煙草疫霉拮抗菌的分離鑒定及其生防和發(fā)酵特性

摘要：以湖南郴州廣西中煙基地單元黑脛病發(fā)病區(qū)域采集的健康煙田土壤為樣本，采用土壤原位平板培養(yǎng)法，從卵菌類群中的煙草疫霉生長(zhǎng)的平板上篩選出1株對(duì)煙草疫霉有抑制作用的真菌LYQ01。經(jīng)過18S-ITS序列擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌與拜賴青霉（Penicillium bilaiae）序列的匹配率為99.65%，因此初步鑒定為拜賴青霉。隨后參照土壤磷循環(huán)有關(guān)的拜賴青霉菌株ATCC 20851的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，隨機(jī)擴(kuò)增得到次級(jí)代謝產(chǎn)物合成有關(guān)基因簇的4個(gè)片段，總長(zhǎng)度約6 kb，測(cè)序后比對(duì)發(fā)現(xiàn)該菌的4個(gè)片段序列與拜賴青霉ATCC 20851的相似性達(dá)到了99.9%。利用該青霉菌進(jìn)行煙草疫霉菌平板對(duì)峙試驗(yàn)，以及青霉菌發(fā)酵原液、提取液進(jìn)行煙草疫霉和根結(jié)線蟲的生防試驗(yàn)，論證其分泌的酶與代謝產(chǎn)物對(duì)植物根結(jié)線蟲、煙草黑脛病菌具有抑殺作用。由于菌劑生產(chǎn)過程中調(diào)低pH值可以防止雜菌污染，因此確定青霉菌生長(zhǎng)的酸性閾值為pH值 2.5。利用幾種單糖等有機(jī)碳源，初步分析該菌對(duì)碳源的利用情況，結(jié)果顯示，木糖與燕麥片最適合作為青霉菌生長(zhǎng)的碳源，其次是葡萄糖與果糖，最佳濃度為0.5 g/100 mL。為了后續(xù)對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳操作，確定潮霉素B可以用于構(gòu)建菌株遺傳操作體系，其應(yīng)用時(shí)的濃度范圍為125～250 μg/L。

關(guān)鍵詞：生物防治；煙草疫霉；煙草黑脛病；根結(jié)線蟲；拜賴青霉

中圖分類號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）16-0161-09

植物病蟲害防治為農(nóng)業(yè)治理中的主要問題之一。目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)土壤植物病蟲害治理主要依靠化學(xué)防治，但是農(nóng)藥殘留超標(biāo)對(duì)食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。隨著人們生活水平的提高，食品安全問題備受關(guān)注，為了降低農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)，生物防治技術(shù)逐漸受到重視。在植物保護(hù)領(lǐng)域和食品安全領(lǐng)域，利用生物防治降低植物病蟲害發(fā)生已成為重要課題。生物防治是指利用生物及其代謝產(chǎn)物防治植物病害控制病原體的方法，通過生物種間關(guān)系、種內(nèi)關(guān)系降低有害病菌在入侵部位的密度，使得病原生物變少，從而減少植物病蟲害的暴發(fā)，達(dá)到用生物防治生物的目的。從自然界尋找既能緩解植物病害又對(duì)環(huán)境生態(tài)影響較小的生物新技術(shù)，利用生物之間的相互作用對(duì)植物病蟲害達(dá)到無公害化處理和持續(xù)性防治的目的，逐漸成為備受關(guān)注和具有發(fā)展前景的新興領(lǐng)域。生防菌是一種具有生物防治作用的微生物群，具有繁殖力高、所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物及活性酶種類繁多、對(duì)病原物的抑制機(jī)理多種多樣、易于快速大規(guī)模培養(yǎng)等特點(diǎn)，其自身往往與植物是互利共生的生物關(guān)系，主要包括細(xì)菌、放線菌、真菌等，目前運(yùn)用較多的生防細(xì)菌有芽孢桿菌（Bacillus）［1-6］、假單胞桿菌（Pseudomonas）［7-9］，生防真菌有木霉菌（Trichoderma）［10-13］等。因此，以生防菌為主體的殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。

黑脛病是一種由煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）侵染所致的、極其嚴(yán)重的土傳卵菌病害，是煙草種植中不可忽視的嚴(yán)重病害［14-15］。黑脛病菌在侵染煙草植株的過程中釋放毒素，瓦解植株細(xì)胞，其分泌物含半乳糖苷酶，可分解宿主細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)層和導(dǎo)管壁，產(chǎn)生果膠產(chǎn)物片段，然后形成凝膠團(tuán)塊［16-17］。該病在全國(guó)乃至世界范圍內(nèi)的煙草種植過程中均會(huì)發(fā)生，植株患病后會(huì)造成矮化、萎蔫、葉枯萎凋落以及根莖部分功能受損致使養(yǎng)分與水分運(yùn)輸受阻甚至壞死等現(xiàn)象。煙草種植面積的擴(kuò)大、種植周期的延長(zhǎng)以及自然環(huán)境由于多方面污染變得脆弱敏感，使得煙草黑脛病加重，不僅造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還破壞了生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性。

煙草根結(jié)線蟲病也是煙草種植過程中常見土傳病害之一，嚴(yán)重時(shí)不僅會(huì)導(dǎo)致煙株整株黃化萎蔫，還會(huì)導(dǎo)致青枯病、黑脛病、病毒病等多種其他病害聯(lián)合發(fā)生。一些研究團(tuán)隊(duì)也分離鑒定了生防菌，用其防治根結(jié)線蟲，其中就有淡紫擬青霉等青霉菌［18-22］。青霉菌是一種常見的霉菌，通常與土壤、腐爛的有機(jī)物以及水果和蔬菜的儲(chǔ)存腐爛物或病原體有關(guān)，它因生物降解有機(jī)物、生產(chǎn)青霉素和灰黃霉素等抗生素而聞名。草酸青霉（P. oxalicum）、灰黃青霉（P. griseofulvum）和繩狀青霉（P. funiculosum）、微紫青霉（P. janthinellum）等青霉菌均對(duì)作物土傳病害具有防治潛力，且生防青霉菌常具備廣譜抑菌活性［23-27］。一些青霉屬物種還可以在土壤中釋放固定磷，供植物利用［28］。與其他營(yíng)養(yǎng)素相比，在大多數(shù)土壤中磷的流動(dòng)性和對(duì)植物的可利用性最小。溶磷真菌在磷循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，以環(huán)境友好和可持續(xù)的方式向植物提供磷。拜賴青霉被用作種子接種劑，以提高各種作物的磷利用效率。拜賴青霉生長(zhǎng)在植物根部周圍，能溶解磷酸鈣、磷酸鐵和磷酸鋁中的磷。拜賴青霉基因組的測(cè)序，為揭示磷的溶解機(jī)制和真菌對(duì)磷循環(huán)作出了貢獻(xiàn)，它是最早被證明有效的真菌溶磷商業(yè)產(chǎn)品之一。張文芳等利用基因組測(cè)序、基因注釋以及 qRT-PCR 檢測(cè)方法，探明來自深海的拜賴青霉 F-28 真菌具有產(chǎn)生倍半萜的潛力。從大規(guī)模發(fā)酵真菌中分離出20個(gè)倍半萜，共鑒定出18個(gè)新的倍半萜類化合物，并表明化合物18是一種很有發(fā)展前景的抗神經(jīng)炎癥藥物［29］。孟令紅等將海洋來源的拜賴青霉MA-267和櫻桃青霉EN-480共培養(yǎng)，產(chǎn)生2種新的亞萜類衍生物，它們可以拮抗細(xì)菌病原菌［30］。Nakahara 等從1株拜賴青霉菌株的發(fā)酵液中鑒定出3種化合物，驗(yàn)證其殺根結(jié)線蟲的活性，在300 mg/L的濃度下致死率為52%～98%，其中吡啶二羧酸效果最好［31］。

本研究針對(duì)煙草黑脛病菌的防治，分離并鑒定了1株青霉。該青霉不僅能夠抑制煙草疫霉的生長(zhǎng)，還可以誘殺根結(jié)線蟲，是1株具有農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的潛力菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

供試菌株主要包括煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）、根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita），均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與抗生素

供試培養(yǎng)基主要包括燕麥培養(yǎng)基、海博PDA培養(yǎng)基（僅含有馬鈴薯提取物和葡萄糖）、索萊寶PDA培養(yǎng)基（含有馬鈴薯淀粉、葡萄糖和蛋白胨）；供試抗生素主要包括放線菌酮、制霉菌素、氯霉素、潮霉素B。

1.1.3 引物

供試引物由北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司合成，序列如下：ITS1，TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4，TCCTCCGCTTATTGATATGC。P450-1 721F，CGTAACCCGACAGCCAAGAG；P450-3 134R，TACAGAGTGAGTGAGCGTGA。P450-1 556F，TGTAATAGAAGCCGAAGTGC；P450-4 931R，TTTCAGGTGCGGTCGCTATG。P450-1 843F，TATTGGGAGTCGGCTTACAC；P450-5 284R，TAAGTCACCCACCGCACAAT。GH62-72F，CAGGTAGGGAGGGCTTCACA；GH62-2 085R，GGAGACGACGGAGACCCTGA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離方法

2023年7月于湖南郴州采集煙草黑脛病發(fā)病較重的煙地中的土壤樣品。其中，健康煙株周圍土壤樣品5份，將樣品0.5 g轉(zhuǎn)入1.5 mL無菌PBS緩沖液中打散；隨后用無菌PBS緩沖液稀釋至10-4 ～10-7 倍，分別取50 μL并涂于添加了抗生素的燕麥片平板（取市售燕麥片30 g，加入適當(dāng)水煮沸20～30 min，紗布過濾取汁，加入瓊脂20 g，定容至1 000 mL，pH值自然），28 ℃條件下培養(yǎng)；挑取霉菌單菌落，利用平板對(duì)峙生長(zhǎng)方法將單菌落和煙草疫霉接種于燕麥片抗生素平板，28 ℃條件下培養(yǎng)；觀察霉菌對(duì)植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)抑制情況，篩選出對(duì)煙草疫霉菌絲生長(zhǎng)均具有很強(qiáng)抑制效果的菌株。

1.2.2 形態(tài)學(xué)及分子鑒定方法

參照青霉屬的特征，測(cè)試菌株在PDA平板上的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)，利用通用引物ITS1/ ITS4（ITS1，3′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-5′；ITS4，3′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5′）進(jìn)行PCR測(cè)序。PCR 反應(yīng)體系如下：2×PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L ITS1引物1 μL，10 μmol/L ITS4引物 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL；PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃復(fù)性。膠回收 PCR產(chǎn)物送青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 青霉菌碳源利用試驗(yàn)

1.2.3.1 初始培養(yǎng)基 初始培養(yǎng)基由微量元素液體培養(yǎng)基和大量元素液體培養(yǎng)基混合而成。（1）微量元素液體培養(yǎng)基的配制。稱取10 g乙二胺四乙酸（EDTA）、4.4 g ZnSO4·7H2O、1.01 g MnCl2·4H2O、0.32 g CoCl2·6H2O、0.315 g CuSO4·5H2O、0.22 g （NH4）6Mo7O24·4H2O、1.47g CaCl2·2H2O、1.0 g FeSO4·7H2O，蒸餾水補(bǔ)足至200 mL，pH值調(diào)節(jié)至7左右［32-33］；分裝至50 mL移液管中，放入冷凍冰柜。（2）大量元素液體培養(yǎng)基的配制。稱取6.0 g NaNO3、1.5 g KH2PO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4，蒸餾水補(bǔ)足至1 000 mL，pH值調(diào)節(jié)至7左右。

1.2.3.2 含碳源培養(yǎng)基 取配制好的微量元素液體培養(yǎng)基200 μL，并置于含1 L大量元素液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，混合，分成10等分，分別加入到10個(gè)容量為300 mL的三角瓶中，即100 mL/個(gè)；再分別加入碳源（木糖1 g、普魯蘭1 g、葡萄糖1 g、果糖1 g、海藻酸鈉0.5 g、檸檬酸1 g、羧甲基纖維素鈉0.5 g、葡萄糖0.5 g、燕麥片0.5 g），調(diào)節(jié)各份培養(yǎng)基的pH值至7左右。將30個(gè)含有不同碳源的培養(yǎng)基（10個(gè)碳源液體培養(yǎng)基，3次重復(fù)）的三角瓶進(jìn)行120 ℃高溫滅菌20 min，待冷卻至室溫后加入200 μL青霉菌孢子刮取液，搖勻后封口；放入28 ℃搖床中培養(yǎng)，72 h后記錄菌球生長(zhǎng)情況。

1.2.4 黑脛病生防試驗(yàn)方法

將LYQ01菌株和病原菌分別在燕麥片平板上28 ℃活化培養(yǎng)3～5 d，備用；然后用打孔器在活化好的菌株菌絲邊緣打取圓形菌餅（直徑0.50 cm），再用接種針分別將LYQ01菌株和測(cè)試疫霉的菌餅挑至新的平板兩端，然后將培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱中于28 ℃條件下培養(yǎng)。將挑取的LYQ01菌株接種到燕麥片液體培養(yǎng)基（不加瓊脂的燕麥片培養(yǎng)基）上，于28 ℃ 條件下振蕩培養(yǎng)14 d，然后于12 000 r/min條件下離心10 min，過濾，獲得含有LYQ01菌株的發(fā)酵液上清（發(fā)酵液上清中僅為L(zhǎng)YQ01菌株的發(fā)酵產(chǎn)物）。對(duì)該發(fā)酵液上清進(jìn)行不同濃度的稀釋（1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%），添加到燕麥片固體培養(yǎng)基中，接種煙草疫霉菌絲餅，觀察煙草疫霉的生長(zhǎng)情況。煙草疫霉菌于28 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定其在1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%等不同濃度發(fā)酵液處理中菌絲的長(zhǎng)度。

用1 L的三角瓶裝200 mL蛋白胨PDA液體培養(yǎng)基，接種1 mL的108 CFU/mL孢子懸液，于 28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d；合并3瓶600 mL未過濾的、含有菌絲的液體發(fā)酵液，直接加入等量（600 mL）的乙酸乙酯，抽提3次后旋蒸，最后溶解在3 mL甲醇或者乙酸乙酯中，通過0.22 μm微孔濾膜過濾青霉菌提取液，以去除可能殘留的青霉菌孢子和其他雜菌，用作提取物的抑菌試驗(yàn)。青霉菌提取液各取50、100、500 μL，分別加入到配制好的燕麥固體培養(yǎng)基中；設(shè)置對(duì)照組，只添加500 μL的甲醇溶液，接種到燕麥固體培養(yǎng)基中。將上述培養(yǎng)基制備成固體培養(yǎng)皿，接種菌餅放至培養(yǎng)皿中心，放入培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，然后測(cè)量并記錄菌落半徑。

1.2.5 青霉菌生長(zhǎng)的pH值最低閾值的測(cè)定

培養(yǎng)基選用PDA（馬鈴薯、葡萄糖）液體培養(yǎng)基，稱取17.5 g PDA在500 mL燒杯中溶解，補(bǔ)足蒸餾水至500 mL，將其平均分裝至5個(gè)300 mL三角瓶中，再置于121 ℃下高溫滅菌20 min。用1 mol/L鹽酸溶液和1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PDA液體培養(yǎng)基的pH值，測(cè)得PDA液體培養(yǎng)基初始pH值為6.3，再利用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH值至1.5、2、3、4、5，利用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7、8、9、10、11。將配制好的培養(yǎng)基接種50 μL青霉菌原液，于28 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.6 根結(jié)線蟲滅活試驗(yàn)方法

用35 mg/mL海博PDA液體培養(yǎng)基、2.5 mg/mL索萊寶含蛋白胨PDA液體培養(yǎng)基（在PDA的基礎(chǔ)上添加蛋白胨）等2種PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)青霉菌，得到2種不同的原液。同時(shí)，將青霉菌新鮮原液以乙酸乙酯為萃取劑，經(jīng)20 min靜置萃取后取上清液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以70 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行蒸餾提取，其提取物用甲醇溶液溶解；運(yùn)用類似方法將萃取液更改為甲醇溶液，其余步驟不變，得到乙酸乙酯提取液和甲醇提取液，這2種提取液中主要提取的物質(zhì)為青霉菌的代謝產(chǎn)物，去除了絕大多數(shù)的酶，原液中則保留降解酶。為比較青霉菌與傳統(tǒng)化學(xué)制劑各自對(duì)根結(jié)線蟲的致死程度，選用對(duì)根結(jié)線蟲具有明顯抑殺作用的3 mg/mL吡啶二羧酸溶液作對(duì)照。將這5種試劑分別進(jìn)行梯度稀釋，即2種PDA溶解的青霉菌原液、吡啶二羧酸溶液原液及其2、4、8、16、32、64倍液，由于2種青霉菌提取液中青霉菌的濃度遠(yuǎn)高于原液，因此取乙酸乙酯50、100倍液。將上述原液與稀釋液各取1 mL置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，對(duì)照組為不接種青霉菌的2種PDA溶液、蒸餾水、乙酸乙酯及甲醇溶液，將上述溶液接種50頭新孵化的南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲，進(jìn)行24、48 h的死亡率觀察并記錄。1 mL無菌水和50頭新孵化的J2作為對(duì)照，3次重復(fù)，置于15 ℃下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后6、12、24、30 h，2、3、4、5、6、7、8、9、10 d記錄J2死亡數(shù)，計(jì)算J2死亡率與J2校正死亡率：校正死亡率＝（試驗(yàn)組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100%。

在體視顯微鏡下觀察處理過的J2活動(dòng)狀態(tài)和體態(tài)。結(jié)果顯示，存活的J2蟲體一般是彎曲的且可以不斷地移動(dòng)；死亡的J2蟲體一般是僵直的，將僵直的J2蟲體再次分離，置于盛有2％生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用1 mL注射器針尖輕輕撥動(dòng)J2，靜止不動(dòng)的即為死亡蟲體。

1.2.7 谷子培養(yǎng)基共培養(yǎng)試驗(yàn)

帶殼谷子加適量自來水，100 ℃煮沸至約2/3爆花為止（約40 min），利用紗布瀝干水分，分裝，高壓滅菌。在100 mL的三角瓶中，滅菌谷子裝量1/3并鋪滿底部，厚約 1 cm，設(shè)置4組試驗(yàn)，每組3個(gè)重復(fù)。其中，第1組為空白對(duì)照組（未接種滅菌谷子），第2組為接種5個(gè)直徑為0.5 cm [JP+2]的LYQ01菌餅，第3組為同時(shí)接種5個(gè)直徑為0.5 cm的疫霉和拜賴青霉菌LYQ01菌餅，第4組為只接種5個(gè)直徑為0.5 cm的疫霉菌餅，分別置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6 d。

1.2.8 青霉菌的抗生素抗性檢測(cè)

真菌中的抗性基因標(biāo)記比較少，首先選用經(jīng)常使用的潮霉素B進(jìn)行抗性檢測(cè)。由于拜賴青霉在含有蛋白胨的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，并且在不同的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)抗性不同。為了較好地控制拜賴青霉的生長(zhǎng)速度，所以選用僅有馬鈴薯淀粉和葡萄糖的海博PDA培養(yǎng)基，在這個(gè)寡營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上拜賴青霉生長(zhǎng)較慢。潮霉素B購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。潮霉素B濃度定為10、125、250、375、500 μg/mL 等5個(gè)濃度梯度。利用孢子進(jìn)行抗性試驗(yàn)，將5 mL的0.01% 吐溫-80噴于成熟的青霉PDA平板上，用1 mL槍尖吹洗后制成約 1010 CFU/mL 孢子懸液；之后利用0.01%吐溫-80溶液梯度稀釋制成10-4、10-5、10-6、10-7 孢子懸液，各取10 μL分別涂布于含有抗生素的PDA平板上，置于25 ℃進(jìn)行真菌恒溫培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次，連續(xù)觀察7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌拮抗菌的分離

利用含有煙草黑脛病疫霉屬病原菌的土壤，稀釋液涂布在PDA抗生素固體培養(yǎng)基，疫霉菌絲延伸到平板頂部。利用燕麥培養(yǎng)基雙抗平板分離，經(jīng)過4～5批次的分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)1株疑似放線菌或者真菌的綠色拮抗菌（圖1），菌株編號(hào)為L(zhǎng)YQ01，菌落與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，分泌黃褐色色素，一般色素水平與抗生物質(zhì)水平相當(dāng)，分泌色素?cái)U(kuò)散范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菌落生長(zhǎng)直徑。由于煙草疫霉等卵菌的菌株生長(zhǎng)較快，類似于蘑菇云狀，脫離培養(yǎng)基生長(zhǎng)至平板頂部，所以經(jīng)過火燒去掉表面菌絲后可明顯看到抑菌圈（圖1-D）。轉(zhuǎn)移到燕麥培養(yǎng)基后，進(jìn)一步確認(rèn)拮抗效果，在普通PDA固體培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖2所示，2種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)都不快，但是在PDA培養(yǎng)基上黃色色素圈明顯更大。

2.2 LYQ01菌株的鑒定分析

LYQ01菌株菌落的菌絲發(fā)達(dá)，但長(zhǎng)度較短，呈氈狀；分生孢子頭呈掃帚狀，分生孢子鏈狀著生，這些特征符合青霉屬的典型特征，因此確定LYQ01菌株為青霉屬菌株。經(jīng)測(cè)序，LYQ01菌株的ITS序列片段經(jīng)過NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，待測(cè)菌株LYQ01與拜賴青霉（P. bilaiae）MH1214菌株（GenBank登錄號(hào)為L(zhǎng)N901118.1）、NRRL 3391菌株（GenBank登錄號(hào)為AF033402.1）的序列匹配率為99.65%（表1）。

通過綜合分析，最終確定所篩選到的LYQ01菌株為拜賴青霉。該菌株能夠分泌大量的黃色色素，可以作為拮抗菌株繼續(xù)研究并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

隨后參照與土壤磷循環(huán)有關(guān)的拜賴青霉菌株ATCC 20851全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)（該菌株保存于美國(guó)模式培養(yǎng)物菌種庫(kù)），選定1個(gè)GH62家族的糖苷水解酶基因和1個(gè)次級(jí)代謝基因簇中P450家族的酶基因并分別設(shè)計(jì)1、3對(duì)引物，用以擴(kuò)增這個(gè)長(zhǎng)度為5 kb的基因。設(shè)計(jì)的這4對(duì)引物的擴(kuò)增長(zhǎng)度理論上分別是1 413、3 378、3 441、2 013 bp，隨機(jī)擴(kuò)增得到次級(jí)代謝產(chǎn)物合成有關(guān)基因簇的4個(gè)片段。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3所示，4個(gè)片段長(zhǎng)度分別是1.4、3.4、3.4、2.0 kb，與理論值相等。測(cè)序發(fā)現(xiàn)其總長(zhǎng)度約6 kb，經(jīng)過這幾個(gè)片段的拼裝（有些片段是重疊在一起的）后檢索，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該菌的4個(gè)片段序列與拜賴青霉菌株 ATCC 20851的相似性達(dá)到了99.9%。

2.3 LYQ01菌株對(duì)疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

將菌餅接種到不同濃度的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵液濃度的升高，煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)受到的抑制也逐漸明顯，使得菌落逐漸減小（表2）。1%發(fā)酵液的抑菌效果與未接種發(fā)酵液相比幾乎沒有差別，但當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)到5%時(shí)，抑菌效果就十分明顯。隨著LYQ01菌株發(fā)酵液濃度的增加，煙草疫霉菌的菌落直徑越來越小，當(dāng)其濃度為15%時(shí)，抑菌率超過66%。說明LYQ01菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)煙草疫霉菌菌絲伸長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用。

之后，利用乙酸乙酯提取液進(jìn)行黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果見表3。隨著青霉菌提取液添加量的增加，煙草黑脛病菌的生長(zhǎng)受到抑制，但是效果并不是特別明顯，雖然利用添加提取液可證實(shí)青霉菌對(duì)煙草黑脛病菌具有抑制作用，但是效果不如直接添加發(fā)酵液明顯（表3）。

2.4 青霉菌對(duì)根結(jié)線蟲的抑殺效果

根據(jù)文獻(xiàn)［31］可知，青霉菌發(fā)酵液中可產(chǎn)生一些抑殺根結(jié)線蟲的小分子化合物， 所以使用該菌的發(fā)酵液及乙酸乙酯提取液統(tǒng)計(jì)了根結(jié)線蟲的死亡率，結(jié)果見表4。

由表4可知，不含蛋白胨PDA發(fā)酵液原液在 24 h 時(shí)的校正死亡率僅有（3.91±4.74）%，在48 h時(shí)的校正死亡率僅有（44.01±15.55）%。而含有蛋白胨的PDA發(fā)酵液原液在24、48 h時(shí)的校正死亡率分別是（90.90±3.88）%、（93.50±1.48）%，都在90%以上。這說明培養(yǎng)基中的蛋白能促進(jìn)青霉菌株致死活性物質(zhì)的產(chǎn)生。后續(xù)利用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵真菌，檢測(cè)提取液對(duì)根結(jié)線蟲的抑殺效果。文獻(xiàn)［31］報(bào)道了吡啶二羧酸具有抑殺根結(jié)線蟲的能力，因此本試驗(yàn)以3 mg/mL吡啶二羧酸溶液作為參照。吡啶二羧酸在經(jīng)過4倍稀釋后對(duì)根結(jié)線蟲的抑殺率為（77.89±8.62）%，但是進(jìn)一步稀釋為8倍即濃度為375 mg/L時(shí)，抑殺率僅為（7.19±7.75）%，這達(dá)不到一般農(nóng)藥的致死濃度的要求。發(fā)酵液經(jīng)過乙酸乙酯抽提后，去除了發(fā)酵液中各種酶的影響，經(jīng)過50倍稀釋后抑殺率僅為（6.65±2.44）%，經(jīng)過100倍稀釋后抑殺率為（2.15±1.38）%，沒有達(dá)到理想的抑殺濃度。

2.5 幾種單糖等對(duì)青霉菌生長(zhǎng)的影響

青霉菌能降解各種復(fù)雜的有機(jī)質(zhì)，同時(shí)分泌各種降解有機(jī)質(zhì)的酶類，這些酶類可能對(duì)病原菌或者根結(jié)線蟲具有抑殺作用。所以，為了后續(xù)鑒定可能的酶類在拮抗或者抑殺病原物的作用，筆者利用幾種單糖和復(fù)雜有機(jī)質(zhì)分析該青霉菌對(duì)碳源的利用情況。培養(yǎng)后72 h，觀察含不同碳源培養(yǎng)基內(nèi)青霉菌的生長(zhǎng)情況，記錄并比對(duì)各菌球體積、密度、培養(yǎng)基透明度等數(shù)據(jù)。

1 g/100 mL木糖與0.5 g/100 mL燕麥片試驗(yàn)組中的青霉菌在所選碳源中長(zhǎng)勢(shì)最好，木糖培養(yǎng)基中的菌球體積是所測(cè)試驗(yàn)組中最大的，生長(zhǎng)密度中等；燕麥片培養(yǎng)基中的青霉菌生長(zhǎng)密度最大，菌球體積中等。綜上，青霉菌在木糖培養(yǎng)基中的綜合生長(zhǎng)情況最佳。

0.5、1 g/100 mL葡萄糖和1 g/100 mL果糖試驗(yàn)組中的青霉菌長(zhǎng)勢(shì)較好，總體生長(zhǎng)情況次于木糖培養(yǎng)基與燕麥片培養(yǎng)基，葡萄糖培養(yǎng)基中的菌株生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于果糖培養(yǎng)基，而濃度為1 g/100 mL的葡萄糖培養(yǎng)基中的青霉菌長(zhǎng)勢(shì)又優(yōu)于濃度為 0.5 g/100 mL 的葡萄糖培養(yǎng)基。1 g/100 mL普魯蘭培養(yǎng)基、0.5 g/100 mL海藻酸培養(yǎng)基、1 g/100 mL 檸檬酸培養(yǎng)基及0.5 g/100 mL羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基內(nèi)青霉菌的生長(zhǎng)狀況較差，海藻酸培養(yǎng)基內(nèi)有少量絮狀菌絲，其余3種碳源培養(yǎng)基內(nèi)無明顯生長(zhǎng)，說明在短期培養(yǎng)中，這4種物質(zhì)被青霉菌吸收、分解、利用的效率低、速度慢，不適合作為青霉菌培養(yǎng)的碳源。后續(xù)又對(duì)檸檬酸、普魯蘭、海藻酸鈉以及羧甲基培養(yǎng)基再次進(jìn)行72 h培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)后檸檬酸培養(yǎng)基內(nèi)青霉菌生長(zhǎng)良好，菌球體積小，培養(yǎng)基無色透明，菌落密度較大；海藻酸鈉培養(yǎng)基內(nèi)有少量絮狀菌漂浮，溶液無色透明；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基內(nèi)菌球密度與體積較小，培養(yǎng)基無色透明；普魯蘭培養(yǎng)基內(nèi)仍無明顯的菌落生長(zhǎng)（圖4上）。

通過培養(yǎng)比對(duì)，判定木糖與燕麥片最適合作為青霉菌生長(zhǎng)的碳源，其次是葡萄糖與果糖，其中 1 g/100 mL 葡萄糖比0.5 g/100 mL葡萄糖更有利于青霉菌的繁殖，海藻酸、普魯蘭、羧甲基纖維素鈉及檸檬酸培養(yǎng)基在72 h內(nèi)未見明顯的菌落生長(zhǎng)，說明青霉菌對(duì)此類碳源降解速率慢，因此不適合作為培養(yǎng)青霉菌的碳源。

2.6 青霉菌生長(zhǎng)的pH值最低閾值

經(jīng)培養(yǎng)后觀察各培養(yǎng)基中青霉菌的生長(zhǎng)狀態(tài)并記錄，再通過濾網(wǎng)過濾，用分析天平稱取各組青霉菌濕重并進(jìn)行具體比較，判斷適宜青霉菌能夠生長(zhǎng)的pH值最低閾值。將后3組培養(yǎng)基（pH值為1、1.5、2）再次進(jìn)行28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，同時(shí)連續(xù)觀測(cè)6 d，結(jié)果顯示，3組培養(yǎng)基內(nèi)仍無明顯菌落生長(zhǎng)，因此可驗(yàn)證青霉菌的最低生長(zhǎng)pH值約為2.5（圖4下）。由于青霉菌的生物菌劑在實(shí)際處理中更多地應(yīng)用于酸性環(huán)境，因此測(cè)定其最高承酸閾值更有實(shí)際參考價(jià)值。

2.7 青霉菌遺傳操作所用抗生素及其濃度篩選

目前，真菌中可用的抗生素遺傳標(biāo)記比較少，使用最多的就是潮霉素B，所以直接選擇潮霉素B來檢測(cè)該菌對(duì)于潮霉素的抗性并且篩選濃度范圍。在海博PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后48 h，觀察到在 125 μg/mL 平板10-4稀釋度區(qū)域還有菌落長(zhǎng)出，但是在250 μg/mL的濃度下已經(jīng)沒有菌落長(zhǎng)出了（圖5-a）。培養(yǎng)5 d后，不管哪個(gè)濃度還是會(huì)長(zhǎng)出青霉菌的菌落，說明長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，青霉菌對(duì)潮霉素抗性反而失效了（圖5-b）。

2.8 谷子培養(yǎng)基中的病原菌與拮抗菌共培養(yǎng)生長(zhǎng)結(jié)果

為了解青霉菌的煙草疫霉拮抗機(jī)理，利用谷子培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果見圖6。共培養(yǎng)后 5 d，第2組LYQ01菌絲生長(zhǎng)，但沒有向四周擴(kuò)散，不是很旺盛，沒有從基質(zhì)內(nèi)向外伸展；第4組疫霉菌絲生長(zhǎng)特別旺盛并向四周擴(kuò)散，完全蓋住了基質(zhì)；同時(shí)接種了2種菌的第3組中沒有看到白色的疫霉病原菌菌絲，而是長(zhǎng)滿了墨綠色的LYQ01菌絲和孢子。說明在有病原菌接種的前提下，可以激發(fā)拮抗菌的生長(zhǎng)，阻止病原菌的增殖作用（圖6-C）。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從發(fā)病區(qū)域的健康煙草植株根際土中篩選出1株抑制病原菌的真菌，利用18S和5.8S之間的ITS序列引物擴(kuò)增測(cè)序方法鑒定為拜賴青霉，與已測(cè)序的拜賴青霉比對(duì)，則進(jìn)一步確定其即為拜賴青霉。篩選出的青霉菌對(duì)煙草黑脛病菌有明顯的抑制作用，它對(duì)煙草黑脛病菌起抑殺作用的物質(zhì)主要是揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及幾丁質(zhì)水解酶，對(duì)根結(jié)線蟲起抑殺作用的物質(zhì)主要為多種可被乙酸乙酯或甲醇等有機(jī)試劑提取的代謝產(chǎn)物。通過改變單一變量，分析青霉菌對(duì)碳源的利用情況，結(jié)果顯示利用效果最佳的碳源為木糖與燕麥片，其次為葡萄糖和果糖。拜賴青霉的酸性pH值閾值在2.5左右，為青霉菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了便利，有效防止雜菌的污染，提高生產(chǎn)效率。最后，利用潮霉素B確定了該拜賴青霉的抗性濃度范圍，為進(jìn)一步進(jìn)行遺傳操作奠定了基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目：廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技計(jì)劃（編號(hào)：2022450000340066）。

作者簡(jiǎn)介：曾祥難（1978—），男，廣西來賓人，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事煙草栽培及質(zhì)量管理研究。E-mail：513655538@qq.com。

通信作者：韋建玉，博士，研究員，主要從事煙草栽培技術(shù)、煙葉質(zhì)量研究。E-mail：jtx_wjy@163.com。