機器學習輔助圖像識別紅細胞抗氧化研究

摘要 細胞形態(tài)是原始的生物學特征，可以提供有關(guān)細胞生理或病理狀況的內(nèi)在信息。與通過肉眼比對分析細胞形態(tài)的方法相比，基于人工智能（Artificial intelligence， AI）的圖像識別方法有望提高分析速度和精度。本研究建立了細胞形態(tài)圖像分割、識別和計數(shù)的氧化損傷分析模型，并將其用于研究紅細胞抗氧化的動態(tài)過程。結(jié)果表明，以正常紅細胞比率計，本模型獲得了與經(jīng)典生化指標一致的結(jié)果，表明本模型可用于分析紅細胞氧化損傷程度。本方法無需細胞染色或細胞破碎等操作，可在2 h 內(nèi)獲取結(jié)果；而且因為采用顯微圖像獲取細胞形態(tài)信息，可實現(xiàn)細胞的實時監(jiān)測。本模型有望拓展應用于環(huán)境毒理學有關(guān)細胞形態(tài)、細胞活性水平等方面的研究。

關(guān)鍵詞 圖像識別；紅細胞形態(tài)；氧化損傷；人工智能

形狀是細胞的基本生物學特征，可在一定程度上反映細胞的生理狀態(tài)或因不同生理條件導致的變化[1]。Shaker 等[1]采用細胞形態(tài)計量學分析揭示了單個細胞在生理或病理條件下的有效信息。采用先進的微流控技術(shù)、原子力顯微鏡[2]、拉曼光譜儀[3]和光學顯微鏡[3]等可以對單細胞的細胞活力、計數(shù)和分類等進行分析。血細胞形態(tài)分析對于正確且有效的臨床決策至關(guān)重要[4]。Toepfner 等[5]對血液中各類細胞形態(tài)進行分析，無需經(jīng)過繁瑣的樣品預處理即可通過血液細胞形態(tài)-流變表型檢測人類疾病狀況。最近的研究顯示， SARS-CoV-2 感染患者的紅細胞輸氧功能下降且形狀不規(guī)則，其形態(tài)學特征可用于診斷[3]。Tsai 等[6]采用細胞的化學組分量化細胞形態(tài)特征，結(jié)合機器學習，可以實現(xiàn)正常細胞和腫瘤細胞之間形態(tài)差異的可視化檢測。

近年來，機器學習在醫(yī)療領(lǐng)域的應用備受關(guān)注。機器學習可以從光學顯微實驗的圖像中提取可用于細胞識別、細胞特征定量分析、形態(tài)學分析和計數(shù)等方面的信息[7]。U-Net 網(wǎng)絡作為一種圖形分割算法，已被用于生物醫(yī)學圖像研究中[8-9]。Zhang 等[8]提出了一種基于U-Net 網(wǎng)絡的受激拉曼散射圖像的自動細胞計數(shù)框架。Kassim 等[9]提出了一種基于聚類的雙深度學習架構(gòu)RBCNet，用于檢測瘧疾診斷涂片顯微圖像中的紅細胞。YOLOv3 作為一種目標檢測算法，在醫(yī)學圖像識別領(lǐng)域廣泛應用，如血細胞和組織細胞的檢測識別[10-11]。

本研究建立了一種利用機器學習輔助圖像識別研究紅細胞抗氧化的方法。建立的模型對紅細胞的形態(tài)識別和計數(shù)的平均準確率達到94%～99%。以正常形態(tài)的紅細胞比率計，此模型得到的結(jié)果和細胞生化指標以及流式細胞儀計數(shù)結(jié)果有很好的相關(guān)性。本研究以過氧化氫為氧化劑、丙酮酸鈉為抗氧化劑，研究細胞抗氧化的動態(tài)過程，結(jié)果表明，此模型能夠預測紅細胞的氧化/抗氧化行為，在預測紅細胞氧化損傷程度時與標準生化方法具有高度的一致性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CLM-170B-8 型細胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO 公司）；AL204-IC 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；SP8i 型徠卡激光共聚焦顯微鏡（美國LEICA 公司）；5425 R 型高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；UV-1900 型紫外-可見分光光度計（日本Shimaduz 公司）；TU-100 型恒溫金屬?。ㄉ虾Ｒ缓憧萍加邢薰荆?；NE02 型酶標儀（美國BioTek 公司）；A00-1-1102 型流式細胞儀（蘇州貝克曼庫爾特生物科技有限公司）；高壓滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司）。

100 mmol/L 丙酮酸鈉（優(yōu)級純，上?？乱庹軐嶒炇遥?；30% 過氧化氫（分析純，杭州名鑫雙氧水有限公司）；無菌雙蒸水（上海源葉生物科技有限公司）；Lipid Peroxidation MDA Assay Kit（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；紅細胞保存液和ACD 血液抗凝劑（無菌，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，無菌， pH=7.4， 3.49 g/L Na2HPO4·12H2O， 0.2 g/L KH2PO4， 0.2 g/L KCl，浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；聚賴氨酸（Poly-L-lysine，無菌，美國ScienCell 公司）；紅細胞沉降液（無菌，深圳市達科為生物工程有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅細胞樣本的制備

取25 歲健康女性志愿者靜脈血（志愿者知情同意，血液樣本用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，江門市人民醫(yī)院檢驗，結(jié)果見電子版文后支持信息表S1。本研究已經(jīng)得到相關(guān)倫理委員會批準）作為血液樣本，用PBS（pH=7.4）洗滌2 次， 1500 r/min 離心10 min， 用紅細胞保存液配制紅細胞比積為0.1～0.2 的紅細胞懸液，在4 ℃保存。后續(xù)分析均在采血后3 h 內(nèi)完成。

為了粘附紅細胞，將玻底培養(yǎng)皿進行增強粘附性修飾。聚賴氨酸是一種合成的正電荷氨基酸鏈，通過改變培養(yǎng)底物上的表面電荷增強細胞粘附。首先，在玻底培養(yǎng)皿中注入2 mL 用無菌水配制的2 μg/mL聚賴氨酸溶液，輕晃培養(yǎng)皿使溶液完全鋪展后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)1 h；取出聚賴氨酸溶液，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿2 次，然后加入處理過的紅細胞懸液。在此之前，無需干燥培養(yǎng)皿，可在所取的紅細胞懸液內(nèi)加入相當于紅細胞懸液1/4 體積的紅細胞沉降液，加速紅細胞沉降。

1.2.2 脂質(zhì)過氧化物的測定

取30 mL 紅細胞懸液，平均分成15 組， 1500 r/min 離心5 min，棄去上清液；將紅細胞分別置于25 mmol/L 丙酮酸鈉抗氧化劑、5～50 μmol/L（梯度為5 μmol/L）及50～250 μmol/L（梯度為50 μmol/L）過氧化氫氧化劑中，于37 ℃恒溫孵育2 h 后，用丙二醛（MDA）檢測試劑盒對不同處理條件下的紅細胞產(chǎn)生的MDA 進行定量檢測。

1.2.3 高鐵血紅蛋白（MetHb）的測定

取10 mL 紅細胞懸液，平均分成5 組， 1500 r/min 離心5 min， 棄去上清液；將紅細胞分別置于25 mmol/L 丙酮酸鈉抗氧化劑、25～45 μmol/L（梯度為5 μmol/L）的過氧化氫氧化劑中，于37 ℃恒溫孵育2 h。將紅細胞用水破溶（紅細胞懸液與水的體積比為1∶10）， 12000 r/min 離心5 min，上清液用紫外-可見分光光度計進行光譜測量[12]，根據(jù)血紅蛋白和MetHb 的特征吸收峰（577 和630 nm）強度計算MetHb 的百分比。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測

對照組：取2 mL 紅細胞懸液，不進行任何處理；實驗組：取10 mL 紅細胞懸液，平均分成5 組，分別以1500 r/min 離心5 min，棄去上清液，紅細胞分別置于25 mmol/L 丙酮酸鈉抗氧化劑中，再分別添加過氧化氫氧化劑至終濃度為0、25、30、35 和40 μmol/L，于37 ℃恒溫孵育2 h。采用流式細胞儀檢測紅細胞樣本，基于紅細胞前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）參數(shù)，分別獲得FSC/SSC 點圖、FSC/細胞計數(shù)和SSC/細胞計數(shù)[13]。

1.2.5 紅細胞氧化損傷程度預測模型

U-Net 網(wǎng)絡是一種卷積神經(jīng)網(wǎng)絡（CNN），具有編碼器-解碼器的對稱結(jié)構(gòu)，因結(jié)構(gòu)形似英文字母“U”而被稱為U-Net，其在語義分割方面有顯著的效果（電子版文后支持信息圖S1）。本研究采用U-Net 網(wǎng)絡對紅細胞圖像進行分割，從而實現(xiàn)提取正常紅細胞的目標。YOLOv3 網(wǎng)絡是YOLO（You Only Look Once）系列網(wǎng)絡的第3 個版本， YOLOv3 由主干特征提取網(wǎng)絡Darknet-53（即53 層卷積層）以及多尺度預測網(wǎng)絡兩部分組成，主干網(wǎng)絡使用了多個殘差模塊連接，有效解決了網(wǎng)絡深化過程中梯度消失的問題（電子版文后支持信息圖S2）。在很多目標檢測實驗中， YOLOv3 網(wǎng)絡具有較高的精度，能很好地平衡精度和速度?；诖?，本研究采用YOLOv3 算法對細胞進行檢測識別和自動計算，并得到正常形態(tài)的紅細胞比率。

獲取紅細胞圖像后，實驗的關(guān)鍵點在于對正常形態(tài)的紅細胞和全部紅細胞進行準確識別和計數(shù)。首先，采用SP8i 型徠卡激光共聚焦顯微鏡對不同條件處理的紅細胞進行明場成像（圖1A）。對正常形態(tài)的紅細胞圖像（圖1B）打標，并以此作為數(shù)據(jù)集，訓練U-Net 算法模型，得到分割提取正常形態(tài)紅細胞的掩膜圖像（圖1C）；訓練YOLOv3 模型識別正常紅細胞（圖1D）；對所有紅細胞打標，訓練YOLOv3 模型識別包括正常細胞和異常細胞在內(nèi)的所有紅細胞（圖1E）。最后，計算正常形態(tài)紅細胞占所有紅細胞的比率，并作為氧化損傷的判定依據(jù)（圖1F）。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅細胞形態(tài)識別的準確性

首先采用氧化劑刺激正常形態(tài)的紅細胞，獲得不同形狀的細胞，用于考察模型識別細胞的準確性。在經(jīng)過氧化損傷后的紅細胞原始圖像（圖2A）中，除兩面凹的正常細胞狀態(tài)（圖2B）外，還可觀察到有一部分紅細胞雖保持了圓餅形狀，但中心部分已經(jīng)塌陷，形成口紅形結(jié)構(gòu)（圖2C），另外，還有少量紅細胞已不再具備圓餅形狀，呈現(xiàn)鋸齒狀（圖2D）或棘形（圖2E）。

隨著紅細胞的氧化損傷程度加重，其形態(tài)也會發(fā)生變化。如果采用細胞形態(tài)的變化程度表征其氧化損傷程度，需要能夠正確識別細胞形態(tài)；如果采用每張圖片中正常紅細胞占所有紅細胞的比率判定其氧化損傷程度，需要能夠?qū)φ＜t細胞和全部紅細胞自動識別并計數(shù)。圖2A 和圖2F 分別為原始圖像和經(jīng)U-Net 分割處理后的圖像，在圖2F 中用綠色標記了被識別為正常狀態(tài)的紅細胞。二者疊加后，如圖2G所示，幾乎所有正常形態(tài)的紅細胞都能被準確檢測和識別，未被識別為正常的紅細胞都發(fā)生了明顯的形態(tài)變化，呈鋸齒狀或棘形。U-Net 對正常形態(tài)紅細胞分割訓練的結(jié)果（電子版文后支持信息圖S3、表S2和表S3）表明，此模型在測試集上的實驗平均精度為98.8%，在正常形態(tài)細胞分割方面表現(xiàn)良好。

采用YOLOv3 對圖2A 和2F 中的細胞計數(shù)（圖2H 和2I），被識別的細胞用錨框標出，錨框個數(shù)即為細胞個數(shù)，圖2A 和2F 中的所有細胞均被識別出來。計數(shù)結(jié)果（電子版文后支持信息表S4）表明，對于全部細胞識別的平均精度達到98.1%，對于分割結(jié)果中細胞（正常形態(tài)紅細胞）識別的平均精度達到99.5%，說明此模型對細胞的識別計數(shù)比較準確。以下3 種情況需要注意：（1）已經(jīng)變形的細胞可以被識別出來并正確計數(shù)（圖2H 標記Ⅰ）；（2）大部分處在圖像邊緣位置的細胞雖未完整成像，也可被正確計數(shù)（圖2H 標記Ⅱ），但圖2I 中標記Ⅱ的紅細胞未被計數(shù)；（3）在部分區(qū)域內(nèi)，如果細胞緊鄰或部分重疊，會被重復計數(shù)（圖2H 和圖2I 標記Ⅲ、Ⅳ），這可能是由于訓練樣本不足，導致模型訓練效果沒有達到最好，可通過將紅細胞粘附在培養(yǎng)皿底部（見1.2.1 節(jié)）部分解決此問題。雖然上述情況（2）和（3）導致了細胞計數(shù)錯誤，但采用U-Net 結(jié)合YOLOv3 的數(shù)據(jù)集測試結(jié)果和多張圖片的統(tǒng)計結(jié)果的準確率高達94%～99%。因此，可以認為此模型在細胞的識別和計數(shù)方面具有優(yōu)異的性能。

2.2 紅細胞氧化損傷程度預測模型的準確性

紅細胞變形與其氧化應激呈正相關(guān)[14]，形態(tài)異常的紅細胞與氧化應激和慢性炎癥標志物顯著相關(guān)[15]。為了分析紅細胞的氧化損傷，建立AI 算法評估紅細胞氧化損傷的結(jié)果與標準生化方法測定紅細胞膜脂質(zhì)氧化物MDA 評估紅細胞氧化損傷結(jié)果之間的相關(guān)性，以初步驗證模型的可行性。此外，血紅蛋白氧化后會形成MetHb， MetHb 過量會導致機體功能性缺氧。正常形態(tài)紅細胞的比率隨著MDA 含量增加而逐漸降低（圖3），同樣也會隨著MetHb 含量增加而逐漸降低（圖4）。由于MDA 和MetHb 是紅細胞發(fā)生氧化應激的生化指標[16]，反映紅細胞氧化損傷的程度，因此正常形態(tài)紅細胞比率也可反映其氧化損傷程度。

流式細胞術(shù)通常用于表征液流中的混合細胞群，能夠分離不同大小和含量的細胞群。機器學習輔助圖像識別獲得的正常形態(tài)的紅細胞比率和流式細胞儀FSC/細胞計數(shù)和SSC/細胞計數(shù)的結(jié)果二者擬合的相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998（電子版文后支持信息圖S4），進一步驗證了此模型的可行性。

綜上，機器學習輔助圖像識別獲得的正常形態(tài)的紅細胞比率與3 種評估紅細胞氧化損傷的經(jīng)典生化指標的測量值具有很好的相關(guān)性。

2.3 紅細胞形狀對氧化/抗氧化活性化合物的劑量依賴性

紅細胞形狀對氧化/抗氧化活性化合物的劑量具有依賴性[17]。本研究應用AI 算法研究這種關(guān)系，以過氧化氫為氧化劑，丙酮酸鈉為抗氧化劑，丙酮酸鈉可以通過促進細胞代謝改善有氧代謝。實驗結(jié)果表明， 25 mmol/L 丙酮酸鈉不會損傷紅細胞（圖5A）。固定丙酮酸鈉濃度為25 mmol/L， 加入不同濃度的過氧化氫，隨著過氧化氫濃度增加，正常形態(tài)的紅細胞比率降低，表明紅細胞氧化損傷的程度加深。當過氧化氫濃度低于30 μmol/L 時，正常形態(tài)的紅細胞比率變化較??；當過氧化氫濃度高于30 μmol/L 后，正常形態(tài)的紅細胞比率出現(xiàn)跳躍式下降（圖6）。利用AI 構(gòu)建的紅細胞氧化損傷程度預測模型得出過氧化氫濃度為30 μmol/L 時是紅細胞形態(tài)變化的轉(zhuǎn)折點，過氧化氫濃度低于30 μmol/L 時，大部分紅細胞的形態(tài)正常，只有少量細胞發(fā)生形變；過氧化氫濃度高于30 μmol/L 時，丙酮酸鈉的抗氧化作用不足以抵消過氧化氫的氧化作用，大量紅細胞因為氧化應激而損傷，形態(tài)發(fā)生變化，導致正常形態(tài)的紅細胞比率驟降。

作為對照，在同樣的條件下，研究了紅細胞脂質(zhì)氧化物MDA 含量和MetHb 含量與加入的過氧化氫濃度的變化規(guī)律。隨過氧化氫濃度增加， MDA 含量增大，表明氧化損傷程度增加。當過氧化氫濃度低于30 μmol/L 時， MDA 含量變化較小；濃度超過30 μmol/L 后MDA 含量就會出現(xiàn)跳躍式上升（圖7）。MetHb 含量表現(xiàn)出相同的變化趨勢和轉(zhuǎn)折點，這與AI 模型的結(jié)果高度一致（圖8）。

采用流式細胞術(shù)表征細胞簇時，紅細胞分布和基于FSC 的形態(tài)參數(shù)能夠顯示出較大的個體之間和介質(zhì)間的變異[13]。作為對照組，未采用氧化/抗氧刺激的紅細胞大部分保持較好的雙面凹圓餅狀，成群（圖9A）。對照組和25 mmol/L 丙酮酸鈉組（圖9B）中完整形態(tài)的紅細胞的百分比分別為97.85%和94.47%。25 和30 μmol/L 過氧化氫氧化劑下，完整形態(tài)的紅細胞的百分比分別為91.96%（圖9C）和89.17%（圖9D）。當過氧化氫濃度升至35 和40 μmol/L 后，完整紅細胞的百分比分別顯著下降至69.49%（圖9E）和47.95%（圖9F），這與AI 算法獲得的結(jié)果高度一致。綜上，機器學習輔助圖像識別的方法和傳統(tǒng)生化指標測定的方法在預測紅細胞氧化損傷的動態(tài)過程方面具有高度的一致性，表明此模型具有較好的實用性。

3 結(jié)論

本研究以紅細胞為模型，建立了一種機器學習輔助圖像識別的方法，用于預測紅細胞的氧化損傷程度。本方法具備以下優(yōu)點：（1）在對紅細胞施加氧化/抗氧化刺激的動態(tài)過程中，機器學習輔助圖像識別的方法和標準生化方法預測紅細胞氧化損傷程度的結(jié)果具有很好的一致性；（2）本方法不需要測量生化指標，從拍照開始到計算機處理，可在2 h 內(nèi)獲取結(jié)果，極大地節(jié)約了實驗時間；（3）本方法除了普通的倒置顯微鏡，不需要其它檢測儀器，極大地節(jié)約了實驗成本。本研究建立的機器學習輔助圖像識別的方法為評估紅細胞氧化損傷程度提供了一條新途徑。另外，本方法也可用于研究伴隨著細胞形態(tài)變化的其它生理過程，如干細胞的分化和環(huán)境毒理學研究等。

References

[1] SHAKER M， COLELLA L， CASELLI F， BISEGNA P， RENAUD P. Lab Chip， 2014， 14（14）： 2548-2555.

[2] SERGUNOVA V， LEESMENT S， KOZLOV A， INOZEMTSEV V， PLATITSINA P， LYAPUNOVA S， ONUFRIEVICH A，POLYAKOV V， SHERSTYUKOVA E. Sensors-Basel， 2022， 22（5）： 2055-2068.

[3] REVIN V， BALYKOVA L， PINYAEV S， SYUSIN I， RADAEVA O， REVINA N， KOSTINA Y， KOZLOV E， INCHINA V，NIKITIN I， SALIKOV A， FEDOROV I. Biomedicines， 2022， 10（3）： 553-562.

[4] RANA P， SOWMYA A， MEIJERING E， SONG Y. Sci. Rep. ， 2022， 12（1）： 18101.

[5] TOEPFNER N， HEROLD C， OTTO O， ROSENDAHL P， JACOBI A， KRATER M， ST?CHELE J， MENSCHNER L，HERBIG M， CIUFFREDA L， RANFORD-CARTWRIGHT L， GRZYBEK M， COSKUN U， REITHUBER E， GARRISS G，MELLROTH P， HENRIQUES-NORMARK B， TREGAY N， SUTTORP M， BORNHAUSER M， CHILVERS E R， BERNERR， GUCK J. eLife， 2018， 7： e29213.

[6] TSAI A G， GLASS D R， JUNTILLA M， HARTMANN F J， OAK J S， FERNANDEZ-POL S， OHGAMI R S， BENDALL S C.Nat. Med. ， 2020， 26（3）： 408-417.

[7] BOUTROS M， HEIGWER F， LAUFER C. Cell， 2015， 163（6）： 1314-1325.

[8] ZHANG Q， YUN K K， WANG H， YOON S W， LU F， WON D. PLoS One， 2021， 16（7）： e0254586.

[9] KASSIM Y M， PALANIAPPAN K， YANG F， POOSTCHI M， PALANIAPPAN N， MAUDE R J， ANTANI S， JAEGER S.IEEE J. Biomed. Health Inform. ， 2021， 25（5）： 1735-1746.

[10] SHAKARAMI A， MENHAJ M B， MAHDAVI-HORMAT A， TARRAH H. Biomed. Signal Process. Control， 2021， 66：102495.

[11] JIA D， HE Z， ZHANG C， YIN W， WU N， LI Z. Multimed. Tools Appl. ， 2022， 81（6）： 8939-8961.

[12] FENG Li-Ming， PAN Hua-Zhen， ZHANG Zhi-Nan. Chin. Pharmacol. Bull. ， 1990， （1）： 26-29.

馮立明， 潘華珍， 張之南. 中國藥理學通報. 1990， （1）： 26-29.

[13] DRVENICA I， MOJSILOVIC S， STANCIC A， MARKOVIC D， KOVACIC M， MASLOVARIC I， RAPAJIC I， VUCETIC D，ILIC V. Eur. Biophys. J. ， 2021， 50（6）： 829-846.

[14] BECATTI M， MARCUCCI R， GORI A M， MANNINI L， GRIFONI E， LIOTTA A A， SODI A， TARTARO R， TADDEI N，RIZZO S， PRISCO D， ABBATE R， FIORILLO C. J. Thromb. Haemost. ， 2016， 14（11）： 2287-2297.

[15] GYAWALI P， RICHARDS R S， BWITITI P T， NWOSE E U. Blood Cells Mol. Dis. ， 2015， 54（4）： 360-363.

[16] SANI M， SEBAI H， GHANEM-BOUGHANMI N， BOUGHATTAS N A， BEN-ATTIA M. Redox Rep. ， 2015， 20（1）： 26-32.

[17] STARODUBTSEVA M N， TATTERSALL A L， KUZNETSOVA T G， YEGORENKOV N I， ELLORY J C.Bioelectrochemistry， 2008， 73（2）： 155-162.