ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4對胃癌前病變進展的預測價值

背景：目前臨床上尚無有效預測胃癌前病變進展或篩查早期胃癌的生物學標志物。目的：研究腺苷酸環(huán)化酶7（ADCY7）、G蛋白偶聯(lián)受體GPR86、N?甲基?D?天冬氨酸離子能谷氨酸受體2D（GRIN2D）、G蛋白信號調(diào)節(jié)因子4（RGS4）在不同胃黏膜病變中的表達及其對胃癌前病變進展的預測價值。方法：應用免疫組化法、real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在Correa級聯(lián)各階段（包括慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、低級別和高級別上皮內(nèi)瘤變、黏膜層和黏膜下層早期胃癌）以及胃癌與相應癌旁組織間的表達差異。結(jié)果：ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在胃炎、上皮內(nèi)瘤變、早期胃癌中的表達呈遞增趨勢，除GRIN2D在上皮內(nèi)瘤變與早期胃癌中的表達無明顯差異外，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均lt;0.001）。GPR86、GRIN2D mRNA和蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁gt;5 cm組織（P均lt;0.05）；RGS4蛋白在胃癌組織中的表達高于癌旁gt;5 cm組織，其mRNA表達趨勢則相反（P均lt;0.05）；ADCY7僅蛋白表達在胃癌與癌旁gt;5 cm組織間差異顯著（Plt;0.05）。結(jié)論：ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在Correa級聯(lián)各階段以及胃癌與相應癌旁組織間的表達變化提示其參與了胃癌前病變的發(fā)生、發(fā)展，可能具有預測胃癌前病變進展的價值。

關鍵詞 胃腫瘤； Correa級聯(lián)； 癌前病變； 早期胃癌； 生物學標記

ADCY7， GPR86， GRIN2D， and RGS4 for Predicting Progression of Gastric Precancerous Lesions LI Yang1， NIAN Yuanyuan2， MENG Xianmei2. 1Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou， Inner Mongolia Autonomous Region （014040）; 2Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou， Inner Mongolia Autonomous Region

Correspondence to： MENG Xianmei， Email： mxmxhk@163.com

Background： Currently， there are no effective biomarkers for predicting the progression of gastric precancerous lesions or screening early gastric cancer in clinical practice. Aims： To explore the expressions of adenylate cyclase 7 （ADCY7）， G protein?coupled receptor GPR86， glutamate receptor， ionotropic， N?methyl D?aspartate 2D （GRIN2D） and regulator of G protein signaling 4 （RGS4） in various gastric mucosal lesions and their predictive value for progression of gastric precancerous lesions. Methods： Expressions of ADCY7， GPR86， GRIN2D， and RGS4 were detected by immuno?histochemistry， real?time PCR and Western blotting in Correa cascade （chronic non?atrophic gastritis， chronic atrophic gastritis， low? and high?grade intraepithelial neoplasia， and mucosal and submucosal early gastric cancer） and cancerous and para?cancerous tissues， among which， the differences in expression levels of these four factors were analyzed. Results： There was an increasing tendency in expression levels of ADCY7， GPR86， GRIN2D， and RGS4 from gastritis， intra?epithelial neoplasia to early gastric cancer. Except for GRIN2D expression between intraepithelial neoplasia and early gastric cancer， significant differences could be observed in any two groups （all Plt;0.001）. Both mRNA and protein expression levels of GRP86 and GRIN2D were significantly higher in cancerous tissue than in adjacent tissue gt;5 cm （all Plt;0.05）. Protein expression of RGS4 was significantly higher in cancerous tissue than in adjacent tissue gt;5 cm， but its mRNA expression presented an opposite trend （all Plt;0.05）. Significant difference between cancerous tissue and adjacent tissue gt;5 cm in ADCY7 expression was only existed at protein level （Plt;0.05）. Conclusions： Alterations of the expression levels of ADCY7， GPR86， GRIN2D， and RGS4 in Correa cascade and cancerous and para?cancerous tissues suggest that they are involved in the occurrence and development of gastric precancerous lesions， and might be used as predictors for progression of gastric precancerous lesions.

Key words Stomach Neoplasms; Correa Cascade; Precancerous Lesions; Early Gastric Cancer; Biological Markers

據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，胃癌每年新發(fā)病例數(shù)超過108萬例，每年約有77萬人死于胃癌[1]。目前普遍認可的胃癌發(fā)生模式為Correa級聯(lián)，即慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）→腸化生→低級別上皮內(nèi)瘤變（low?grade intraepithelial neoplasia， LGIN）→高級別上皮內(nèi)瘤變（high?grade intraepithelial neoplasia， HGIN）→胃癌[2]，其中胃黏膜萎縮、腸化生、LGIN、HGIN屬于胃癌前病變[3]。胃癌前病變的進展是一個緩慢的過程，最終進展至胃癌的概率較低[4]。

目前臨床上對于胃癌前病變進展至胃癌的監(jiān)測依賴于胃鏡聯(lián)合活檢病理檢查，費用較高且患者依從性低。因此，探索胃癌前病變進展和早期胃癌（early gastric cancer， EGC）篩查的生物學標志物具有重要臨床價值，但目前尚無有效的預測因子可用于臨床實踐。通過數(shù)據(jù)庫檢索和文獻復習，本研究團隊發(fā)現(xiàn)補體成分5a受體1（complement component 5a receptor 1， C5aR1）、緩激肽受體B1（bradykinin receptor B1， BDKRB1）、低氧誘導因子?1α（hypoxia?inducible factor?1α， HIF?1α）、G0/G1開關調(diào)節(jié)蛋白2（G0/G1 switch regulatory protein 2， G0S2）、腺苷酸環(huán)化酶7（adenylate cyclase 7， ADCY7）、G蛋白偶聯(lián)受體（G protein?coupled receptor）GPR86、N?甲基?D?天冬氨酸離子能谷氨酸受體2D（glutamate receptor， ionotropic， N?methyl D?aspartate 2D， GRIN2D）、G蛋白信號調(diào)節(jié)因子4（regulator of G protein signaling 4， RGS4）在炎癥性疾病或某些腫瘤組織中高表達，但這些因子在胃癌組織中的表達情況及其在胃癌前病變進展中的作用鮮有報道。本研究前期預實驗應用免疫組化技術檢測了上述因子在慢性非萎縮性胃炎（chronic non?atrophic gastritis， CNAG）、CAG、LGIN、HGIN、EGC（黏膜層）和EGC（黏膜下層）組織中的表達情況，結(jié)果顯示ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在Correa級聯(lián)各階段的表達差異對胃癌前病變進展可能具有預測價值。故本研究進一步采用免疫組化法、real?time PCR、蛋白質(zhì)印跡法檢測ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在Correa級聯(lián)各階段以及胃癌和相應癌旁1～3 cm、gt;5 cm組織中的表達情況，探索其在胃癌前病變發(fā)生、發(fā)展中的作用以及對胃癌前病變進展的預測價值，以期為臨床診療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、標本來源

實驗標本采集自2021年8月—2023年9月包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院普外科和內(nèi)蒙古自治區(qū)消化病研究所收治的不同胃黏膜病變患者。免疫組化實驗入組標準：年齡gt;18歲，性別不限，內(nèi)鏡+活檢病理診斷為CNAG、CAG、LGIN、HGIN、EGC（黏膜層）或EGC（黏膜下層）。Real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法實驗所用新鮮組織標本取自胃癌和相應癌旁1～3 cm、gt;5 cm組織；入組標準：年齡gt;18歲，性別不限，外科手術標本病理診斷為胃腺癌（Ⅰ/Ⅱ期），癌組織切緣（2 cm/3 cm/4 cm）未見癌，無遠處轉(zhuǎn)移。排除標準：①自身免疫病；②其他部位原發(fā)癌；③有化療或放療史；④因慢性病需長期服藥；⑤有精神類疾病、溝通障礙或意識不清無法溝通。研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準（批準文號：ZX?067），標本采集獲得患者知情同意。

二、主要試劑

通用SP檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4抗體（Signal?way Antibody、Affinity Biosciences、Bioss Antibodies、Abcam Limited.）； UNlQ?10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；Maxima反轉(zhuǎn)錄酶（Thermo Fisher Scientific）；2×SG Fast qPCR Master Mix（High Rox; BBI Life Sciences Corpo?ration）；RIPA蛋白質(zhì)裂解液、ECL超敏發(fā)光液（北京普利萊基因技術有限公司）。

三、實驗方法

1. 免疫組化染色：采用免疫組化SP法檢測ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在CNAG、CAG、LGIN、HGIN、EGC（黏膜層）和EGC（黏膜下層）組織中的表達。組織切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復等處理后，4 ℃一抗（GPR86、RGS4： 1：150; ADCY7： 1：70; GRIN2D： 1：50）孵育過夜；復溫、PBS沖洗后二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，光學顯微鏡下觀察。

結(jié)果分析：由2名有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師雙盲觀察、分析染色結(jié)果，結(jié)果不一致時由第三名病理醫(yī)師分析確定。每張切片于光學顯微鏡下隨機選擇5個高倍視野（×400），按陽性細胞比例和著色強度進行評分，結(jié)果取均值。陽性細胞比例：≤5%，0分（陰性）；5%～30%，1分（弱陽性）；30%～60%，2分（中等陽性）；gt;60%，3分（強陽性）。著色強度：無色，0分；淡棕黃，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。免疫組化評分為2項得分的乘積：0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9分為強陽性（+++）。

2. Real?time PCR：采用real?time PCR法檢測ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在胃癌和相應癌旁1～3 cm、gt;5 cm組織中的表達。提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后在ABI 7500熒光定量PCR儀中行real?time PCR擴增，引物序列由Primer Premier 5.0軟件設計（表1）。2-??Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

3. 蛋白質(zhì)印跡法：采用蛋白質(zhì)印跡法檢測ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在胃癌和相應癌旁1～3 cm、gt;5 cm組織中的表達。提取組織總蛋白，行蛋白定量后配置上樣緩沖液，ADCY7、GRIN2D以7.5% SDS?PAGE凝膠進行電泳，GPR86、RGS4以10% SDS?PAGE 凝膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后分別孵育一抗、二抗，ECL發(fā)光液處理后顯影、定影，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達量以其條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。

四、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，應用GraphPad Prism 8軟件進行圖表制作。計數(shù)資料以例數(shù)和（或）百分率描述；計量資料以Shapiro?Wilk法行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布者以x±s描述，多組間比較采用單因素方差分析，非正態(tài)性數(shù)據(jù)或等級資料多組間比較采用Kruskal?Wallis H檢驗。Plt;0.05（real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法）或Plt;0.001（免疫組化法）為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、一般資料

本研究免疫組化實驗共納入256例Correa級聯(lián)不同階段的石蠟包埋胃黏膜組織標本，患者年齡18～89歲，其中男性129例，女性127例；病理診斷：CNAG 20例，CAG 42例，LGIN 48例，HGIN 50例，EGC（黏膜層）54例，EGC（黏膜下層）42例。Real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法實驗共納入6例新鮮胃腺癌外科手術標本，pTNM分期T2N0M0 1例，T3N0M0 2例，T3N1M0 3例。

二、Correa級聯(lián)不同階段免疫組化染色結(jié)果

免疫組化染色顯示，ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4均主要表達于細胞膜（圖1），四者在Correa級聯(lián)6個階段[CNAG、CAG、LGIN、HGIN、EGC（黏膜層）、EGC（黏膜下層）]中的表達總體差異均有統(tǒng)計學意義（H=87.391， Plt;0.001; H=98.483， Plt;0.001; H=81.050， Plt;0.001; H=119.578， Plt;0.001）。

Correa級聯(lián)不同階段兩兩比較結(jié)果：①ADCY7在EGC（黏膜層）、EGC（黏膜下層）中的表達高于CNAG（Z=-4.525， Plt;0.001; Z=-5.712， Plt;0.001）、LGIN（Z=-5.087， Plt;0.001; Z=-6.446， Plt;0.001），在HGIN、EGC（黏膜層）、EGC（黏膜下層）中的表達高于CAG（Z=-4.461， Plt;0.001; Z=-5.680， Plt;0.001; Z=-6.958， Plt;0.001）。

②GPR86在EGC（黏膜層）、EGC（黏膜下層）中的表達高于CNAG（Z=-6.025， Plt;0.001; Z=-6.993， Plt;0.001）、CAG（Z=-6.776， Plt;0.001; Z=-7.734， Plt;0.001），在EGC（黏膜下層）中的表達高于LGIN、HGIN（Z=-4.598， Plt;0.001; Z=-4.735， Plt;0.001）。

③GRIN2D在HGIN、EGC（黏膜層）、EGC（黏膜下層）中的表達高于CNAG（Z=-4.722， Plt;0.001; Z=-4.931， Plt;0.001; Z=-5.883， Plt;0.001）、CAG（Z=-5.513， Plt;0.001; Z=-5.860， Plt;0.001; Z=-6.962， Plt;0.001），在EGC（黏膜下層）中的表達高于LGIN（Z=-4.234， Plt;0.001）。

④RGS4在EGC（黏膜層）、EGC（黏膜下層）中的表達高于CNAG（Z=-5.046， Plt;0.001; Z=-5.015， Plt;0.001）、LGIN（Z=-5.334， Plt;0.001; Z=-5.329， Plt;0.001），在HGIN、EGC（黏膜層）、EGC（黏膜下層）中的表達高于CAG（Z=-6.603， Plt;0.001; Z=-8.511， Plt;0.001; Z=-8.589， Plt;0.001）。

基于上述分析結(jié)果，將CNAG和CAG合并為胃炎組，將LGIN和HGIN合并為上皮內(nèi)瘤變組，將EGC（黏膜層）和EGC（黏膜下層）合并為早癌組，ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4在三組中的表達總體差異均有統(tǒng)計學意義（H=69.011， Plt;0.001; H=94.282， Plt;0.001; H=71.392， Plt;0.001; H=105.269， Plt;0.001；表2）。兩兩比較結(jié)果顯示，GRIN2D在上皮內(nèi)瘤變與早癌中的表達差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.001），ADCY7、GPR86、RGS4在胃炎、上皮內(nèi)瘤變、早癌中的表達均依次遞增，組間差異有統(tǒng)計學意義（P均lt;0.001；表3）。

三、胃癌和相應癌旁組織real?time PCR、蛋白質(zhì)印跡法實驗結(jié)果

由于EGC病變直徑較小，且病理科需留取整塊

組織進行病理學評估，故此部分研究未能獲得新鮮早癌組織標本行real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法實驗，而是以新鮮外科手術標本中的胃癌和相應癌旁組織替代Correa級聯(lián)不同階段進行研究。

Real?time PCR檢測顯示，GPR86 mRNA在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁gt;5 cm組織，GRIN2D mRNA在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁gt;5 cm、癌旁1～3 cm組織，RGS4 mRNA在胃癌、癌旁1～3 cm組織中的相對表達量低于癌旁gt;5 cm組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P均lt;0.05）；ADCY7 mRNA在胃癌和相應癌旁組織中的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P均gt;0.05；圖2）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，ADCY7、RGS4蛋白在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁gt;5 cm組織，GPR86、GRIN2D蛋白在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁gt;5 cm、癌旁1～3 cm組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P均lt;0.05；圖3）。

討 論

我國胃癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分居第5位和第3位[5]。盡早發(fā)現(xiàn)胃癌前病變和EGC，是提高胃癌患者生存率和生活質(zhì)量的關鍵。尋找在胃癌前病變進展過程中有顯著表達變化的某種或某類生物學標志物以預測病變進展并予早期干預，是目前胃癌相關研究的熱點之一。本研究基于課題組前期預實驗結(jié)果，探討了ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4四個因子對胃癌前病變進展的預測價值。

本研究免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)ADCY7在Correa級聯(lián)進展過程中的表達呈遞增趨勢，蛋白質(zhì)印跡法檢測也提示其在胃癌組織中的表達高于相應癌旁gt;5 cm組織。ADCY7是腺苷酸環(huán)化酶家族的一員，該家族在細胞信號轉(zhuǎn)導和代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用，在腫瘤進展中亦扮演關鍵角色[6]。2021年發(fā)表的一項關于ADCY7在人類腫瘤中預后價值的泛癌分析顯示，ADCY7在多種人類癌癥（乳腺癌、肺鱗狀細胞癌等）中表達異常并與預后不良相關，其表達與錯配修復基因和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達、免疫細胞浸潤、免疫檢查點基因表達之間存在強相關性[7]。關于ADCY7在胃癌中的作用和具體信號通路，目前尚不清楚。本研究real?time PCR檢測顯示，胃癌和癌旁1～3 cm組織中的ADCY7 mRNA表達有高于癌旁gt;5 cm組織的趨勢，但差異并無統(tǒng)計學意義，可能與此部分實驗樣本量較小，或是存在其他相互作用的因子影響了胃癌組織中的ADCY7基因轉(zhuǎn)錄有關。

GPR86是在人類染色體3q24?3q25區(qū)域組成受體簇的6個密切相關的G蛋白偶聯(lián)受體之一[8]，研究顯示GPR86在信號轉(zhuǎn)導方面的作用較經(jīng)典G蛋白偶聯(lián)受體更廣泛、多樣[9]，其高表達與多條免疫相關通路，包括“B細胞受體信號通路”、“T細胞受體信號通路”、“自然殺傷細胞介導的細胞毒性”、“腸道IgA產(chǎn)生的免疫網(wǎng)絡”、“趨化因子信號通路”、“原發(fā)性免疫缺陷”等，以及多種腫瘤浸潤免疫細胞及其免疫功能有關，可能成為肺腺癌預后的潛在生物學標志物[10?11]。本研究免疫組化法、real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，從胃炎、上皮內(nèi)瘤變至早癌，GPR86表達依次遞增，從癌旁gt;5 cm、癌旁1～3 cm至胃癌組織，其mRNA和蛋白表達亦有遞增趨勢，提示其可能參與了胃癌前病變的進展并對病變進展具有預測價值。

GRIN2D屬于谷氨酰胺受體亞家族成員之一，既往相關研究主要聚焦于其作為神經(jīng)元離子通道蛋白，在神經(jīng)傳導、大腦發(fā)育和功能以及相關疾?。ㄈ绨l(fā)育性和癲癇性腦?。┲械淖饔肹12]。新近研究表明GRIN2D在多種癌癥組織中過表達，可能是惡性腫瘤相關信號通路失調(diào)的樞紐。Wang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，GRIN2D在胰腺導管腺癌細胞中高表達，可能具有原癌基因作用，上調(diào)GRIN2D表達可促進腫瘤生長和肝轉(zhuǎn)移。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)GRIN2D在肺腺癌組織和細胞中表達上調(diào)，敲低GRIN2D可通過抑制E2F信號通路抑制肺腺癌細胞的生長、遷移、糖酵解和糖異生。本研究免疫組化法、real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，GRIN2D mRNA和蛋白在胃癌組織中的表達高于相應癌旁gt;5 cm、1～3 cm組織，且其表達呈現(xiàn)隨Correa級聯(lián)進展而增高的趨勢，提示其或可用于胃癌前病變進展的監(jiān)測和早癌篩查。

RGS4屬于G蛋白信號調(diào)節(jié)因子家族成員，是G蛋白信號的負性調(diào)節(jié)因子，研究顯示其在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用[15?16]，且可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關。Xie等[17]的研究顯示，在乳腺癌組織標本中，正常乳腺上皮細胞的RGS4蛋白表達水平最高，上調(diào)內(nèi)源性RGS4表達可顯著抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲。而對膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌的研究則發(fā)現(xiàn)敲低RGS4可抑制腫瘤細胞生長或遷移、侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡[18?19]。本研究免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)RGS4表達隨Correa級聯(lián)進展而遞增，蛋白質(zhì)印跡法檢測也顯示RGS4蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于相應癌旁gt;5 cm組織，然而real?time PCR檢測卻發(fā)現(xiàn)RGS4 mRNA在胃癌和癌旁1～3 cm組織中的表達低于癌旁gt;5 cm組織，分析其原因，可能與Xie等[17]的研究指出的存在RGS4功能的翻譯后調(diào)節(jié)機制有關。本研究mRNA和蛋白水平實驗的樣本量較小且樣本來源與免疫組化實驗不同，可能也是造成實驗結(jié)果差異的原因之一。

綜上所述，ADCY7、GPR86、GRIN2D、RGS4四個因子在Correa級聯(lián)各階段以及胃癌與相應癌旁組織間的表達變化提示其參與了胃癌前病變的發(fā)生、發(fā)展。但本研究real?time PCR 和蛋白質(zhì)印跡法實驗樣本量小且未納入Correa級聯(lián)不同階段的胃黏膜病變進行研究，后續(xù)擬積累樣本量以完善實驗，進一步研究、驗證這些因子對胃癌前病變進展的預測價值。

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（本文編輯：蔣曉玲）

*基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目（2021GG0232）#Email： liyangjingbo@163.comamp;本文通信作者，Email： mxmxhk@163.com