微生物菌肥對龍腦型陰香根際輕基質(zhì)中微生物多樣性及功能的影響

摘要：以2年生龍腦型陰香（Cinnamomum burmannii）輕基質(zhì)苗為對象，采用微生物菌肥分別處理3、6個月，用16S測序技術(shù)、qPCR芯片技術(shù)研究輕基質(zhì)微生物群落結(jié)構(gòu)和輕基質(zhì)碳、氮、磷、硫相關(guān)功能基因表達量的變化。結(jié)果表明，施用菌肥3個月后可顯著提升陰香根際土壤微生物中某些細菌（如疣微菌門、擬桿菌門、髕骨細菌門、綠彎菌門）的相對豐度；施用菌肥6個月后可顯著提高變形菌門、酸桿菌門的相對豐度。qPCR芯片分析結(jié)果表明，施用菌肥前后碳固定、氮循環(huán)和磷循環(huán)相關(guān)基因的相對表達量顯著提升。綜上，微生物菌肥的施用能改變龍腦型陰香根際輕基質(zhì)微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能，顯著提高龍腦型陰香根際輕基質(zhì)氮、磷、碳相關(guān)功能基因的相對豐度，促進輕基質(zhì)氮、磷、碳元素的利用，從而為陰香苗的培育提供新思路和理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：陰香；微生物菌肥；α多樣性；土壤；功能基因；表達量；qPCR芯片分析

中圖分類號：S144；S792.23 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0252-11

陰香［Cinnamomum burmannii （Nees et T.Nees） Blume］是樟科樟屬樹種，在我國南方地區(qū)和東南亞地區(qū)均有分布，具有觀賞、用材和藥用等諸多價值［1］。龍腦型陰香別稱梅片樹，其枝葉中富含右旋龍腦［2］。右旋龍腦的藥理功能豐富，具有消炎除腫、消炎止痛等作用［3-5］。研究發(fā)現(xiàn)，右旋龍腦能預(yù)防血栓的生成［6-7］，對心腦血管疾病的治療有顯著效果［5，8-12］。目前，國內(nèi)天然冰片的年產(chǎn)量遠不能滿足市場需求［13］，市面上多用人工合成龍冰片，但人工合成冰片易產(chǎn)生大量有毒的異龍腦［14］，長期服用對人體危害嚴(yán)重，因而大面積推廣龍腦型陰香的種植有助于提高我國天然冰片的產(chǎn)量，從而減少人工合成冰片的使用。

龍腦型陰香的大規(guī)模擴繁種植離不開化肥的施用，而大量化肥的施用易導(dǎo)致土壤板結(jié)、重金屬富集和土壤微生物群落失衡等問題，從而降低土壤對生態(tài)系統(tǒng)的有益調(diào)控，降低植物的采收產(chǎn)量，影響林業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展［15］。微生物菌肥是含有特定微生物活體且可通過微生物活動使農(nóng)作物獲得肥效的綠色肥料，近年來在經(jīng)濟作物栽培中得到廣泛應(yīng)用，可以通過促進有益微生物增殖、改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等途徑改善土壤及作物根際環(huán)境，從而促進作物生長并提高作物品質(zhì)、提升作物產(chǎn)量［16-18］。有研究發(fā)現(xiàn)，使用菌肥能顯著提高林木根際土壤微生物的多樣性［19-20］，提高土壤中氮（N）、磷（P）和鉀（K）的含量及植物的生物量［21-24］。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽性菌，其分泌物如抗菌蛋白、酚類等物質(zhì)具有抑制病原真菌的功效［25-26］。有研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌在土壤中參與溶磷、固氮等過程［27-28］。除枯草芽孢桿菌外，解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）可有效抑制植物的病原真菌、細菌、病毒，并能防御線蟲的侵?jǐn)_，具備誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗菌、抗病毒和抗蟲的能力，從而減少植物病蟲害的發(fā)生［16］。林斌等研究發(fā)現(xiàn)，施用解淀粉芽孢桿菌W208YF可顯著改善土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，促進植物對氮、磷、鉀及土壤營養(yǎng)的有效吸收［29］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌對玉米、小麥、番茄、西瓜等均有良好的促生作用［30］。雖然菌肥在農(nóng)業(yè)種植領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但在林木育種中的應(yīng)用仍較少。因此，本研究以用輕基質(zhì)培育的陰香幼苗為材料，施用以枯草芽孢桿菌為主、解淀粉芽孢桿菌為輔的復(fù)合菌肥，通過田間試驗研究該復(fù)合菌肥對陰香根際土壤微生物群落、輕基質(zhì)肥力的影響，以期為陰香苗擴繁栽培生產(chǎn)應(yīng)用提供新思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陰香根際輕基質(zhì)培育和樣本收集

田間試驗于2021年5—11月在廣東省林業(yè)科學(xué)研究院后山苗圃（113.385 68°E，23.202 18°N）開展，選取30株長勢一致、高度為60～80 cm的2年生陰香實生苗為試驗材料，將其培養(yǎng)于輕基質(zhì)中（輕基質(zhì)配方：70%～78%泥炭土、3%～10%椰糠、4%～9%珍珠巖、3%～5%磷肥、3%～8%黃泥、3%～6%火燒土）［31］。隨機選取未施肥的10株陰香，并以其根際輕基質(zhì)作為對照（CK，5月），剩余陰香植株均施以菌肥，分別在施肥3個月后（處理1，8月）和6個月后（處理2，11月）隨機選擇10株陰香根際輕基質(zhì)作為樣本。菌肥采用根力多微生物菌劑（含枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌），菌肥中含有效活菌數(shù)≥2億CFU/g，有機質(zhì)含量≥65%，黃腐酸鉀含量≥50%（產(chǎn)品登記號：微生物肥2016準(zhǔn)字1943號）。根據(jù)菌肥產(chǎn)品說明，每半個月對陰香苗進行施肥，每個植株施用的菌肥量為1 g，施肥后澆水。對照、各處理的樣本選取根系附著的輕基質(zhì)，混合后選擇3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)設(shè)2 g輕基質(zhì)，分別裝入無菌密封袋中，于-80 ℃保存用于后續(xù)相關(guān)試驗。

1.2 輕基質(zhì)微生物的高通量測序

用土壤基因組DNA提取試劑盒（ALFA-SEQ Advanced Soil DNA Kit，方舟生物安全科技廣州有限公司）提取輕基質(zhì)中微生物的總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳NanoDropOne檢測DNA的完整度、純度及濃度。用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對抽提的DNA進行PCR擴增。按照 NEBNext UltraTMⅡDNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs，美國）的步驟進行建庫操作。用Illumina Nova 6000 平臺對擴增子的文庫進行 PE250 測序（廣東美格基因科技有限公司）。

1.3 微生物qPCR芯片檢測

獲得土壤樣品后，用DNA試劑盒（ALFA-SEQ Advanced Soil DNA Kit，方舟生物安全科技廣州有限公司）對樣品DNA進行提取。提取完成后，用Qubit 4.0（Thermo Fisher Scientific，Waltham，美國）儀器對DNA總量及純度進行檢測，確保DNA濃度統(tǒng)一稀釋為 20 ng/μL。將檢測合格的DNA樣品添加至384孔板的樣品板中，同時將引物（表1）和qPCR所用試劑添加至另一384 孔板中作為引物板。qPCR的條件是：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；4 ℃保存。分別將樣品板、引物板試劑添加至高通量qPCR芯（SmartChip MyDesign Chip）的微孔中，在SmartChip Real-Time PCR System（WaferGen Biosystems，美國）中進行qPCR 反應(yīng)及熒光信號檢測，并生成擴增曲線、熔解曲線。用SmartChip Real-Time PCR System（WaferGen Biosystems，美國）和Canco software v4.5軟件獲得各基因在各樣本中的熒光閾值，進行質(zhì)控，質(zhì)控條件如下：（1）當(dāng)擴增效率<1.8或>2.2時，舍去該基因；（2）當(dāng)陰性對照有擴增時，舍去該基因；（3）當(dāng)CT（C表示循環(huán)數(shù)；T表示循環(huán)閾值）值大于31時，則舍去該基因在對應(yīng)樣本中的CT值。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

用fastp（v 0.14.1，https：//github.com/OpenGene/fastp）分別對雙端原始序列數(shù)據(jù)進行滑窗質(zhì)量剪裁（滑動窗口大小為4，平均質(zhì)量值為20）。用Cutadapt 軟件（https：//github.com/marcelm/cutadapt/）去除引物，得到質(zhì)控后的雙端測序數(shù)據(jù)，對于雙端測序數(shù)據(jù)，根據(jù)雙向測序數(shù)據(jù)之間的重疊關(guān)系，用usearch-fastq_mergepairs（v10，http：//www.drive5.com/usearch/）預(yù)設(shè)最小重疊長度為 16 bp，拼接序列的重疊區(qū)允許的最大錯配為 5 bp，過濾不符合條件的序列，獲得原始拼接序列（raw tags）。得到有效拼接片段（clean tags）后，基于Usearch（v 10.0.240）平臺，在97.0%的相似度水平下進行聚類，獲得分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）［33］。用UPARSE聚類法對3個樣本（對照、施肥3個月和施肥6個月）的OTU進行統(tǒng)計劃分并用VennDiagram軟件繪韋恩（Venn）圖［33-34］。以16S細菌數(shù)據(jù)庫SILVA為參考數(shù)據(jù)庫，使用樸素貝葉斯分類器對序列進行分類學(xué)注釋，得到序列物種分類信息（設(shè)定置信度閾值為0.8），進而在不同分類水平上分析群落結(jié)構(gòu)。去除注釋為葉綠體或線粒體（16S 擴增子）及不能注釋到界級別的OTU及其序列（tags），得到各樣品最終用于分析的有效序列數(shù)及 OTU 分類學(xué)綜合信息表?；?OTU 的豐度表，用usearch-alpha_div（v10，http：//www.drive5.com/usearch）進行多樣性指數(shù)（ACE值、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)）的計算，再用R語言工具繪制群落結(jié)構(gòu)圖。使用STAMP中的Fisher小樣本檢驗方法進行兩兩樣本間的差異顯著性檢驗，對不同組間進行兩兩t檢驗，P<0.05表示差異顯著［35］。通過KEGG代謝途徑的組成及差異分析觀測不同處理間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化。文中α多樣性的數(shù)據(jù)用Excel 2010、DPS 7.05軟件進行處理和分析，通過Tukey法對不同處理下的α多樣性進行顯著性分析和多重比較［36］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌肥施用對陰香根際輕基質(zhì)OTU數(shù)量變化的影響

在對照、施肥后3個月和施肥后6個月陰香處理組輕基質(zhì)樣本中共檢測出7 843個OTU，各處理間共有的OTU數(shù)為1 069個，占OTU總數(shù)的13.63%（圖1）。對照組特有的OTU數(shù)為1 025個（占比為13.07%）；施肥3個月后，陰香根際輕基質(zhì)特有的OTU數(shù)為2 140個（占比為27.29%），與對照組相比，提高了108.8%；施肥6個月后，陰香根際輕基質(zhì)特有的OTU數(shù)為2 605個（占比為33.21%），與對照組相比提高了154.1%。與對照相比，隨著處理時間的增長，施用菌肥可提高陰香根際輕基質(zhì)中特有的OTU數(shù)，說明施肥后陰香根際輕基質(zhì)中的OTU數(shù)量變化較大。

2.2 菌肥施用對陰香根際輕基質(zhì)微生物α多樣性的影響

α多樣性是反映一個區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)豐富度、均勻度的指標(biāo)。α多樣性主要由種類數(shù)量（即豐富度）和群落中個體的均勻性（即多樣性）來衡量。物種豐富度（community richness）指數(shù)包括Chao1值、ACE值等，Chao1、ACE值越大表示豐富度越高［37-38］；群落多樣性（community diversity）的指數(shù)包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，Shannon指數(shù)越高，表明群落的多樣性越高，相反，Simpson 指數(shù)越大，說明群落的多樣性越低［39-40］。如表2所示，與對照相比，施用菌肥3、6個月后陰香根際輕基質(zhì)微生物的Chao1值顯著上升，在施肥6個月后ACE值也顯著上升，說明施用菌肥有助于提高陰香根際輕基質(zhì)的微生物數(shù)量。與對照相比，施肥后3個月后陰香根際輕基質(zhì)的Simpson指數(shù)明顯下降，且施肥6個月后陰香根際輕基質(zhì)的Simpson指數(shù)最低；與對照相比，施用菌肥后的Shannon指數(shù)顯著提高，施用菌肥6個月后的Shannon指數(shù)最高，表明施用菌肥可提高陰香根際輕基質(zhì)的微生物多樣性。

2.3 菌肥施用對陰香根際輕基質(zhì)群落結(jié)構(gòu)的影響

在陰香根際輕基質(zhì)的對照組中，優(yōu)勢菌落門（相對豐度大于0.05）為變形菌門（Proteobacteria，相對豐度為0.41）、酸桿菌門（Acidobacteria，0.14）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.09）、髕骨細菌門（Patescibacteria，0.79）、放線菌門（Actinobacteria，0.09）、綠彎菌門（Chloroflexi，0.06）、裝甲菌門（Armatimonadetes，0.05）（圖2）。與對照相比，處理1（施肥3個月）相對豐度提高的菌門為芽單胞菌門（提高了172.73%）、髕骨細菌門（83.75%）、疣微菌門（56.80 %）、綠彎菌門（54.10%）、擬桿菌門3.19%）；相對豐度下降較明顯的細菌門為裝甲菌門（下降了57.41%）、酸桿菌門（35.46%）、放線菌門（29.03%）、變形菌門（14.60%）。與對照相比，處理2（施肥6個月）中相對豐度提升的細菌有變形菌門（提升了29.44%）、酸桿菌門（30.50%）；相對豐度下降的細菌門有擬桿菌門（下降了51.06%）、放線菌門（36.67%）、髕骨細菌門（95.57%）、綠彎菌門（14.88%）、裝甲菌門（47.81%）。與處理1相比，處理2中相對豐度提高的細菌有疣微菌門（提高了145.00%）、酸桿菌門（102.20%）、變形菌門（51.57%）；相對豐度下降的細菌門有髕骨細菌門（下降了97.28%）、擬桿菌門（52.57%）、綠彎菌門（45.21%）、放線菌門（36.36%）。施用菌肥后疣微菌門的相對豐度持續(xù)增加，而變形菌門、酸桿菌門的相對豐度呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢；施用菌肥后相對豐度持續(xù)降低的細菌門有裝甲菌門、放線菌門，而擬桿菌門、綠彎菌門、髕骨細菌門的相對豐度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

與對照相比，施用菌肥3個月后Micropepsaceae、黃色單胞菌科（Xanthobacteraceae）、土圈菌科（Pedosphaeraceae）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）、亞硝化單胞菌科（Nitrosomonadaceae）的相對豐度均有所升高，提高幅度分別為43.62%、56.20%、173.85%、54.08%（圖3），而紅細菌科（Rhodanobacteraceae）、酸熱菌科（Acidothermaceae）、酸桿菌科亞組1（Acidobacteriaceae_subgroup_1）、纖毛單胞菌科（Fimbriimonadaceae）的相對豐度有所下降，降幅分別為85.21%、82.30%、70.54%、94.77%。施肥6個月后，與對照相比，相對豐度提高的科有黃色單胞菌科（提高327.98%）、土圈菌（提高303.31%）、亞硝化單胞菌科（提高736.73%），而相對豐度下降的科、屬有紅細菌科（下降85.21%）、酸熱菌科（下降82.30%）、酸桿菌科亞組1（下降70.54%）以及纖毛單胞菌科（下降94.77%）。與施肥3個月相比，施肥6個月能提高亞硝化單胞菌科、黃色單胞菌科、土圈菌的相對豐度，提高幅度分別為440.40%、197.13%、158.20%（圖3）。說明施用菌肥6個月可持續(xù)提高亞硝化單胞菌科、黃色單胞菌科和土圈菌的相對豐度并持續(xù)降低紅細菌科、酸熱菌科、酸桿菌科亞組1細菌的相對豐度。

2.4 土壤微生物群落基因功能分析

施用菌肥3個月后，陰香根際輕基質(zhì)的碳降解相關(guān)基因拷貝數(shù)從3.59×104上升到1.11×106，增長了3 007%（圖4）；碳固定相關(guān)基因拷貝數(shù)從 1.86×105上升到4.08×106，增長了2 095%；氮循環(huán)相關(guān)基因拷貝數(shù)從1.18×105上升到5.48×106，增長了4 527%；磷循環(huán)相關(guān)基因拷貝數(shù)從2.81×104上升到1.39×106，增長了4 856%。施肥6個月后，碳降解相關(guān)基因拷貝數(shù)從3.59×104上升到1.69×106，增長了4 605%：其中碳固定相關(guān)基因拷貝數(shù)從1.86×105上升到7.57×106，增長了 3 979%；氮循環(huán)相關(guān)基因拷貝數(shù)從1.18×105上升到1.50×107，增長了12 928%；磷循環(huán)相關(guān)基因拷貝數(shù)從2.81×104上升到3.66×106，增長了 12 928%。與施肥3個月相比，施肥6個月后，碳降解相關(guān)基因拷貝數(shù)從1.11×106上升到1.69×106，增長了51.43%；碳固定相關(guān)基因拷貝數(shù)從4.08×106上升到7.57×106，增長了85.83%；氮循環(huán)相關(guān)基因拷貝數(shù)從5.48×106上升到1.50×107，增長了173.51%；磷循環(huán)相關(guān)基因拷貝數(shù)從1.39×106上升到3.66×106，增長了162.86%。由此可見，施用菌肥后微生物群體的碳代謝、碳固定、氮循環(huán)和磷循環(huán)的相關(guān)基因的數(shù)量獲得了顯著增長。

2.5 高表達功能基因的篩選

在輕基質(zhì)微生物群落的諸多與碳、氮、磷、硫功能相關(guān)的基因中，acsA、rbcL、abfA、gdhA、phnK、cax、gcd、sga、pccA、nirS1、ureC、phoD、pqqC、accA、nirS2、xylA、apsA的表達量在施用菌肥3、6個月后均獲得到顯著提升，而smtA、manB、pmoA、korA、amoA1、mct、nirK3、yedZ、nosZ1、acsE的表達量在施用微生物菌肥3個月后雖得到顯著增加，但在施用微生物菌肥6個月后又逐漸減少（圖5）。盡管如此，上述基因在施用菌肥6個月后的表達量仍高于對照。由此可見，施用菌肥可提升陰香根際輕基質(zhì)微生物群體中有關(guān)碳氮磷硫功能基因的表達量，促進輕基質(zhì)中微生物對氮磷鉀的代謝。

3 討論

3.1 施用微生物菌肥對陰香根際輕基質(zhì)微生物細菌群落的影響

根際微生物作為植物根際環(huán)境的重要組成部分，是衡量土壤肥力、土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)［43］，在維持土壤結(jié)構(gòu)、促進有機質(zhì)分解和積累、促進養(yǎng)分循環(huán)、維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要作用［41-42］。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物的多樣性越高，土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)越復(fù)雜，功能就越穩(wěn)定［44］。細菌不僅是土壤中數(shù)量最多、類群最大的微生物，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，而且具有豐富的遺傳多樣性和基因功能，能有效促進土壤有機物的分解和轉(zhuǎn)化，參與碳、氮等營養(yǎng)循環(huán)過程［45-47］。微生物菌肥正是利用有益微生物的特性和優(yōu)點對土壤中的微生物結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，從而達到促進植物生長、提高土壤肥力等效果，最終提高土壤重要營養(yǎng)元素有效性的功能［48］及土壤肥力和肥料利用率，并改善土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)［49-51］。本研究施用的微生物菌肥以枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為主。有研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的施用改變了煙草根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加了變形菌門數(shù)量，降低了浮霉菌門、厚壁菌門的數(shù)量［18］。同樣在煙草種植中發(fā)現(xiàn)，施用枯草芽孢桿菌Tpb55后，煙草土壤根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，酸桿菌門、變形菌門的豐度提高，放線菌門的豐度降低［52］。解淀粉芽孢桿菌同屬于芽孢桿菌屬，能在植物根際定植并在脅迫條件下生長，可促進植物生長，被認(rèn)為是無毒且生態(tài)友好的綠色肥料［53］，被廣泛用于水稻、西瓜和煙草栽培中［54-56］。在本研究中，施用菌肥后，變形菌門、酸桿菌門的相對豐度同樣得到提高，持續(xù)降低了放線菌門的相對豐度。也有研究發(fā)現(xiàn)，施用枯草芽孢桿菌后，苜蓿根際土壤中變形菌門的數(shù)量減少，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門的數(shù)量增加［57］。

在本研究中，與對照相比，施用菌肥顯著提高了陰香根際輕基質(zhì)的微生物多樣性，并且施肥6個月后的陰香根際輕基質(zhì)微生物多樣性更高。在門水平下，陰香根際輕基質(zhì)的主要優(yōu)勢細菌門為變形菌門、酸桿菌門、髕骨細菌門、放線菌門以及綠彎菌門等，這些菌群在其他作物土壤中也作為優(yōu)勢種群存在［44-46］。其中，綠彎菌門對不利環(huán)境適應(yīng)性強，可忍受極端的土壤環(huán)境并與其他生物競爭活性碳［58］，具有較強的競爭力［59］；而疣微菌門是參與土壤氮循環(huán)的主要微生物類群［60］，疣微菌門中存在多種多樣、連接稀疏的非核糖體肽合成酶系統(tǒng)，其基因簇中有合成抗生素的作用［52］。在本研究中，施用菌肥3個月后能提高綠彎菌門和疣微菌門的相對豐度；施用菌肥6個月能進一步提高疣微菌門的相對豐度，此外還提高了變形菌門、和酸桿菌門的相對豐度。變形菌門是一種富營養(yǎng)菌群，可在養(yǎng)分條件豐富的土壤環(huán)境中迅速生長繁殖，對土壤養(yǎng)分循環(huán)發(fā)揮重要作用［61］，有助于脂質(zhì)多糖生物合成、細菌運動性和碳代謝［62］；酸桿菌門大多數(shù)屬于代謝物轉(zhuǎn)運家族具有大量的編碼轉(zhuǎn)運蛋白基因［63］，可以產(chǎn)生多種代謝物，分解難降解物質(zhì)，參與鐵循環(huán)、單碳化合物代謝、光合作用以及在氮循環(huán)中起到還原硝酸鹽、亞硝酸鹽的作用，可能還有還原一氧化氮的作用，從而提高土壤肥力［64-67］。研究表明，酸桿菌門能在復(fù)雜環(huán)境中及寡營養(yǎng)條件下生存適應(yīng)［68］。由此推測施用菌肥可對陰香根際輕基質(zhì)的種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生積極效應(yīng)，增強碳、氮和磷的循環(huán)，提高氮、磷的有效性，有利于植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

3.2 施用微生物菌肥對陰香根際土壤功能基因數(shù)量的影響

微生物在土壤氮磷周轉(zhuǎn)中起重要作用，直接影響土壤養(yǎng)分含量和有效性。在自然界中，微生物形成了復(fù)雜的氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)。土壤中的大部分有機氮都不能直接被植物吸收利用，必須在微生物的作用下分解才能被植物吸收利用［69］。微生物可以通過氮的固定、氨化、硝化、反硝化和異化性硝酸鹽還原等過程調(diào)節(jié)氮的生物有效性，影響土壤中植物可利用氮的形式［70］。微生物在固氮酶的催化作用下，將空氣中的氮氣還原成氨，從而完成固氮。脲酶（ureC）可以分解土壤中的尿素并轉(zhuǎn)化成氨，供植物吸收。在本研究中，施用菌肥后可持續(xù)增加脲酶（ureC）的拷貝數(shù)，土壤中的銨態(tài)氮在氨單加氧酶（amoA1）的作用下被氧化成羥胺，再由羥胺氧化還原酶氧化為亞硝酸鹽。有研究表明亞硝化單胞菌科細菌是氨氧化的關(guān)鍵菌［71］，在本研究中施用菌肥后，可持續(xù)提高亞硝化單胞菌科細菌的相對豐度，推測亞硝化單胞菌科相對豐度的增加可促進陰香根際輕基質(zhì)微生物群落的氨氧化，以此來促進陰香根際輕基質(zhì)中氮的硝化，在本研究中也觀察到施用菌肥后陰香基質(zhì)中氨單加氧酶（amoA1）的表達量有所提高。除此之外，亞硝酸鹽氧化還原酶（nxr）是將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽完成硝化作用的重要酶［72］；硝酸鹽由硝酸鹽還原酶（nirK3、nirS1、nirS2）還原成亞硝酸鹽后再由亞硝酸還原酶進一步將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氨或一氧化氮［70］，經(jīng)過微生物的驅(qū)動將植物無法吸收的有機氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮等植物可以直接吸收利用的無機氮。在本研究中觀察到綠彎菌門屬于陰香基質(zhì)中的優(yōu)勢菌門（相對豐度0.06），相比對照，施用菌肥3個月后顯著提高了綠彎菌門的相對豐度，而綠彎菌門細菌具有亞硝酸鹽氧化還原酶（nxr）［73］，本研究中也觀察到施用菌肥后，nirK3、nirS1、nirS2的表達量顯著提高，因而推測綠彎菌門細菌也可促進陰香根際輕基質(zhì)中氮的硝化，與亞硝化單胞菌科細菌協(xié)同提高氮的生物有效性。

土壤中的磷循環(huán)也需要微生物的參與，土壤中很大部分的磷是無法被植物獲取的有機態(tài)磷、無機態(tài)磷［74］。微生物分泌的一部分胞外酶如磷酸酶（sga、phoD）、植酸酶等可以分解土壤中的有機磷，從而使植物獲取更多的無機磷［75］。芽孢桿菌成員能夠分泌磷酸酶、固氮酶和有機酸，通過將氮、磷的復(fù)雜形態(tài)轉(zhuǎn)化為更簡單或者現(xiàn)有的形態(tài)。在本研究中，與對照相比，施用生物菌肥3個月后顯著提高了芽單胞菌科細菌的相對豐度，堿性磷酸酶（phoD）、磷酸脫羧酶（sga）等相關(guān)酶的表達量也顯著提高，從而將復(fù)雜形態(tài)的氮磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收的形態(tài)，提高了磷、氮等必需營養(yǎng)元素的有效性［76-77］。土壤碳循環(huán)包括植物通過呼吸作用向外釋放二氧化碳、植物對土壤養(yǎng)分的吸收、植物殘體有機質(zhì)的分解、微生物殘體對土壤碳源的輸送和厭氧環(huán)境下通過分解作用向外釋放甲烷等過程［78］。土壤微生物也同樣參與了碳的循環(huán)，土壤微生物通過各種代謝功能產(chǎn)生的酶來實現(xiàn)碳的固定、轉(zhuǎn)化和排放。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物主要通過還原性戊糖磷酸循環(huán)（卡爾文循環(huán)）、還原性檸檬酸循環(huán)（rTCA循環(huán)）、羥基丙酸-羥基丁酸循環(huán)（3-HP/4-HB循環(huán)）、二羧酸-羥基丁酸循環(huán)（DC/4-HB循環(huán)）、3-羥基丙酸雙循環(huán)（3-HP循環(huán)）和還原性乙酰輔酶A途徑6個途徑將土壤中的無機碳轉(zhuǎn)化為有機物［79-80］。還有研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門參與土壤的碳循環(huán)［81］，且酸桿菌門、變形菌門中可能含有大量與碳氮磷循環(huán)過程相關(guān)的功能基因［82-84］。本研究在施用菌肥后，變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門細菌的相對豐度提高，推動了基質(zhì)的碳循環(huán)。

4 結(jié)論

本研究在施用微生物菌肥后，陰香根際基質(zhì)微生物的豐富度和多樣性提高，陰香根際基質(zhì)的微生物群落結(jié)構(gòu)得到改變，而微生物具有豐富的遺傳信息和功能基因，施用微生物菌肥后提升了陰香根際土壤微生物中某些細菌如變形菌門、酸桿菌門、疣微菌門、擬桿菌門、髕骨細菌門、綠彎菌門的相對豐度，從而提升了與碳、氮、磷相關(guān)功能基因的表達，促進了碳、氮和磷的循環(huán)，提高了氮、磷的有效性，有利于植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。上述分析結(jié)果顯示，施用微生物菌肥可以改變陰香根際微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而促進微生物和植物之間的相互作用，促使陰香對基質(zhì)營養(yǎng)元素的有效利用。

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基金項目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（編號：2022KJCX006）。

作者簡介：江穎超（1998—），男，江西寧都人，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：1251876369@qq.com。

通信作者：侯 晨，博士，副研究員，主要從事木本精油樹種的遺傳育種研究。E-mail：houchen@sinogaf.cn。