基于非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析新生兒濾紙干血片中的乳清酸

摘要 建立了一種基于非衍生化的流動(dòng)注射串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)新生兒濾紙干血片中乳清酸（ORA）的方法。本方法采用負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行檢測(cè)，通過同位素內(nèi)標(biāo)定量，單次儀器分析時(shí)間僅需2 min，檢測(cè)ORA 的線性范圍為0.25～40 μmol/L，線性關(guān)系良好（R2gt;0.99），檢出限（S/N=3）為0.12 μmol/L?；旌蠈?shí)驗(yàn)中，混合基質(zhì)樣本與濾紙干血片（DBS）基質(zhì)樣本和溶劑基質(zhì)樣本的均值，差值百分比低于20%，表明本方法的基質(zhì)效應(yīng)不影響ORA 的準(zhǔn)確定量分析。將本方法用于實(shí)際DBS 樣本中ORA 的檢測(cè)，加標(biāo)回收率為101.4%～122.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.8%～13.3%，采用高低濃度轉(zhuǎn)換進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)評(píng)估了攜帶污染效應(yīng)。采用本方法對(duì)900 例正常新生兒DBS 臨床實(shí)際樣本進(jìn)行了檢測(cè)，分別以99.00%和1.00%百分位數(shù)的濃度值作為參考區(qū)間的上限值和下限值，初步獲得了基于本實(shí)驗(yàn)室新生兒人群DBS 中ORA 濃度的臨床診斷參考區(qū)間（1.10～1.52 μmol/L），為未來新生兒遺傳代謝疾病篩查診斷提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 非衍生化流動(dòng)注射串聯(lián)質(zhì)譜；乳清酸；濾紙干血片；新生兒；遺傳代謝疾??；篩查

遺傳代謝疾病（Inherited metabolic diseases， IMD）是指由于基因突變引起酶缺陷、細(xì)胞膜功能異?；蚴荏w缺陷，從而導(dǎo)致機(jī)體生化代謝紊亂，造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏而引起一系列臨床癥狀的疾病[1-3]。迄今發(fā)現(xiàn)的遺傳代謝疾病已經(jīng)超過1000 種，并且大多數(shù)疾病發(fā)生在新生兒早期，如果不及早發(fā)現(xiàn)并治療，可對(duì)新生兒造成不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重?fù)p害，如智力低下、終身殘疾，甚至死亡。目前，新生兒的遺傳代謝疾病篩查已成為全球出生缺陷綜合防治中最有效的手段之一[4-6]。

目前，臨床上最常用的篩查和診斷新生兒遺傳代謝病的方法主要是氣相質(zhì)譜法和串聯(lián)質(zhì)譜（Tandemmass spectrometry， MS/MS）法[7-9]。串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高靈敏性、高特異性及一次進(jìn)樣能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分析物等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為主流方法[10-11]。濾紙干血片（Dried blood spot， DBS）法早在20 世紀(jì)60 年代就已被用于新生兒疾病篩查[12]，其原理是將全血滴加在濾紙片上，干燥后得到干血斑，經(jīng)溶劑萃取后，通過熒光法和串聯(lián)質(zhì)譜法等分析干血斑中的待檢測(cè)組分，反映診斷結(jié)果，如代謝產(chǎn)物的含量和酶活性等。該方法主要應(yīng)用于代謝相關(guān)疾病的篩查、藥物動(dòng)力學(xué)研究以及新生兒疾病篩查等[13]。相比傳統(tǒng)的血樣采集方法， DBS 法具有制作簡(jiǎn)單、所需血量少和保存運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于遺傳代謝性疾病，代謝酶及代謝產(chǎn)物能較穩(wěn)定地存在于DBS 中，對(duì)代謝異常類疾病樣本進(jìn)行篩查分析時(shí)， DBS 法能較準(zhǔn)確地反映樣本中代謝酶或代謝產(chǎn)物的含量[14]。至今，基于串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)DBS 中氨基酸、游離及酰基肉堿等生物標(biāo)志物水平的技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)16～46 種遺傳代謝疾病的快速篩查與診斷[15-17]。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)IMD 疾病認(rèn)識(shí)的深入和新生物標(biāo)志物的擴(kuò)充，過去較難診斷的疾病的篩查和診斷已取得較大進(jìn)展[18-21]。典型案例是尿素循環(huán)障礙中的氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥（Carbamoyl phosphate synthetase deficiency， CPSD）和鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥（Ornithine transcarboxylase deficiency， OTCD）。CPSD 和OTCD 均以瓜氨酸為診斷標(biāo)志物，檢測(cè)時(shí)均表現(xiàn)為DBS 中瓜氨酸水平降低。對(duì)于瓜氨酸水平降低的新生兒，醫(yī)院檢驗(yàn)科或新生兒篩查中心一般都會(huì)召回并留取尿液，以尿中乳清酸（Orotic acid， ORA）水平進(jìn)行鑒別診斷[22-23]，ORA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。然而，采用氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)尿液中ORA，不僅需要增加衍生化步驟，而且還需要萃取、離心和濃縮等前處理步驟，操作復(fù)雜。此外，新生兒留尿困難，這也給疾病篩查和診斷帶來不便。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的DBS 中ORA 的檢測(cè)方法均存在樣品分析時(shí)間長(zhǎng)[24-25]、樣品前處理操作復(fù)雜[26-27]以及檢出限高[28-30]等問題；此外，由于國(guó)內(nèi)對(duì)DBS 中ORA 的檢測(cè)方法鮮有研究，因此無法獲取并建立相對(duì)應(yīng)的濃度參考區(qū)間，導(dǎo)致DBS中ORA 含量無法真正應(yīng)用于新生兒遺傳代謝疾病的臨床篩查與診斷。因此，迫切需要建立一種準(zhǔn)確、便捷和快速檢測(cè)DBS 中ORA 的非衍生化檢測(cè)方法，以建立濃度參考區(qū)間，提高對(duì)CPSD 和OTCD 的診斷效能，使患者盡早得到治療，這也符合新生兒疾病篩查的宗旨。

本研究基于非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑作為內(nèi)標(biāo)物，采用同位素內(nèi)標(biāo)定量和流動(dòng)注射進(jìn)樣方式，對(duì)新生兒DBS 中的ORA 進(jìn)行快速定量分析，并以此方法分析了來自本醫(yī)院的900 例新生兒DBS 樣本，初步建立了本實(shí)驗(yàn)室新生兒DBS 中ORA 濃度的參考區(qū)間，為未來新生兒疾病篩查提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

PerkinElemer Qsight 220MD 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（MS/MS，美國(guó)珀金埃爾默公司），包括質(zhì)譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、二元液相泵、Simplicity 3Q MD 軟件和質(zhì)譜系統(tǒng)報(bào)告軟件；Milli-Q plus 超純水儀（美國(guó)密理博公司）；微孔板恒溫振蕩器WZ80-2（美國(guó)賽默飛世爾公司）；XPE105 微量電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；用于切割直徑為3.2 mm 濾紙干血斑的手動(dòng)打孔器；V 型截底前處理用96 孔板（潔凈微孔板，無包被，丹麥NUNC 公司）；V 型底檢測(cè)用96 孔板（耐熱微孔板，無包被，丹麥NUNC 公司）；粘性微孔板封套及鋁箔制微孔板封套（美國(guó)珀金埃爾默公司）。

ORA（批號(hào)L910S06，含量99%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乳清酸-15N2（ORA-15N2，批號(hào)4-EJB-11-1，化學(xué)純度98%，同位素純度97%，加拿大TRC 公司）；甲醇、甲酸和乙腈（質(zhì)譜級(jí)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。濾紙采用國(guó)際通用Samp;S903 標(biāo)準(zhǔn)濾紙（美國(guó)沃特曼公司，卡片上印有3～5 個(gè)直徑10～12 mm 的圓圈，提示采血者滴血位置及采集的血滴應(yīng)盡量與所標(biāo)印的圓圈大小接近，保證足夠的血量）。全血樣本來自于上海市兒童醫(yī)院臨床檢驗(yàn)后剩余人源全血樣本。分離處理全血樣本得到紅細(xì)胞和血清，紅細(xì)胞用生理鹽水洗3 次，與血清混合調(diào)整使紅細(xì)胞壓積為50%～55%，測(cè)定此時(shí)血液中ORA 濃度作為本底值。

900 個(gè)未經(jīng)選擇的正常新生兒DBS 樣本來自于上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心，其中474 個(gè)（52.67%）為男性樣品， 426 個(gè)（47.33%）為女性樣品，平均年齡（天數(shù)）為4.62 d。本研究通過了上海市兒童醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)（批號(hào)：2022R112）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ORA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制稱取ORA 標(biāo)準(zhǔn)品1 mg 和ORA-15N2 1 mg，分別用超純水溶解并定容至10 mL，得到100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。使用時(shí)，取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液用超純水分別稀釋成250.0、125.0、62.5、37.5、25.0和12.5 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液加萃取液稀釋，得到55 μmol/L的ORA-15N2 內(nèi)標(biāo)中間液。將萃取液與內(nèi)標(biāo)中間液以110∶1（V/V）配制成ORA-15N2 內(nèi)標(biāo)工作液（稀釋后濃度為0.5 μmol/L）。

1.2.2 ORA標(biāo)準(zhǔn)品濾紙片和ORA標(biāo)準(zhǔn)品DBS、空白DBS的制備

ORA 標(biāo)準(zhǔn)品濾紙片的制備濾紙使用前于65℃烘箱中烘干1.5 h。分別取上述6 種濃度（250.0、125.0、62.5、37.5、25.0、12.5 μmol/L）的標(biāo)準(zhǔn)品工作液20 μL，添加到480 μL 萃取液中，混合均勻后，吸取50 μL 緩慢加到濾紙印圈中，待萃取液初步風(fēng)干后轉(zhuǎn)移至潔凈室，室溫干燥6 h，得到含有0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、40.0 μmol/L ORA 的標(biāo)準(zhǔn)品濾紙片。晾干后的濾紙片裝在潔凈防潮袋內(nèi)，在–20 ℃、相對(duì)濕度小于30%的環(huán)境中保存。

ORA 標(biāo)準(zhǔn)品DBS 的制備以同樣方法，將ORA 標(biāo)準(zhǔn)品工作液分別加入到480 μL 全血中，制備得到添加濃度分別為0.3、1.0 和10.0 μmol/L 的ORA 標(biāo)準(zhǔn)品DBS 樣本，用于混合實(shí)驗(yàn)、實(shí)際樣本分析和攜帶污染實(shí)驗(yàn)。

空白DBS 的制備取20 μL 超純水添加到480 μL 全血中，以同樣的方法制備得到空白干血片。

1.2.3 樣本前處理

待測(cè)樣本DBS 用直徑3 mm 打孔器取樣后，置于96 孔板中進(jìn)行前處理，每孔加入100 μL ORA 內(nèi)標(biāo)工作液，用粘性微孔板封套密封96 孔板，在45 ℃以750 r/min 振蕩孵育30 min，吸取80 μL 萃取工作液轉(zhuǎn)移至V 型底檢測(cè)板內(nèi)，覆蓋鋁膜，置于自動(dòng)進(jìn)樣器上，供質(zhì)譜分析。

1.2.4 流動(dòng)相與質(zhì)譜條件

進(jìn)樣方式采用流動(dòng)注射形式，進(jìn)樣量為10 μL。萃取液為含0.27 g/L 甲酸的甲醇-水（78∶22， V/V）。流動(dòng)相為含0.1%甲酸的乙腈-水（84∶16， V/V），使用可變流速程序，流速設(shè)置見表1。每個(gè)樣本測(cè)定時(shí)間為2 min，每針之間用甲醇-水（1∶1， V/V）滿針清洗2 次。

質(zhì)譜條件：負(fù)離子模式（ESI–），離子源溫度400 ℃，解離溫度250 ℃，噴霧電壓–3.5 kV，氣簾氣100 kPa，霧化氣250 kPa，干燥氣為氮?dú)?，碰撞氣為氬氣（純度?9.999%），檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

1.2.5 混合實(shí)驗(yàn)

在空白DBS 樣品經(jīng)樣品前處理后得到的提取液（90 μL）中加入ORA-15N2 內(nèi)標(biāo)中間液（10 μL），制成DBS 基質(zhì)樣本。同樣地，在90 μL 萃取液中加入10 μL ORA-15N2 內(nèi)標(biāo)中間液，制成溶劑基質(zhì)樣本?；旌匣|(zhì)樣本由DBS 基質(zhì)樣本和溶劑基質(zhì)樣本按照質(zhì)量比1：1 混合得到。通過上述混合實(shí)驗(yàn)得到3 種基質(zhì)樣本，進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算ORA 與其內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，用于評(píng)估方法的基質(zhì)效應(yīng)（ME）。如果1∶1 混合液樣本的響應(yīng)值與生物基質(zhì)樣本和純?nèi)芤簶颖卷憫?yīng)的均值相比，差值低于20%，證明基質(zhì)效應(yīng)不影響目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確定量分析[31]。

1.2.6 攜帶污染實(shí)驗(yàn)

分別取制作好的加標(biāo)濃度為低濃度（0.3 μmol/L）和高濃度（10 μmol/L）ORA 的DBS 實(shí)際樣本，按照1.2.3 節(jié)的方法進(jìn)行樣本前處理，得到低濃度和高濃度的萃取液樣品。低濃度標(biāo)本進(jìn)樣10 次，間隔進(jìn)樣高濃度樣本，反復(fù)循環(huán)10 次[31]。

1.2.7 方法學(xué)驗(yàn)證及判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and laboratory standards institute， CLSI）2017 年發(fā)布的《Newborn screening by tandem mass spectrometry》[3]、《MS/MS 技術(shù)在新生兒氨基酸酸、有機(jī)酸及脂肪酸氧化代謝障礙性疾病篩查中的應(yīng)用共識(shí)》[10]和《液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜臨床檢測(cè)方法的開發(fā)與驗(yàn)證》[31]中的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜儀器參數(shù)與流動(dòng)相、萃取液的優(yōu)化

為降低基質(zhì)效應(yīng)與質(zhì)譜儀器本身的質(zhì)量歧視效應(yīng)，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。作為新生兒疾病串聯(lián)質(zhì)譜篩查的內(nèi)標(biāo)，不僅要滿足常規(guī)內(nèi)標(biāo)物的技術(shù)要求，也要考慮內(nèi)標(biāo)物獲得的難易程度、成本等因素?；谏鲜鲈瓌t，以穩(wěn)定同位素15N 標(biāo)記的ORA-15N2 作為ORA 內(nèi)標(biāo)[30]。針對(duì)ORA 分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，首先通過全掃描模式（Full MS）基本確定其母離子和定量子離子，再采用MRM 模式對(duì)入口電壓、碰撞室入口電壓及碰撞電壓進(jìn)行調(diào)整與優(yōu)化，優(yōu)化后的參數(shù)見表2。

通常采用甲醇或甲醇-水混合溶液從DBS 中萃取氨基酸和?；鈮A，有時(shí)添加少量（≤1%）有機(jī)酸（如乙酸或甲酸）促進(jìn)分析物電離，也可采用乙腈-水混合溶液。萃取液中加入待測(cè)分析物的內(nèi)標(biāo)，形成萃取工作液。最常用的流動(dòng)相是乙腈或甲醇與水的混合溶液，通常也添加少量（≤1%）有機(jī)酸（如乙酸或甲酸）。綜合常見新生兒篩查的萃取液和流動(dòng)相的研究文獻(xiàn)報(bào)道[9-11，16-18]以及ORA 在甲醇與乙腈中的溶解度情況，本研究選取添加少量甲酸（0.27 g/L）的甲醇-水（78∶22， V/V）溶液為萃取液，選取含0.1%甲酸的乙腈-水（84∶16， V/V）溶液為流動(dòng)相。

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，采用本方法檢測(cè)ORA 標(biāo)準(zhǔn)品和ORA-15N2 內(nèi)標(biāo)，結(jié)果如圖2 所示， ORA標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)ORA-15N2 在儀器上的信噪比（S/N）gt;5000，表明其具有優(yōu)異的響應(yīng)強(qiáng)度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度的ORA 濾紙片進(jìn)行檢測(cè)，以質(zhì)譜對(duì)待測(cè)目標(biāo)物的峰面積為響應(yīng)信號(hào)，并以樣品峰與內(nèi)標(biāo)峰的面積比為縱坐標(biāo)， ORA 添加濃度為橫坐標(biāo)，二者在0.25～40.0 μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖3），線性方程為y=0.051x–0.0073（R2=0.999），檢出限（S/N=3）為0.12 μmol/L。與文獻(xiàn)報(bào)道的串聯(lián)質(zhì)譜方法相比，本方法具有相近的線性范圍和更低的檢出限（表3）。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

由于本方法是將DBS 洗脫后，通過流動(dòng)注射直接注入MS/MS 離子源中，因此可能會(huì)將血液或?yàn)V紙中的雜質(zhì)引入到質(zhì)譜中，導(dǎo)致離子抑制，從而無法準(zhǔn)確定量分析。評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)是方法驗(yàn)證的關(guān)鍵部分。本研究采用混合實(shí)驗(yàn)評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)[31]，結(jié)果見表4。計(jì)算結(jié)果表明，混合基質(zhì)樣本與DBS 基質(zhì)樣本和溶劑基質(zhì)樣本的均值相比，差值百分比為2.2%，顯著小于20%，表明本方法的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)準(zhǔn)確定量分析ORA 的影響很小。

2.4 DBS樣本分析

通過在全血中添加不同濃度水平的ORA，分別制備低濃度（0.3 μmol/L）、中濃度（1.0 μmol/L）和高濃度（10.0 μmol/L）的DBS 樣本。樣本經(jīng)前處理后，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，低、中、高濃度DBS 的回收率分別為103.3%、122.2%和101.4%， RSD 分別為13.3%、2.3%和0.8%。同時(shí)，對(duì)本方法的攜帶污染效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估，得到高-低濃度轉(zhuǎn)換樣本均值與低-低濃度轉(zhuǎn)換樣本均值分別為0.33 和0.30 μmol/L，兩者的差值（0.03 μmol/L）小于低-低濃度轉(zhuǎn)換樣本的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3SD 為0.08 μmol/L）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度、精密度和攜帶污染效應(yīng)均符合要求[3，10，31]，可用于實(shí)際DBS 中ORA 的分析檢測(cè)。

2.5 實(shí)際樣本分析以及參考區(qū)間的建立

隨機(jī)選取了上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心900 例正常新生兒的DBS 樣本，采用本方法檢測(cè)其中的ORA 濃度，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ORA 的檢出濃度范圍為1.02～1.77 μmol/L，平均濃度為（1.24±0.09） μmol/L，依據(jù)臨床診斷參考區(qū)間建立原則[10，32]，以99.00%百分位數(shù)的濃度值作為參考區(qū)間的上限值，使用1.00%百分位數(shù)的濃度值作為參考區(qū)間的下限值，由此得到DBS 中ORA 的臨床診斷參考區(qū)間為1.10～1.52 μmol/L。Held 等[30]用FIA-MS/MS 測(cè)定了1514 例假定正常新生兒干血片中的ORA 范圍為0.59～2.61 μmol/L，均值為（1.2±0.23） μmol/L， 1%～99%濃度的參考區(qū)間為0.72～1.84 μmol/L，與本研究結(jié)果相近。本研究建立的新生兒ORA 濃度參考區(qū)間具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，為將來ORA 列入新生兒篩查項(xiàng)目奠定了初步的臨床實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

基于非衍生化的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種新生兒DBS 中ORA 的檢測(cè)方法。本方法不僅操作簡(jiǎn)便，而且檢出限低至0.12 μmol/L，靈敏度比文獻(xiàn)報(bào)道方法提高了至少一倍。在應(yīng)用于實(shí)際DBS 檢測(cè)時(shí)，本方法顯示出良好的準(zhǔn)確度和精密度，并且攜帶污染效應(yīng)小，滿足新生兒遺傳代謝疾病的篩查要求，并建立了初步的臨床診斷參考區(qū)間。本研究組未來將開展真實(shí)新生兒的臨床CPSD 和OTCD 的篩查與診斷，進(jìn)一步驗(yàn)證本方法對(duì)于疾病篩查的特異性與敏感性，以期為患兒提供更精準(zhǔn)的診斷與治療。

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