然而，基于雙重Rt-RAA技術(shù)同步檢測大鼠和小鼠源性成分的技術(shù)鮮見報道。

鼠類是一種嚙齒類哺乳動物，繁殖速度快、數(shù)量多，對生存環(huán)境要求低，生命力強。常攜帶流感病毒、冠狀病毒及尼帕病毒等[23]，嚴重威脅消費者健康。鼠肉為紅肉，摻入可食用的肉及肉制品中難以通過外觀判斷。此外，復(fù)雜的樣品基質(zhì)相互干擾，對于檢測的準確度和特異性同樣產(chǎn)生嚴重的影響。隨著人們對于肉制品的需求不斷增加，已報道的鼠源性成分檢測方法難以滿足大批量的檢測。

Rt-RAA是一種基于重組酶、DNA聚合酶及單鏈DNA結(jié)合蛋白3 種關(guān)鍵因子，在恒溫條件下通過核酸外切酶（exonuclease，exo）探針實時監(jiān)測特定DNA擴增過程的檢測技術(shù)[24-25]，exo探針含有與四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）殘基緊密相連的內(nèi)部熒光基團和猝滅基團[26]。當(dāng)exo探針與目標(biāo)序列相結(jié)合時，連接熒光基團與猝滅基團THF被切斷，進而產(chǎn)生熒光，該熒光可以被常規(guī)的熒光定量儀器所檢測，降低了Rt-RAA檢測技術(shù)對儀器的要求。Rt-RAA檢測技術(shù)具有簡單、快速、特異性強和靈敏度高的優(yōu)點[27]。相對于實時熒光重組酶聚合酶擴增（real-time recombinase polymerase amplification，Rt-RPA）檢測技術(shù)，Rt-RAA重組酶從細菌或真菌中獲得，來源范圍廣、成本低，且是我國自主研發(fā)的新型核酸擴增技術(shù)，而Rt-RPA重組酶則來自于T4噬菌體，來源范圍窄、獲取成本高[28-29]。因此，本研究基于大鼠的COX3基因和小鼠的16S rRNA基因序列建立雙重Rt-RAA反應(yīng)檢測體系。實驗結(jié)果表明，所建立的雙重Rt-RAA特異性強、穩(wěn)定性好，雙重體系分別檢測大鼠和小鼠源性成分的檢出限分別為0.5%和0.2%，同步檢測2 種源性成分檢出限低至0.5%，并在模擬熟肉制品中同步檢出限仍為0.5%，明顯優(yōu)于real-time PCR方法檢測靈敏度。雙重Rt-RAA方法與real-time PCR方法對市售樣品和模擬樣品檢測結(jié)果具有高度一致性，符合率為100%。

與陳珍金等[22]建立的LAMP檢測方法實驗結(jié)果相比，Rt-RAA方法可在39 ℃恒溫條件下30 min內(nèi)完成檢測，而LAMP方法則需要63 ℃恒溫條件、45 min才能完成檢測。同時，Rt-RAA檢出限與LAMP檢測大鼠和小鼠的檢出限基本相當(dāng)。此外，Rt-RPA檢測方法并未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，通過6 次平行實驗驗證，本研究建立的檢測方法具有很好的穩(wěn)定性。因此，本研究建立的雙重Rt-RAA檢測方法適用于肉制品中大鼠和小鼠源性成分的快速檢測，為現(xiàn)場快速檢測肉制品摻假提供了另一條快捷、實用的檢測方法。

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