基于響應面法對皇冠牡丹(Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’)增殖培養(yǎng)基大量元素配方的優(yōu)化

收稿日期：2023-08-09

基金項目：國家自然科學基金項目（32001359）；南京林業(yè)大學大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（2022NFUSPITP0436）

作者簡介：李勝皓（1999-），女，重慶人，碩士研究生，研究方向為園林植物與觀賞園藝。（E-mail）lynel1104@163.com

通訊作者：文書生，（E-mail）shusheng0507@126.com

摘要： 增殖系數(shù)低一直是制約牡丹微繁殖技術(shù)推廣應用的障礙之一，但目前的研究多集中于植物生長調(diào)節(jié)劑的使用與組合，較少關(guān)注培養(yǎng)基配方對牡丹試管苗增殖效果的影響。本研究以皇冠牡丹（Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’）為試驗材料，使用Design-Expert響應面法設(shè)計優(yōu)化試驗，探究WPM中5種大量元素[K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O]對皇冠牡丹試管苗增殖效果的影響，并建立數(shù)學模型分析預測最佳優(yōu)化培養(yǎng)基配方。單因素效應分析結(jié)果表明，KH2PO4、NH4NO3與Ca（NO3）2·4H2O對牡丹試管苗的增殖效果有顯著或極顯著影響，而MgSO4·7H2O與K2SO4對牡丹試管苗的增殖效果無明顯影響。交互作用分析結(jié)果表明，K2SO4與KH2PO4的交互作用對株高、莖長有顯著或極顯著影響，K2SO4與MgSO4·7H2O、KH2PO4與NH4NO3的交互作用對莖長有顯著或極顯著影響。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)構(gòu)建模型進行分析預測，結(jié)果顯示，5種大量元素優(yōu)化配方為：K2SO4 2 257 mg/L、MgSO4·7H2O 907 mg/L、KH2PO4 481 mg/L、NH4NO3 200 mg/L與Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L。在該條件下開展驗證試驗，獲得試管苗的增殖系數(shù)、株高、莖長與葉片數(shù)分別為2.43、4.62 cm、1.30 cm、6.75張，略高于Design-Expert試驗得出的預測值，顯著優(yōu)于對照組，說明本研究成功優(yōu)化了皇冠牡丹的專用增殖培養(yǎng)基配方。研究結(jié)果不僅能大幅提高皇冠牡丹的增殖效率，也為其他牡丹品種增殖培養(yǎng)體系的構(gòu)建與改良提供重要的技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞： 牡丹；微繁殖；響應面法；增殖；WPM培養(yǎng)基

中圖分類號： S685.11 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2024）08-1493-14

Optimization of macro-elements composition in the multiplication medium of Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’ based on response surface methodology

LI Shenghao， ZHANG Xiaozhi， PAN Yue， ZHENG Bingyan， WEN Shusheng

（College of Landscape Architecture， Nanjing Forestry University， Nanjing 210000， China）

Abstract： Low multiplication coefficient has been one of the obstacles limiting the industrial application of tree peony （Paeonia sect. Moutan） micropropagation technology， but most of the current studies have been focused on the use and combination of plant growth regulators， and less attention has been paid to the effect of medium formulation on the multiplication of test-tube seedlings of tree peony. In this study， we used Paeonia×lemoinei ‘Yellow CrowECVEQI0XsugZ00QQ/y8GO951BQ0uRBlPk+pQUPBaqNE=n’ as the experimental material and designed an optimization test by using Design-Expert response surface method to investigate the effects of five macro-elements， such as K2SO4， MgSO4·7H2O， KH2PO4， NH4NO3， Ca（NO3）2·4H2O in WPM medium on the multiplication effect of the test-tube seedlings of Paeonia sect. Moutan， and developed a mathematical model to predict the best optimized medium formulation. Results of single factor effect analysis showed that， KH2PO4， NH4NO3 and Ca（NO3）2·4H2O had significant or highly significant effects on the multiplication effect of the test-tube seedlings， while MgSO4·7H2O and K2SO4 had no significant effects. Results of interaction analysis showed that， the interaction between K2SO4 and KH2PO4 had significant or highly significant effects on plant height， and stem length， the interactions between K2SO4 and MgSO4·7H2O， KH2PO4 and NH4NO3 had significant or hightly significant effects on stem length. Based on the experimental data， the model analysis results predicted that the optimized formulations for five macro-elements were K2SO4 2 257 mg/L， MgSO4·7H2O 907 mg/L， KH2PO4 481 mg/L， NH4NO3 200 mg/L and Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L. The validation test was conducted， and the multiplication coefficient， plant height， stem length and leaf number of the test-tube seedlings were 2.43， 4.62 cm， 1.30 cm and 6.75 respectively， which were slightly higher than the predicted values obtained by Design-Expert experiment and were significantly better than the control group， indicating the special multiplication medium for P.×lemoinei ‘Yellow Crown’ was constructed successfully. The results of this study can not only greatly improve the multiplication efficiency of P.×lemoinei ‘Yellow Crown’， but can also provide an important technical reference for the construction and improvement of multiplication culture system of other tree peony species.

Key words： tree peony;micropropagation;response surface method;multiplication;WPM medium

牡丹（Paeonia sect. Moutan）為芍藥科芍藥屬落葉灌木，是原產(chǎn)于中國的傳統(tǒng)名花和藥用植物，近年來被發(fā)現(xiàn)作為新型油料植物也有巨大的市場潛力[1]?；使谀档ぃ≒.×lemoinei ‘Yellow Crown’）為20世紀70年代由日本育種學家選育的牡丹遠緣雜交品種，花乳黃色，花頭直立，芳香馥郁，生長勢強，品質(zhì)優(yōu)良，具有很高的觀賞與經(jīng)濟價值。但長期以來該品種的傳統(tǒng)繁殖方式（如分株、嫁接等）存在繁殖系數(shù)低、周期長、易受環(huán)境條件限制等問題，嚴重制約了其規(guī)?；a(chǎn)。微繁殖技術(shù)即植物的離體無性繁殖技術(shù)，在保留母株優(yōu)良性狀的同時，具有繁殖快速、繁殖系數(shù)高等特點，能彌補傳統(tǒng)繁殖方法的不足，因此，構(gòu)建皇冠牡丹的微繁殖技術(shù)體系是推動其規(guī)模化生產(chǎn)的必然趨勢。

增殖培養(yǎng)是牡丹微繁殖技術(shù)的第2個階段，其中試管苗能否高效地增殖和正常生長是決定微繁殖技術(shù)成敗的關(guān)鍵。國內(nèi)自1984年首次開展牡丹微繁殖技術(shù)研究以來[2]，迄今已初步建立了菱花湛露（P. suffruticosa‘Ling Hua Zhan Lu’）、洛陽紅（P.×suffruticosa‘Luo Yang Hong’）、正午S9Weqz4lRk5OmoyZwW1O2Q==（P.×lemoinei ‘High Noon’）等40多個牡丹品種的增殖培養(yǎng)體系[3]。但目前關(guān)于皇冠牡丹增殖培養(yǎng)體系的研究仍鮮見報道，僅黃素姣[4]就植物生長調(diào)節(jié)劑對皇冠牡丹增殖生長的影響進行了探究，并獲得了適合皇冠牡丹增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，即6-BA（6-芐氨基嘌呤） 0.20mg/L+GA3（赤霉素） 0.10mg/L+ZT（玉米素） 0.05mg/L，但并未探究培養(yǎng)基中基礎(chǔ)成分對其增殖效果的影響。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)牡丹增殖培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基成分與試管苗增殖效果關(guān)系密切，如Beruto等[5]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的Ca2+濃度會對試管苗產(chǎn)生影響，并且提高WPM（木本植物專用培養(yǎng)基）中的Ca2+濃度，不僅能有效減少頂芽壞死的現(xiàn)象，還能提高增殖系數(shù)和莖長[6]；Li等[7]則發(fā)現(xiàn)降低培養(yǎng)基中NH+4與NO-3濃度的比值可以促進試管苗的生長，并降低試管苗玻璃化率；在此基礎(chǔ)上，有研究將WPM中Ca（NO3）2濃度分別提高至原始濃度的3.0倍與4.0倍，從而顯著提高了正午牡丹（P.×lemoinei ‘High noon’）和鳳丹牡丹（P. ostii）試管苗的增殖系數(shù)，且子代腋芽較為粗壯，而Ca（NO3）2濃度過低會導致試管苗生長不良、易玻璃化，Ca（NO3）2濃度過高則會降低增殖系數(shù)，使葉片變小卷曲[8-9]。綜上，前人關(guān)于牡丹增殖培養(yǎng)階段的研究多集中在植物生長調(diào)節(jié)劑的篩選，較少對培養(yǎng)基配方進行研究，且培養(yǎng)基構(gòu)成組分復雜，各因素間會產(chǎn)生相互作用，使用常規(guī)試驗方法將耗費大量時間和精力。

響應面分析法（RSM）通過結(jié)合數(shù)學方法和統(tǒng)計分析，對響應過程變量進行數(shù)學建模和分析，尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，是解決多變量問題的一種統(tǒng)計學方法[10]，主要利用二次回歸模型對各因素和響應值之間的關(guān)系進行分析和擬合，試驗精度高、次數(shù)少、周期短，克服了正交試驗與單因素試驗法的不足，已被廣泛應用于食品學、生態(tài)學等領(lǐng)域，并常被用來改良植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件[11-14]。在牡丹微繁殖技術(shù)研究中，響應面法也有應用，黃弄璋[15]使用響應面法中的Plackett-Burman試驗，以WPM中的大量元素、微量元素、肌醇、鈣、有機物質(zhì)、鐵鹽6大組分進行設(shè)計，篩選發(fā)現(xiàn)鐵鹽、鈣和肌醇是影響正午牡丹增殖效果的主要影響因子，并選取這3個因素設(shè)計Box-Behnken（效應面法）試驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，將增殖系數(shù)提高了10%左右。這表明響應面法在牡丹微繁殖技術(shù)培養(yǎng)基配方改良中具有較大的應用潛力，但目前尚未見使用響應面法對牡丹微繁殖技術(shù)培養(yǎng)基中的大量元素濃度進行改良調(diào)整的研究。鑒于此，本研究擬以皇冠牡丹試管苗為試驗材料，利用響應面法對WPM中5種大量元素配方進行優(yōu)化，以期篩選獲得適宜皇冠牡丹的特定增殖培養(yǎng)基，為該品種規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持，并為其他牡丹品種微繁殖技術(shù)的研發(fā)提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年2月底于山東省菏澤市古韻牡丹基地進行，選取長勢良好、無病蟲害的皇冠牡丹母株，剪取帶有飽滿鱗芽的枝，剝下腋芽作為外植體，并按照文獻[16]的方法對外植體進行消毒后進行接種，啟動培養(yǎng)基為改良WPM[Ca（NO3）2·4H2O 1 668 mg/L+BA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，附加蔗糖30.0 g/L、瓊脂6.5 g/L，pH=5.9]，后續(xù)如無特殊說明，培養(yǎng)基同上。在第5次繼代培養(yǎng)末期，切取芽叢上莖長約為1～2 cm的健壯單芽，去除全部葉片作為試驗材料。

1.2 試驗方法

以WPM中5種大量元素的無機鹽[K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O]作為設(shè)計因素，前4種大量元素的無機鹽（K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3）的濃度范圍設(shè)置為WPM原濃度[K2SO4為990 mg/L，MgSO4·7H2O為370 mg/L，KH2PO4為170 mg/L，NH4NO3為400 mg/L，Ca（NO3）2·4H2O為556 mg/L]的0.5～3.0倍，Ca（NO3）2·4H2O的濃度范圍設(shè)置為WPM原濃度的0.5～4.0倍，使用Design-Expert Optimal軟件中的響應面法進行最佳優(yōu)化試驗設(shè)計，得到30個處理，并以WPM原濃度作為對照（表1）。上述各處理培養(yǎng)基均附加6-BA 0.5 mg/L、GA3 0.1 mg/L、蔗糖30.0 g/L、瓊脂6.5 g/L，pH 5.9。

1.3 培養(yǎng)條件與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究中啟動和增殖培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度（24±1） ℃，光照時間14 h/d，熒光燈光照度為32.4 μmol/（m2·s）。

增殖培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計不同處理試管苗的增殖系數(shù)（莖長為1～2 cm健壯單芽數(shù)/接種外植體個數(shù)）、株高、莖長和葉片數(shù)，并以上述指標為目標函數(shù)建立模型，根據(jù)模型計算預測目標值對應各因素的置信區(qū)間，獲得優(yōu)化配方，從而確定優(yōu)化培養(yǎng)基的組成比例，并進行驗證試驗。

2 結(jié)果與分析

將原始數(shù)據(jù)導入SPSS22.0，可得增殖系數(shù)、平均株高、平均莖長與單株葉片數(shù)（表2）。由表2可知，增殖系數(shù)較高的前3個處理依次為第13組、第28組、第15組；平均株高較高的前3個處理依次為第19組、第28組、第6組；平均莖長較高的前3個處理依次為第28組、第15組、第14組；單株葉片數(shù)較高的前3個處理依次為第15組、第19組、第13組。綜合來看，第28組為最優(yōu)處理，其增殖系數(shù)、平均株高、平均莖長與單株葉片數(shù)均優(yōu)于對照，說明培養(yǎng)基大量元素濃度對試管苗增殖效果會產(chǎn)生顯著影響。

將SPSS22.0處理后的數(shù)據(jù)通過軟件Design-Expert 12.0進行數(shù)據(jù)擬合和顯著性檢驗，對試驗結(jié)果與試驗因子進行三維建模，預測增殖系數(shù)和平均莖長處于較高水平時培養(yǎng)基成分的最優(yōu)配比。其中，5項變量因子為K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O的濃度倍數(shù)，分別用x1、x2、x3、x4、x5表示。線性項顯著表示該大量元素濃度對響應值影響顯著，二次項顯著表示2種大量元素濃度交互作用顯著，系數(shù)為正、負分別表示濃度增大時影響方向的正、負。

2.1 平均增殖系數(shù)模型建立與分析

以增殖系數(shù)為Y1，根據(jù)Design-Expert 12.0軟件擬合試驗處理，得到增殖系數(shù)的二次回歸方程：

Y1=1.414 280+0.001 072x1-0.030 090x2+0.398 823x3-0.016 274x4+0.224 442x5+0.037 415x1x2+0.035 269x1x3+0.036 119x1x4-0.019 207x1x5+0.016 060x2x3-0.049 592x2x4-0.002 236x2x5-0.024 230x3x4+0.022 937x3x5-0.002 875x4x5-0.038 994x21+0.001 120x22-0.113 775x23-0.003 998x24-0.035 254x25。

分析結(jié)果（表3）表明，線性項x3、x4對增殖系數(shù)具有極顯著影響，線性項x5對增殖系數(shù)具有顯著影響，由F（x3）>F（x4）>F（x5）>F（x2）>F（x1）可知，5種大量元素濃度對增殖系數(shù)的影響程度為KH2PO4>NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>MgSO4·7H2O>K2SO4。具體影響（圖1）如下： KH2PO4、Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數(shù)與增殖系數(shù)呈線性正相關(guān)（圖1C；圖1E），相關(guān)系數(shù)分別為0.398 823與0.224 442；NH4NO3濃度倍數(shù)與增殖系數(shù)呈線性負相關(guān)（圖1D），相關(guān)系數(shù)為-0.016 274；K2SO4、MgSO4·7H2O濃度倍數(shù)與增殖系數(shù)無顯著相關(guān)性（圖1A、圖1B）。

取F值＞1.5的二元二次項分析各因素間的交互作用與對應響應曲面（圖2）。比較F值大小可知，x1x2、x1x3、x1xiQpEOpm0Pdu9NRAwmbSco02ONOfP4j2cipENJgXQAQY=4和x2x4這4項對增殖系數(shù)的影響程度為：x2x4＞x1x3＞x1x4＞x1x2（表3），即MgSO4·7H2O與NH4NO3的交互作用＞K2SO4與KH2PO4的交互作用＞K2SO4與NH4NO3的交互作用＞K2SO4與MgSO4·7H2O的交互作用。影響如下：（1）K2SO4與MgSO4·7H2O濃度比保持為1∶1時，試管苗增殖系數(shù)未見明顯變化；但低濃度K2SO4與高濃度MgSO4·7H2O相互作用會導致增殖系數(shù)下降（圖2A）。（2）K2SO4與KH2PO4濃度同時升高，增殖系數(shù)先上升后下降，且增殖系數(shù)受KH2PO4濃度影響較大（圖2B）。（3）K2SO4與NH4NO3兩者濃度同時升高，增殖系數(shù)逐漸下降且受NH4NO3濃度影響較大；低濃度NH4NO3可以使增殖系數(shù)保持較高水平（圖2C）。（4）當MgSO4·7H2O與NH4NO3濃度同時升高時，試管苗增殖系數(shù)逐漸降低，而高濃度MgSO4·7H2O與低濃度NH4NO3相互作用時增殖系數(shù)可達最高值（圖2D）。

2.2 平均株高模型建立與分析

以平均株高為Y2，根據(jù)Design-Expert 12.0軟件擬合試驗處理，得到株高的二次回歸方程：

Y2=2.998 730-0.263 603x1+0.588 062x2+0.264 487x3-0.161 580x4+0.462 537x5-0.007 257x1x2+0.135 470x1x3+0.037 222x1x4-0.031 871x1x5+0.097 298x2x3-0.021 955x2x4-0.046 501x2x5-0.119 603x3x4-0.031 871x3x5-0.042 601x4x5-0.027 184x21-0.178 435x22-0.053 012x23+0.028 309x24+0.000 039x25。

分析結(jié)果（表4）表明，線性項x3、x4、x5對株高均有極顯著影響，二次項x1x3對株高有顯著影響。由F（x4）>F（x5）>F（x3）>F（x1）>F（x2）可知，5種大量元素濃度對平均株高的影響程度為NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>KH2PO4>K2SO4>MgSO4·7H2O。具體影響如下：（1）KH2PO4、Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數(shù)與株高呈線性正相關(guān)（圖3C；圖3E），相關(guān)系數(shù)分別為0.264 487與0.462 537；NH4NO3濃度倍數(shù)與株高呈線性負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.161 580（圖3D）；K2SO4與MgSO4·7H2O濃度倍數(shù)與株高無顯著相關(guān)性（圖3A、圖3B）。（2）K2SO4與KH2PO4濃度倍數(shù)的交互作用與株高呈線性正相關(guān)（圖3F），相關(guān)系數(shù)為0.135 470。

取F值＞1.0的二元二次項分析交互作用與響應曲面。比較F值大小可知，x1x3、x2x3、x2x5和x3x4這4項對株高的影響程度為：x1x3＞x3x4＞x2x3＞x2x5（表4），即K2SO4與KH2PO4的交互作用＞KH2PO4與NH4NO3的交互作用＞MgSO4·7H2O與KH2PO4的交互作用＞MgSO4·7H2O與Ca（NO3）2·4H2O的交互作用。影響如下：（1）當K2SO4與KH2PO4濃度同時升高時，株高無明顯變化，當K2SO4濃度較高且KH2PO4濃度較低時，株高呈下降趨勢（圖4A）。（2）當MgSO4·7H2O濃度倍數(shù)為0.5～1.8倍時，株高隨KH2PO4濃度升高而上升；當濃度倍數(shù)在1.8～3.0倍時，株高隨KH2PO4濃度升高而下降（圖4B）。（3）MgSO4·7H2O濃度倍數(shù)在0.5～2.0倍時，株高隨Ca（NO3）2·4H2O濃度升高而上升；當濃度倍數(shù)在2.0～3.0倍時，株高隨Ca（NO3）2·4H2O濃度升高而下降（圖4C）。（4）當KH2PO4濃度升高、NH4NO3濃度下降時，株高呈上升趨勢并在KH2PO4濃度倍數(shù)為3.0倍、NH4NO3濃度倍數(shù)為0.5倍時達到最高值（圖4D）。

2.3 平均莖長模型建立與分析

以平均莖長為Y3，根據(jù)Design-Expert 12.0軟件擬合試驗處理，得到莖長的二次回歸方程：

Y3=1.301 670+0.148 644x1-0.196 973x2+0.071 288x3-0.193 460x4+0.116 001x5+0.060 904x1x2+0.062 311x1x3+0.005 765x1x4+0.009 485x1x5+0.020 522x2x3-0.023 159x2x4+0.021 980x2x5-0.050 456x3x4+0.023 133x3x5+0.002 436x4x5-0.027 867x12+0.008 299x22-0.028 877x32-0.035 352x42-0.042 483x52。

分析結(jié)果（表5）表明，線性項x3、二次項x1x2和x1x3對平均莖長具有極顯著影響，線性項x4、二次項x3x4、x25對莖長具有顯著影響。由F（x3）>F（x4）>F（x5）>F（x2）>F（x1）可知，5種大量元素濃度對平均莖長的影響程度為KH2PO4>NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>MgSO4·7H2O>K2SO4。具體影響如下：（1）KH2PO4濃度倍數(shù)與莖長呈正線性相關(guān)（圖5C），相關(guān)系數(shù)為0.071 288；NH4NO3濃度倍數(shù)與莖長呈負線性相關(guān)（圖5D），相關(guān)系數(shù)為-0.193 460；K2SO4、MgSO4·7H2O濃度倍數(shù)與莖長無顯著相關(guān)性（圖5A、圖5B）。（2）K2SO4與MgSO4·7H2O濃度倍數(shù)的交互作用與莖長呈正線性相關(guān)（圖5F），相關(guān)系數(shù)為0.060 904；K2SO4與KH2PO4濃度倍數(shù)的交互作用與莖長呈正線性相關(guān)（圖5G），相關(guān)系數(shù)為0.062 311；NH4NO3與KH2PO4濃度倍數(shù)的交互作用與莖長呈負線性相關(guān)（圖5H），相關(guān)系數(shù)為-0.050 456。（3）Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數(shù)對莖長無顯著影響（圖5E），但其平方值對莖長具有顯著影響，相關(guān)系數(shù)為-0.042 483，莖長隨Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數(shù)增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

取F值＞3.0的二元二次項分析交互作用與響應曲面。比較F值大小可知，x1x2、x1x3、x3x4和x3x5這4項交互作用對莖長的影響程度順序為：x1x3＞x1x2＞x3x4＞x3x5，即K2SO4與KH2PO4的交互作用＞K2SO4與MgSO4·7H2O的交互作用＞KH2PO4與NH4NO3的交互作用＞KH2PO4與Ca（NO3）2·4H2O的交互作用。具體影響如下：（1）K2SO4與MgSO4·7H2O濃度為1∶1且同時升高時，莖長先下降后升高（圖6A）。（2）K2SO4與KH2PO4濃度同時增加時，莖長上升，在兩者同時達到3.0倍時莖長達到最高值（圖6B）。（3）KH2PO4與NH4NO3濃度同時升高時，莖長先升高后下降；當KH2PO4處于高濃度且NH4NO3處于低濃度時，試管苗莖長最高（圖6C）。（4）KH2PO4與Ca（NO3）2·4H2O濃度同時升高時，莖長隨之升高；當KH2PO4濃度較高且Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數(shù)約為3.0倍時，莖長達到最高值（圖6D）。

2.4 WPM中的5種大量元素配方優(yōu)化及驗證

通過Design-Expert 12.0建立模型，將皇冠牡丹試管苗增殖系數(shù)目標設(shè)為max，重要程度為5（+++++）；莖長目標設(shè)為max，重要程度為4（++++）；株高目標設(shè)為max，重要程度為3（+++）；葉片數(shù)目標設(shè)為max，重要程度為2（++）。根據(jù)模型分析結(jié)果，可得出適宜皇冠牡丹增殖培養(yǎng)的WPM中的5種大量元素的最佳濃度倍數(shù)分別為x1=2.28、x2=2.45、x3=2.83、x4=0.50、x5=3.53，即K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3與Ca（NO3）2·4H2O的質(zhì)量濃度分別為2 257 mg/L、907 mg/L、481 mg/L、200 mg/L與1 963 mg/L，此時培養(yǎng)基中離子濃度分別為NO-3 19.13 mmol/L，NH+4 2.50 mmol/L，Ca2+ 8.31 mmol/L，K+ 29.44 mmol/L，Mg2+ 3.68 mmol/L，PO3-4 3.53 mmol/L，SO2-4 16.63 mmol/L，并通過模型預測出在該條件下皇冠牡丹的增殖系數(shù)、株高、莖長與單株葉片數(shù)分別為2.24、4.32 cm、1.64 cm、5.31張。使用該配方進行驗證試驗（圖7），得到皇冠牡丹的增殖系數(shù)、株高、莖長與單株葉片數(shù)分別為2.43、4.62 cm、1.30 cm、6.75張，除莖長稍低外，其余指標均高于預測值，并顯著優(yōu)于對照組（1.80、3.84 cm、1.32 cm、4.32張），這說明該模型可信，本研究得出的5種大量元素的最佳濃度可以用于皇冠牡丹的增殖培養(yǎng)。

3 討論

3.1 單因素條件對皇冠牡丹增殖和生長的影響

在對植物進行離體培養(yǎng)時，植物生長發(fā)育所需養(yǎng)分主要來源于培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基的成分與濃度對植物有重要影響[17]。本研究結(jié)果表明，WPM中的5種大量組分中，KH2PO4、NH4NO3與Ca（NO3）2·4H2O對牡丹試管苗的增殖效果有顯著或極顯著影響，而MgSO4·7H2O與K2SO4對牡丹試管苗的增殖效果無明顯影響。

KH2PO4可同時為植物提供磷、鉀2種大量元素，在WPM、MS與DKW等植物培養(yǎng)基中均有添加，增加KH2PO4用量會促進植物生物量的累積[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著KH2PO4濃度上升，試管苗的增殖系數(shù)、株高與莖長明顯提高，481 mg/L（2.83倍）KH2PO4為皇冠牡丹試管苗增殖最適濃度，而高濃度KH2PO4雖然會促進牡丹試管苗株高與莖長增加，但同時會降低增殖系數(shù)與葉片數(shù)。多數(shù)研究結(jié)果表明，不同植物適宜的KH2PO4濃度差異顯著，蘋果矮化砧木SH6繼代培養(yǎng)的最適濃度為175 mg/L[19]，杏（Prunus armeniaca）試管苗培養(yǎng)的最適KH2PO4濃度為125 mg/L[12]，而油松（Pinus tabuliformis）成熟離體胚不定芽誘導所需最適KH2PO4濃度為340 mg/L[20]。此外，同種植物的不同品種適宜的KH2PO4濃度也存在較大差異，如在使用MS的基礎(chǔ)上，KH2PO4濃度對白鶴芋屬（Spathiphyllum）不同品種增殖系數(shù)的影響存在差異[21]。因此，皇冠牡丹試管苗增殖階段的最佳KH2PO4質(zhì)量濃度為481 mg/L（2.83倍），但對于其他牡丹品種還需要根據(jù)實際情況具體分析。

鈣元素在細胞分裂、細胞壁形成和分生組織生長過程中是非常重要的[22]，前人研究發(fā)現(xiàn)高濃度Ca2+對牡丹試管苗的增殖效果有促進作用，將MS培養(yǎng)基中CaCl2濃度提升至原濃度的2倍可顯著提高Mme de Vatry牡丹試管苗的增殖系數(shù)，并減輕莖尖壞死和玻璃化程度[6]。然而，不同牡丹品種的最適鈣鹽濃度具有較大差異，同樣以WPM作為增殖培養(yǎng)基，正午牡丹的最適Ca（NO3）2·4H2O濃度為1 668 mg/L（3.00倍），此時試管苗的增殖系數(shù)可達到3.0，子代腋芽較為粗壯[8]；而鳳丹牡丹的最適Ca（NO3）2濃度為1 544 mg/L（4.00倍），此時增殖系數(shù)可達3.07[9]，這可能是由牡丹品種間基因型不同所致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Ca（NO3）2·4H2O濃度升高，皇冠牡丹試管苗的增殖系數(shù)與莖長呈先升高后下降的趨勢，而株高則持續(xù)上升，最佳Ca（NO3）2·4H2O質(zhì)量濃度為1 963 mg/L（3.53倍），在該條件下試管苗較為健壯，分枝與莖葉數(shù)量較對照顯著提高，且莖尖壞死現(xiàn)象得到有效緩解，與前人研究結(jié)果一致。因此，在一定范圍內(nèi)提高WPM中Ca（NO3）2·4H2O濃度是提高牡丹試管苗增殖效果的有效途徑，而其具體的作用機理也值得后續(xù)研究深入探索。

3.2 交互作用對皇冠牡丹試管苗有增殖和生長的影響

本研究結(jié)果顯示，K2SO4與KH2PO4、K2SO4與MgSO4·7H2O、KH2PO4與NH4NO3的交互作用對試管苗增殖效果影響顯著或極顯著。因電荷存在動態(tài)平衡，培養(yǎng)基中大量元素間的交互作用實則為離子間的交互作用[23]，因此本研究以分析離子間的交互作用與元素對植物的影響為主。

K2SO4與KH2PO4的交互作用對株高、莖長均有顯著或極顯著影響，當二者濃度同時增大時，增殖系數(shù)呈先升高后下降的趨勢，株高與莖長呈升高趨勢。因二者的陽離子相同，其交互作用實則為SO2-4與PO3-4間的交互作用，SO2-4提供硫元素，含硫氨基酸不僅是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要成分，還是細胞內(nèi)某些化合物合成的介質(zhì)之一[24]；PO3-4提供磷元素，磷是植物必需的大量元素，參與磷脂、核酸、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和輔酶等大分子合成[25]。已有研究結(jié)果表明，施磷能顯著提高牡丹植株葉片的葉綠素含量并促進光合作用[26]，而硫是植物光合作用過程中的重要組分，二者均與光合作用有關(guān)；Misson等[27]發(fā)現(xiàn)，在低磷環(huán)境下植物會加大對硫酸鹽的吸收轉(zhuǎn)運以合成硫脂，而硫脂可以在一定程度上代替磷脂，說明硫、磷元素在功能上存在重疊性，存在相互影響。目前關(guān)于SO2-4與PO3-4在植物體內(nèi)的交互作用尚未見報道，但從本研究結(jié)果可以看出二者存在協(xié)同的交互作用，適宜的SO2-4與PO3-4濃度比會促進試管苗的增殖。但本研究也發(fā)現(xiàn)，當二者濃度同時超過2.50倍后，增殖系數(shù)與葉片數(shù)會出現(xiàn)下降趨勢，這可能是過高的離子濃度對植物產(chǎn)生了毒害作用。因此，在提高培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)濃度以促進試管苗增殖的過程中，應注意保持培養(yǎng)基中離子濃度平衡，避免過高的濃度對植物生長產(chǎn)生負面影響。

本研究結(jié)果顯示，K2SO4與MgSO4·7H2O的交互作用對莖長有極顯著影響，當兩者濃度同時上升時，莖長呈先下降后上升的趨勢。已有研究結(jié)果表明鉀元素與鎂元素存在交互作用，高濃度鉀會抑制植物對鎂的吸收，并導致植物因缺鎂而生長不良[28]。這可能與二者相似的化學性質(zhì)產(chǎn)生的拮抗作用有關(guān)[29]，而對細胞膜上相同轉(zhuǎn)運蛋白的競爭是二者產(chǎn)生拮抗作用的主要原因[30]，且鉀、鎂間的交互作用會影響植物對其他養(yǎng)分如氮、磷、鈣等的積累[31-32]。本研究中當K2SO4與MgSO4·7H2O濃度倍數(shù)介于0.5～2.0時，莖長呈下降趨勢，這與前人研究發(fā)現(xiàn)的鉀、鎂元素間的拮抗作用相符合；而當二者濃度倍數(shù)大于2.0后，莖長呈上升趨勢，這可能是由于更高濃度的鉀、鎂元素能抵消一部分拮抗作用對試管苗產(chǎn)生的負面影響。因此，在改良培養(yǎng)基中大量元素配方時應重視礦質(zhì)元素間的平衡關(guān)系，盡量避免鉀、鎂元素間產(chǎn)生拮抗作用，而關(guān)于鉀、鎂元素在牡丹體內(nèi)的作用機理則需要進一步研究。

本研究結(jié)果顯示，KH2PO4與NH4NO3間的交互作用對莖長有顯著影響，當KH2PO4濃度上升、NH4NO3濃度下降時，莖長呈升高趨勢。前人研究發(fā)現(xiàn)植物對二者需求的差異可能與基因型、統(tǒng)計方式和使用濃度范圍有關(guān)[33-35]。Akin等[11]在對榛子（Corylus heterophylla）所使用的DKW培養(yǎng)基中的離子濃度進行響應面法優(yōu)化時也發(fā)現(xiàn)相似情況，即當KH2PO4為高濃度、NH4NO3為低濃度時，榛子Wepster能得到較高的芽質(zhì)量，榛子Dorris和Wepster能達到理想芽長。這可能是由于NH4NO3與KH2PO4在產(chǎn)生交互作用時，隨著兩者濃度升高，NH4NO3與Ca（NO3）2·4H2O同時產(chǎn)生了反應，而Ca（NO3）2·4H2O和NH4NO3同時為試管苗提供氮元素，降低NH4+與NO-3比值能夠顯著促進牡丹試管苗增殖[7-9]，本研究據(jù)此優(yōu)化得出結(jié)果，將NH4NO3濃度降低為基本W(wǎng)PM中濃度的0.50倍后，增殖效果得到顯著提升，與前人研究結(jié)果相似。

3.3 銨態(tài)氮（NH+4-N）和硝態(tài)氮（NO-3-N）濃度比值對皇冠牡丹增殖的影響

氮是植物生長過程中需求量最大的礦質(zhì)元素，是組成蛋白質(zhì)和核酸的必要成分。WPM為木本植物專用培養(yǎng)基[36]，供給植物的主要氮源為銨態(tài)氮（NH+4-N）和硝態(tài)氮（NO-3-N），其中NH4NO3提供NH+4-N，NH4NO3和Ca（NO3）2·4H2O共同提供NO-3-N。二者雖共同提供氮元素，但對植物生長的作用存在差異，關(guān)于培養(yǎng)基中NH+4-N與NO-3-N的濃度比值對試管苗增殖效果的影響已有諸多研究報道，結(jié)果顯示，較低的NH+4-N與NO-3-N的濃度比會促進試管苗的增殖與生長[11， 37-40]。在牡丹研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，例如Li等[7]通過降低MS培養(yǎng)基中NH+4-N與NO-3-N濃度比值以促進牡丹試管苗增殖，而后有試驗通過增加培養(yǎng)基中Ca（NO3）2·4H2O濃度，在NH+4-N與NO-3-N的濃度比值降低的同時提高培養(yǎng)基中Ca2+的濃度，顯著提高了牡丹試管苗的增殖效果[8-9]。這表明降低培養(yǎng)基中NH+4-N與NO-3-N的濃度比值有利于牡丹試管苗的增殖，這可能是由于高濃度NH4+會促進植物吸收過多水分，從而導致試管苗枝條壞死、存活率降低[40-41]，同時較低的NH+4-N與NO-3-N的濃度比值可以更好地緩沖培養(yǎng)基的pH，減少培養(yǎng)基pH波動對試管苗的影響[42]。本研究也得到類似結(jié)果，將Ca（NO3）2·4H2O濃度提升至3.50倍，NH4NO3降低至0.50倍后，試管苗增殖系數(shù)得到顯著提升，并且莖尖壞死現(xiàn)象得到緩解。綜上可見，WPM中原有的NH+4-N與NO-3-N的濃度比值無法滿足牡丹試管苗的增殖需要，在一定范圍內(nèi)提高培養(yǎng)基中Ca（NO3）2·4H2O濃度并降低NH4NO3濃度，是促進皇冠牡丹試管苗增殖生長的有效途徑。當然，不同牡丹品種的適宜濃度存在較大差異，關(guān)于NH+4-N與NO-3-N的濃度比值對牡丹試管苗產(chǎn)生影響的機理研究還尚在探索階段，還需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究基于響應面法，優(yōu)化得到皇冠牡丹增殖培養(yǎng)專用WPM大量元素配方[K2SO4 2 257 mg/L、MgSO4·7H2O 907 mg/L、KH2PO4 481 mg/L、NH4NO3 200 mg/L、Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L]，建立了高效的皇冠牡丹增殖培養(yǎng)體系，在該條件下試管苗的增殖效率（增殖系數(shù)2.43、株高4.62 cm、莖長1.30 cm、葉片數(shù)6.75張）得到顯著提高。

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（責任編輯：陳海霞）