ATG14調(diào)控家兔毛囊毛乳頭細胞自噬進程的功能探究

摘 要： 旨在探究自噬相關蛋白14（autophagy-related protein 14，ATG14）調(diào)控家兔毛囊毛乳頭細胞（dermal papilla cells，DPCs）自噬進程對毛囊發(fā)育生長的影響。本試驗選取健康6月齡長毛兔，采集背部皮膚分離培養(yǎng)DPCs，通過克隆ATG14基因的編碼序列（coding sequence，CDS），利用生物信息學對ATG14的生物學特性進行初步分析，在家兔DPCs中過表達或敲減ATG14對自噬相關蛋白和毛囊生長發(fā)育相關基因的表達及DPCs增殖水平的影響進行探究。結果表明，ATG14基因CDS長度為1 479 bp，共編碼492個氨基酸，不存在潛在信號肽及跨膜區(qū)，屬于定位于細胞核的不穩(wěn)定蛋白，在不同哺乳動物中存在同源性。家兔DPCs中過表達或敲減ATG14后，WB結果顯示ATG14能夠上調(diào)自噬標志蛋白LC3和Beclin1的蛋白表達，抑制自噬抑制蛋白P62表達水平。ATG14能夠增加細胞中pEGFP-LC3B熒光標記表達，表明ATG14能夠激活細胞中LC3B的表達。同時，在DPCs中過表達ATG14能夠顯著上調(diào)CCND1、FGF2、LEF1、BCL2和 WNT2的mRNA表達水平，顯著下調(diào)SFRP2和TGFβ-1的基因表達水平（Plt;0.05），敲減ATG14能夠顯著下調(diào)CCND1、FGF2、LEF1、BCL2和WNT2的基因表達水平，顯著上調(diào)SFRP2和TGFβ-1的mRNA水平（Plt;0.05）。ATG14能夠上調(diào)LEF1和CCND1的蛋白表達水平。此外，DPC中過表達ATG14能夠顯著促進DPCs細胞增殖（Plt;0.01）。本研究通過對家兔ATG14基因調(diào)控DPCs自噬進程的功能進行分析，為闡明家兔毛囊生長發(fā)育的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

關鍵詞： ATG14；自噬；毛囊；家兔；毛乳頭細胞

中圖分類號： S829.1

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3472-10

收稿日期：2024-01-29

基金項目：國家自然科學基金（32072724；32102529）；財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系資助（CARS-43-A-1）；揚州大學大學生科創(chuàng)基金（XCX20230720）

作者簡介：曹馨予 （2002-），女，江蘇溧陽人，本科生，主要從事動物遺傳育種與繁殖的研究，E-mail： 3263694549@qq.com

通信作者：趙博昊，主要從事動物遺傳育種與繁殖的研究，E-mail：bhzhao@yzu.edu.cn

The Function Analysis of ATG14 Regulates the Autophagy Process in Rabbit Hair Follicle

Dermal Papilla Cells

CAO" Xinyu， CAI" Jiawei， BAO" Zhiyuan， YAO" Shuyu， LI" Yunpeng， CHEN" Yang， WU" Xinsheng，

ZHAO" Bohao*

（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract：" The study aimed to investigate the effect of autophagy-related protein 14 （ATG14） regulate hair follicles growth and development by autophagy progress in rabbit dermal papilla cells （DPCs）. In this study， healthy 6-month-old long-hairAngora rabbits were selected to collect backdorsal skin to isolate and culture DPCs. The coding sequence （CDS） of ATG14 was cloned， and biological characteristics of ATG14 was analyzed by bioinformatics. After the overexpressed and knockdown of ATG14 in DPCs， and the expression of autophagy related protein and hair follicle growth and development related genes was detected， and the influenceeffect of ATG14 regulatedon the cell proliferation was investigated. The results showed that the length of CDS was 1 479 bp for the ATG14 gene， which could code 492 amino acids. Bioinformatics analyses indicated that the ATG14 protein didn′t have potential signal peptides and transmembrane regions， which belong to the unstable proteins localized in the nucleus， and exhibited high homology in different mammals. After the overexpression and knockdown of ATG14 in DPCs， the WB results showed that ATG14 could upregulate the protein expression of autophagy related protein LC3 and Beclin1， but downregulate the autophagy inhibitor P62 protein expression. ATG14 could increase the fluorescent labelingexpression of pEGFP-LC3B in DPCs， indicating that ATG14 could activate the expression of LC3B. What′s more， the overexpression of ATG14 could upregulate the mRNA expression of BCL2， CCND1， FGF2， WNT2 and LEF1， downregulate the gene expression of SFRP2 and TGFβ-1 （Plt;0.05）， the knockdown of ATG14 could downregulate the gene expression of BCL2， CCND1， FGF2， WNT2 and LEF1， upregulate the mRNA expression of SFRP2 and TGFβ-1 （Plt;0.05）. ATG14 could upregulate the expression of LEF1 and CCND1. The overexpression of ATG14 could promote the cell proliferation in DPCs （Plt;0.01）. In this study， the rabbit ATG14 gene regulating the autophagy process in DPCs was analyzed， which provided the theoretical basis for elucidating the regulatory mechanism of hair follicle growth and development in rabbit.

Key words： ATG14; autophagy; hair follicle; rabbit; dermal papilla cells

*Corresponding author：ZHAO Bohao， E-mail：bhzhao@yzu.edu.cn

作為哺乳動物特有的微器官，毛囊具有獨特的生物特性，能夠在機體生命活動中具有保持體溫、物理防護、社交互動和偽裝保護的作用［1］。毛囊具有周期性生長的特性，并不斷經(jīng)歷著生長期、退行期和休止期的周期循環(huán)［2-4］。產(chǎn)毛量則作為毛用型兔的重要經(jīng)濟性狀，為人類生產(chǎn)提供毛紡織原料，而毛囊的生長發(fā)育決定了家兔被毛密度、兔毛品質等相關性狀。

自噬作為一種生物自我降解的過程，能夠在細胞受到營養(yǎng)脅迫、病原體入侵和蛋白質聚集的反應中起著重要作用［5-8］。已有研究表明，自噬進程參與了毛囊的生長發(fā)育和周期循環(huán)。在人類毛囊離體培養(yǎng)試驗中，處于生長期的毛囊基質角質細胞呈現(xiàn)活躍的自噬流狀態(tài)，而自噬流的減弱，促使毛囊進入休止期［9］。另外，誘導細胞自噬能夠激活處于休止期的毛囊，使毛囊進入毛囊周期的生長期，由藥物刺激的自噬能夠挽救脫發(fā)的發(fā)生［10］。肉豆蔻腦酸促進了毛囊毛乳頭細胞（dermal papilla cells，DPCs）的增殖，并通過調(diào)控Wnt蛋白信號活性和自噬進程促進毛囊生長［11］。

自噬相關蛋白14（autophagy-related protein 14，ATG14）是PtdIns 3激酶復合物的特定亞基之一，也被稱為ATG14L或Beclin1相關自噬關鍵調(diào)節(jié)因子（beclin-1-associated autophagy-related key regulator，Barkor），能夠調(diào)節(jié)自噬體的形成，增強PIK3C3活性并誘導細胞自噬的發(fā)生［12-14］。但目前對于ATG14在家兔毛囊生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用尚未見報道。

本研究通過克隆兔ATG14基因編碼序列（coding sequence，CDS），利用生物信息學對其潛在生物學特性進行初步分析，在DPCs中過表達和敲減ATG14，探究ATG14對DPCs細胞自噬進程的調(diào)控作用，同時檢測毛囊生長發(fā)育相關基因的表達水平變化，以期了解ATG14對毛囊生長發(fā)育的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇6月齡長毛兔公兔用于DPCs的分離，長毛兔由江蘇省揚州市江都區(qū)褚家巷朝陽養(yǎng)殖場提供。試驗所用的長毛兔飼養(yǎng)在相同條件下，包括溫度、飼料和環(huán)境。

1.2 主要試劑

MSCM完全培養(yǎng)基購自美國Sciencell公司，lipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司，HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning試劑盒、HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、CCK8檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。RNAsimple總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，Kpn Ⅰ和EcoR Ⅴ，E. coli DH5α感受態(tài)細胞購自購自TaKaRa公司。Western細胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司，Anti-ATG14兔多克隆抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司、Anti-GAPDH鼠單克隆抗體、Anti-LEF1兔多克隆抗體、Anti-CCND1鼠單克隆抗體、Anti-P62兔多克隆抗體、Anti-Beclin1兔多克隆抗體、Anti-LC3兔多克隆抗體購自武漢三鷹公司。

1.3 家兔DPCs培養(yǎng)與轉染

采集6月齡健康長毛兔背部皮膚，根據(jù)課題組已報道方法分離獲取DPCs［15］，分離得到的DPCs培養(yǎng)于MSCM完全培養(yǎng)基中，并在37 ℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染前，將DPCs接種于24孔板中，待細胞匯合度達到80%時，使用lipofectamineTM2000轉染試劑根據(jù)試劑盒說明書進行轉染。

1.4 總RNA的提取與反轉錄

使用RNAsimple總RNA提取試劑盒提取試驗中細胞總RNA。經(jīng)Nanodrop 2000檢測RNA濃度與純度。使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）進行全長cDNA一鏈的合成。

1.5 ATG14過表達載體和干擾載體的構建

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中ATG14基因轉錄本（XM_002718262.4）設計CDS序列擴增引物，送至擎科生物公司合成引物（表1）。利用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase進行PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物長度。pcDNA3.1（+）載體經(jīng)Kpn Ⅰ和EcoR Ⅴ雙酶切后，切膠回收，使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning試劑盒進行一步克隆試驗，連接產(chǎn)物轉化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后挑取陽性菌落進行鑒定，鑒定成功后的菌液通過無內(nèi)毒素大提質粒試劑盒提取質粒。小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）購自上海吉瑪制藥有限公司，序列信息如表1所示。

1.6 生物信息學分析

利用在線軟件ProtParam（http：∥web.expasy.org/protparam/）進行ATG14理化性質的預測分析［16］；SignalP 4.1（https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）對ATG14的潛在信號肽進行預測［17］；TMHMM 2.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對ATG14的跨膜區(qū)和分泌蛋白進行預測［18］。NetPhos 3.1 Server （https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）對磷酸化位點進行預測［19］；NetOGlyc 4.0 Server （https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/）和NetNGlyc 1.0 Server（https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）分別對糖基化位點進行預測［20-21］；PSORT II（https：∥www.genscript.com/psort.html？src=leftbar）進行亞細胞定位的預測［22］；利用MEGA X軟件進行進化樹分析［23］；Hopfield（http：∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）進行蛋白質二級結構分析［24］；SWISS-MODEL 用于蛋白質三級結構預測［25］。通過STRING數(shù)據(jù)庫對ATG14蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡進行預測［26］。

1.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

收集轉染后的DPCs提取細胞總RNA，通過HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR進行cDNA第一鏈合成。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix進行qRT-PCR試驗，試驗所用特異性引物如表2所示，家兔GAPDH（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）作為內(nèi)參基因，所得試驗結果通過2-ΔΔCt法計算相對表達水平［27］。

1.8 蛋白免疫印跡

使用Western細胞裂解液對樣品提取總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。利用全自動蛋白質印跡定量分析（Wes automated Western blotting system）進行蛋白表達水平的檢測，分別配制DTT、Fluorescent 5×Master Mix、Biotinylated Ladder、0.1×Sample Buffer，根據(jù)樣品原液濃度配制終濃度為0.2 μg·μL-1的待檢蛋白樣本，置于95℃變性5 min。使用Antibody Diluent II稀釋配制一抗和二抗，并配制發(fā)光液。將配置好的試劑根據(jù)試驗分組依次加入板內(nèi)。使用Compass for SW軟件上機操作，完成后收集數(shù)據(jù)并處理。

1.9 細胞增殖檢測

通過CCK8法檢測細胞增殖水平。細胞計數(shù)后，將細胞接種于96孔板中，每孔100 μL，預培養(yǎng)24 h。在每個測定時間點（0、24、48、72 h）沿細胞板壁向孔中加入CCK-8 Solution（10 μL·孔-1），輕輕晃勻，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標儀450 nm測定吸光值。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件，根據(jù)不同的試驗對數(shù)據(jù)進行成對T檢驗分析，試驗中至少設計3個生物學重復，結果使用“平均值±標準差”表示。Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 ATG14的克隆和生物信息學分析

通過PCR擴增和克隆測序獲得ATG14基因CDS長度為1 479 bp，共編碼492個氨基酸。利用ProtParam軟件預測可知，ATG14蛋白的分子量為55.24 ku，分子式為C2387H3803N699O761S24，理論等電位為6.72，不穩(wěn)定系數(shù)為50.26，屬于不穩(wěn)定蛋白，親水性平均系數(shù)為-0.700。SignalP 4.1軟件預測結果表明ATG14不存在潛在信號肽（圖 1A）。TMHMM預測結果顯示ATG14蛋白不包含跨膜區(qū)（圖1B）。Netphos 3.1 server預測結果表明ATG14蛋白存在58個磷酸化位點：38個絲氨酸（Ser）、17個蘇氨酸（Thr）和3個酪氨酸（Tyr）。NetOGlyc 4.0 server預測結果表明ATG14蛋白有18個O-糖基化位點和2個N-糖基化位點。亞細胞定位在線預測工具PSORT II結果顯示ATG14蛋白定位于細胞核的概率為69.6%，細胞質為21.7%，過氧化物酶體為4.3%，線粒體為4.3%。

2.2 ATG14蛋白的結構預測

ATG14蛋白的二級結構預測表明，α-螺旋占37.80%，延伸鏈占14.63%，無規(guī)則卷曲占47.56%（圖1C）。利用SWISSMODEL在線工具對ATG14的三級結構預測結果顯示呈一條螺旋鏈（圖1D）。STRING數(shù)據(jù)庫對ATG14蛋白互作網(wǎng)絡進行分析表明，ATG14蛋白與ATG13、BECN1、PIK3R4、PIK3C3和STX17等蛋白存在互作關系（圖1E）。

2.3 ATG14基因系統(tǒng)進化樹分析

對ATG14基因在不同物種中的同源性進行分析，利用MEGA X軟件構建蘇門答臘猩猩（Pongo abelii）、人（Homo sapiens）、家兔（Oryctolagus cuniculus）、綿羊（Ovis aries）、豬（Sus scrofa）、犬（Canis lupus familiaris）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、雞（Gallus gallus）9個物種的系統(tǒng)進化樹，結果表明家兔ATG14基因與人類和蘇門答臘猩猩構成一個分支，具有同源性（圖1F）。

2.4 ATG14對毛乳頭細胞自噬進程的激活

在DPCs中過表達或敲減ATG14，qRT-PCR結果表明pcDNA3.1-ATG14能夠極顯著上調(diào)ATG14的mRNA表達水平（圖2A，Plt;0.01），siRNA-ATG14能夠極顯著下調(diào)ATG14的mRNA表達水平（圖2B，Plt;0.01）。WB結果表明，pcDNA3.1-ATG14能夠極顯著上調(diào)ATG14的蛋白表達水平，siRNA-ATG14能夠極顯著下調(diào)ATG14的蛋白表達水平（圖2C）。DPCs中ATG14的過表達能夠顯著上調(diào)自噬標志蛋白LC3和Beclin1的蛋白表達，抑制自噬抑制蛋白P62表達水平（圖2C）。

進一步探究ATG14對DPCs自噬進程的激活，在DPCs中過表達或敲減ATG14的同時共轉染pEGFP-LC3B質粒，細胞熒光觀察顯示，過表達ATG14能夠增加細胞中pEGFP-LC3B熒光標記，表明ATG14能夠激活細胞中LC3B的表達（圖2D）。

2.5 ATG14對毛囊發(fā)育相關基因的調(diào)控作用

進一步探究ATG14對毛囊發(fā)育相關基因的影響，在DPCs中過表達ATG14能夠顯著上調(diào)CCND1、FGF2、LEF1、BCL2和 WNT2的mRNA表達水平，顯著下調(diào)SFRP2和TGFβ-1的基因表達水平（圖3A，Plt;0.05）；敲減ATG14能夠顯著下調(diào)CCND1、FGF2、LEF1、BCL2和WNT2的基因表達水平，顯著上調(diào)SFRP2和TGFβ-1的mRNA表達水平（圖3B，Plt;0.05）。WB結果表明ATG14過表達能夠上調(diào)LEF1和CCND1的蛋白表達水平（圖3C）。

2.6 ATG14對DPCs細胞增殖的影響

利用CCK8檢測ATG14對DPCs細胞增殖的影響，結果表明，過表達ATG14能夠在轉染后24～72 h顯著促進DPCs細胞增殖（圖4A，Plt;0.01），敲減ATG14能夠在轉染后24～72 h顯著抑制DPCs細胞增殖（圖4B，Plt;0.01）。

3 討 論

自噬作為真核生物的重要生物進程，能夠調(diào)控毛囊周期，影響毛囊生長發(fā)育與再生［28］。已有研究表明，自噬抑制劑通過影響氧化應激途徑誘導人DPCs細胞早衰，使得DPCs遷移能力降低，生物活性因子表達下調(diào)［29］。硬脂酰輔酶A飽和酶1通過介導PI3K-AKT-mTOR通路抑制自噬進程，從而抑制對毛發(fā)生長產(chǎn)生的影響［30］?；羯绞軌蛏险{(diào)自噬關鍵因子LC3Ⅱ和抑凋亡因子BCL2的表達，通過激活自噬和抑制凋亡促進毛發(fā)生長，緩解脫發(fā)［31］。目前，超過30個自噬相關蛋白（autophagy related proteins，ATG）家族中的ATG基因在酵母中被發(fā)現(xiàn)，其中至少18個基因是參與自噬進程中自噬體形成的必要因子，大多數(shù)ATG在哺乳動物中呈現(xiàn)高度保守，并且他們構成自噬體的機制也大致保守［32-33］。作為ATG家族的一員，ATG14是決定PtdIns 3-激酶復合物功能的關鍵因子，通過調(diào)節(jié)復合物I的定位來指導復合物I在自噬中發(fā)揮作用［34］。

本研究克隆得到了家兔ATG14的編碼序列，其可編碼492個氨基酸，生物信息學分析顯示，ATG14蛋白屬于不穩(wěn)定親水蛋白，且不存在信號肽和跨膜區(qū)。糖基化在信號轉導、免疫反應、受體激活、細胞粘附和內(nèi)吞作用等眾多生物過程中起著重要作用［35］。ATG14含有18個O-糖基化位點和2個N-糖基化位點，表明其可通過潛在的糖基化作用于生物調(diào)控作用。ATG14蛋白為定位于細胞核的不穩(wěn)定蛋白，且能夠與ATG13［36］、BECN1［37］、PIK3R4［38］、PIK3C3［39］和STX17［40］等自噬相關蛋白存在互作關系。自噬的誘導與液泡的存在有關，液泡的特征標記為LC3蛋白［41］。Beclin1是一種與BCL2或PI3KIII類相互作用的蛋白，在自噬和細胞死亡的調(diào)控中起關鍵作用［42］。P62是自噬的選擇性底物之一，在胞質蛋白包含物的形成中起著關鍵作用［43］。研究結果中，ATG14的過表達能夠促進DPCs中LC3和Beclin1蛋白的表達，抑制P62蛋白的表達，表明ATG14能夠在DPCs中參與自噬相關蛋白的表達調(diào)控，促進DPCs的自噬發(fā)生。

Wnt2、LEF1和CCND1能夠通過Wnt/β-catenin信號通路影響毛乳頭細胞的活性，調(diào)控毛囊生長發(fā)育［44-45］。BCL2在毛囊周期與形態(tài)發(fā)生過程中起著重要作用［46］。FGF2能夠促進DPCs的細胞增殖，維持毛發(fā)的誘導能力［47］。SFRP2在毛囊生長的不同時期呈現(xiàn)差異表達，對毛囊再生起抑制作用［48-49］。TGFβ-1與雄性激素導致的脫發(fā)密切相關［50］。本研究中，在DPCs中過表達與敲減ATG14能夠調(diào)控毛囊生長發(fā)育相關基因CCND1、FGF2、LEF1、BCL2、Wnt2、SFRP2和TGFβ-1的基因表達水平，表明ATG14能夠參與家兔毛囊的生長發(fā)育。

4 結 論

本研究成功克隆了家兔ATG14基因編碼序列，長度為1 479 bp，共編碼492個氨基酸，生物信息學預測表明ATG14蛋白為不穩(wěn)定親水蛋白，含有18個O-糖基化位點和2個N-糖基化位點。ATG14在DPCs細胞中的過表達能夠上調(diào)自噬相關蛋白的表達，同時引起CCND1、FGF2和LEF1等毛囊生長發(fā)育相關基因表達水平的變化，并具有促進DPCs細胞增殖的作用。

參考文獻（References）：

［1］ STENN K S，PAUS R.Controls of hair follicle cycling［J］.Physiol Rev，2001，81（1）：449-494.

［2］ SCHNEIDER M R，SCHMIDT-ULLRICH R，PAUS R.The hair follicle as a dynamic miniorgan［J］.Curr Biol，2009，19（3）： R132-R142.

［3］ JI S F，ZHU Z Y，SUN X Y，et al.Functional hair follicle regeneration：an updated review［J］.Signal Transduct Target Ther，2021， 6（1）：66.

［4］ 李玉娟，張原銘，張北育，等.飼糧賴氨酸水平對安哥拉兔產(chǎn)毛性能及毛囊發(fā)育的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2023， 54（5）：2013-2019.

LI Y J，ZHANG Y M，ZHANG B Y，et al.Effects of dietary lysine supplementation on hair production performance and hair follicle development of angora rabbits［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（5）：2013-2019.（in Chinese）

［5］ CAO W Y，LI J H，YANG K P，et al.An overview of autophagy：Mechanism，regulation and research progress［J］.Bull Cancer，2021，108（3）：304-322.

［6］ YAMAMOTO H，ZHANG S D，MIZUSHIMA N.Autophagy genes in biology and disease［J］.Nat Rev Genet，2023，24（6）： 382-400.

［7］ VARGAS J N S，HAMASAKI M，KAWABATA T，et al.The mechanisms and roles of selective autophagy in mammals［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2023，24（3）：167-185.

［8］ 李鈺浚，何翃閎，楊麗雪，等.線粒體自噬調(diào)控哺乳動物胚胎發(fā)育的研究進展［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2024，55（3）：905-912.

LI Y J，HE H H，YANG L X，et al.Advances in regulation of mammalian embryonic development by mitochondrial autophagy［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2024，55（3）：905-912.（in Chinese）

［9］ PARODI C，HARDMAN J A，ALLAVENA G，et al.Autophagy is essential for maintaining the growth of a human （mini-）organ： evidence from scalp hair follicle organ culture［J］.PLoS Biol，2018，16（3）：e2002864.

［10］ CHAI M，JIANG M S，VERGNES L，et al.Stimulation of hair growth by small molecules that activate autophagy［J］.Cell Rep，2019，27（12）：3413-3421.e3.

［11］ CHOI Y K，KANG J I，HYUN J W，et al.Myristoleic acid promotes anagen signaling by autophagy through activating Wnt/β-catenin and ERK pathways in dermal papilla cells［J］.Biomol Ther，2021，29（2）：211-219.

［12］ OBARA K，OHSUMI Y.Atg14：a key player in orchestrating autophagy［J］.Int J Cell Biol，2011，2011：713435.

［13］ DIAO J J，LIU R，RONG Y G，et al.ATG14 promotes membrane tethering and fusion of autophagosomes to endolysosomes［J］. Nature，2015，520（7548）：563-566.

［14］ ZHAO Y T，ZOU Z J，SUN D X，et al.GLIPR2 is a negative regulator of autophagy and the BECN1-ATG14-containing phosphatidylinositol 3-kinase complex［J］.Autophagy，2021，17（10）：2891-2904.

［15］ LI J L，ZHAO B H，ZHANG X Y，et al.Establishment and functional characterization of immortalized rabbit dermal papilla cell lines［J］.Anim Biotechnol，2023，34（8）：4050-4059.

［16］ GASTEIGER E，HOOGLAND C，GATTIKER A，et al.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server［M］∥ WALKER J M.The Proteomics Protocols Handbook.Humana Totowa：Springer，2005：571-607.

［17］ PETERSEN T N，BRUNAK S，VON HEIJNE G，et al.SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions［J］.Nat Methods，2011，8（10）：785-786.

［18］ M?LLER S，CRONING M D R，APWEILER R.Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions［J］.Bioinformatics，2001，17（7）：646-653.

［19］ BLOM N，GAMMELTOFT S，BRUNAK S.Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites［J］.J Mol Biol，1999，294（5）：1351-1362.

［20］ STEENTOFT C，VAKHRUSHEV S Y，JOSHI H J，et al.Precision mapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCell technology［J］.EMBO J，2013，32（10）：1478-1488.

［21］ GUPTA R，BRUNAK S.Prediction of glycosylation across the human proteome and the correlation to protein function［J］.Pac Symp Biocomput，2002，7（3）：310-322.

［22］ NAKAI K，HORTON P.PSORT：a program for detecting sorting signals in proteins and predicting their subcellular localization［J］.Trends Biochem Sci，1999，24（1）：34-35.

［23］ KUMAR S，STECHER G，LI M，et al.MEGA X：molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms［J］.Mol Biol Evol，2018，35（6）：1547-1549.

［24］ DELéAGE G.ALIGNSEC：viewing protein secondary structure predictions within large multiple sequence alignments［J］. Bioinformatics，2017，33（24）：3991-3992.

［25］ WATERHOUSE A，BERTONI M，BIENERT S，et al.SWISS-MODEL：homology modelling of protein structures and complexes［J］.Nucleic Acids Res，2018，46（W1）：W296-W303.

［26］ HORTON P，PARK K J，OBAYASHI T，et al.WoLF PSORT：protein localization predictor［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（S2）： W585-W587.

［27］ SCHMITTGEN T D，LIVAK K J.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method［J］.Nat Protoc，2008，3（6）： 1101-1108.

［28］ 黃雨馨，梁文姿，陳秀文，等.自噬在毛發(fā)再生中的作用［J］.中國組織工程研究，2024，28（7）：1112-1117.

HUANG Y X，LIANG W Z，CHEN X W，et al.Role of autophagy in hair regeneration［J］.Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2024，28（7）：1112-1117.（in Chinese）

［29］ 萬 梅，鐘 意，翁祖銓，等.自噬抑制劑通過氧化應激誘導人頭皮毛乳頭細胞早衰進程［J］.中國皮膚性病學雜志，2023，37（7）：748-754.

WAN M，ZHONG Y，WENG Z Q，et al.Autophagy inhibitors induce premature senescence of human scalp dermal papilla cells by oxidative stress［J］.The Chinese Journal of Dermatovenereology，2023，37（7）：748-754.（in Chinese）

［30］ 羅 怡.SCD1通過抑制自噬對毛囊生長的調(diào)控作用及機制研究［D］.重慶：重慶醫(yī)科大學，2022.

LUO Y.Role and mechanism of SCD1 by inhibiting autogpagy on hair follice［D］.Chongqing：Chongqing Medical University，2022.（in Chinese）

［31］ 張 敏，黃 蓉，段亞君，等.霍山石斛通過激活自噬和抑制凋亡促進脫發(fā)模型小鼠生發(fā)作用［J］.合肥工業(yè)大學學報（自然科學版），2022，45（6）：844-848.

ZHANG M，HUANG R，DUAN Y J，et al.Dendrobium huoshanense promotes hair growth in mouse model of alopecia by activating autophagy and inhibiting apoptosis［J］.Journal of Hefei University of Technology （Natural Science），2022，45（6）：844-848.（in Chinese）

［32］ NAKATOGAWA H，SUZUKI K，KAMADA Y，et al.Dynamics and diversity in autophagy mechanisms：lessons from yeast［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（7）：458-467.

［33］ YANG Z F，KLIONSKY D J.An overview of the molecular mechanism of autophagy［M］∥LEVINE B，YOSHIMORI T，DERETIC V.Autophagy in Infection and Immunity.Berlin：Springer，2009：1-32.

［34］ OBARA K，SEKITO T，OHSUMI Y.Assortment of phosphatidylinositol 3-kinase complexes—Atg14p directs association of complex I to the pre-autophagosomal structure in Saccharomyces cerevisiae［J］.Mol Biol Cell，2006，17（4）：1527-1539.

［35］ OHTSUBO K，MARTH J D.Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease［J］.Cell，2006，126（5）：855-867.

［36］ CHANG Y Y，NEUFELD T P.An Atg1/Atg13 complex with multiple roles in TOR-mediated autophagy regulation［J］.Mol Biol Cell，2009，20（7）：2004-2014.

［37］ MEI Y，GLOVER K，SU M F，et al.Conformational flexibility of BECN1：essential to its key role in autophagy and beyond［J］. Protein Sci，2016，25（10）：1767-1785.

［38］ LIU Y，WEI C H，LI C，et al.Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4 participates in the occurrence and development of amyotrophic lateral sclerosis by regulating autophagy［J］.Neural Regen Res，2022，17（7）：1609.

［39］ WANG Y D，LI J H，ZHENG H T，et al.Cezanne promoted autophagy through PIK3C3 stabilization and PIK3C2A transcription in lung adenocarcinoma［J］.Cell Death Discov，2023，9（1）：302.

［40］ SHEN Q H，SHI Y，LIU J Q，et al.Acetylation of STX17 （syntaxin 17） controls autophagosome maturation［J］.Autophagy，2021， 17（5）：1157-1169.

［41］ TANIDA I，UENO T，KOMINAMI E.LC3 and Autophagy［M］∥DERETIC V.Autophagosome and Phagosome.Humana Totowa：Springer，2008：77-88.

［42］ FU L L，CHENG Y，LIU B.Beclin-1：autophagic regulator and therapeutic target in cancer［J］.Int J Biochem Cell Biol，2013， 45（5）：921-924.

［43］ ICHIMURA Y，KOMATSU M.Selective degradation of p62 by autophagy［J］.Semin Immunopathol，2010，32（4）：431-436.

［44］ HWANG J H，LEE H Y，CHUNG K B，et al.Non-thermal atmospheric pressure plasma activates Wnt/β-catenin signaling in dermal papilla cells［J］.Sci Rep，2021，11（1）：16125.

［45］ TIAN Y Z，YANG X M，DU J W，et al.Differential methylation and transcriptome integration analysis identified differential methylation annotation genes and functional research related to hair follicle development in sheep［J］.Front Genet，2021，12：735827.

［46］ MLLER-R?VER S，ROSSITER H，LINDNER G，et al.Hair follicle apoptosis and Bcl-2［J］.J Investig Dermatol Symp Proc，1999，4（3）：272-277.

［47］ KISO M，HAMAZAKI T S，ITOH M，et al.Synergistic effect of PDGF and FGF2 for cell proliferation and hair inductive activity in murine vibrissal dermal papilla in vitro［J］.J Dermatol Sci，2015，79（2）：110-118.

［48］ 孫露露，石福岳，秦立志，等.皖系長毛兔不同周齡Wnt10b、SFRP2基因在皮膚中的表達規(guī)律［J］.中國畜牧雜志，2013， 49（13）：4-8.

SUN L L，SHI F Y，QIN L Z.The expressions rules of Wnt10b and SFRP2 gene in skin of Wanxi Angora rabbit［J］.Chinese Journal of Animal Science，2013，49（13）：4-8.（in Chinese）

［49］ KIM B K，YOON S K.Expression of sfrp2 is increased in catagen of hair follicles and inhibits keratinocyte proliferation［J］.Ann Dermatol，2014，26（1）：79-87.

［50］ INUI S，F(xiàn)UKUZATO Y，NAKAJIMA T，et al.Androgen-inducible TGF-β1 from balding dermal papilla cells inhibits epithelial cell growth：a clue to understanding paradoxical effects of androgen on human hair growth［J］.FASEB J，2002，16（14）：1967-1969.

（編輯 郭云雁）