紅鯽胚胎發(fā)育過程中Sox8基因對壬基酚脅迫的響應

摘要：【目的】明確紅鯽SRY相關高遷移率族盒蛋白8基因（Sox8）表達模式及壬基酚（NP）暴露對紅鯽胚胎發(fā)育過程中Sox8基因表達的影響，為揭示NP脅迫下紅鯽胚胎發(fā)育畸形的分子機制提供科學依據(jù)。【方法】運用RACE克隆紅 鯽Sox8基因cDNA全長序列，通過ProtParam、ProtScale、InterPro、PredictProtein、DeepTMHMM等在線軟件進行生物信 息學分析，利用實時熒光定量PCR檢測紅鯽Sox8基因在各成體組織及不同胚胎發(fā)育階段的表達情況，以及不同濃 度NP暴露對紅鯽胚胎期Sox8基因表達的影響?！窘Y果】紅鯽Sox8基因cDNA序列全長2163bp，其開放閱讀框（ORF）1176bp，共編碼391個氨基酸殘基；紅鯽SOX8蛋白相對分子量為43798.30Da，理論等電點（pI）為6.90，脂溶指數(shù)為49.92，不穩(wěn)定指數(shù)為66.04，總平均親水性指數(shù)（GRAVY）為-1.026，其N端含有Sox_N二聚化結構域和HMG-box結構域；基于SOX8氨基酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示紅鯽與鯽的親緣關系最近。紅鯽Sox8基因在各成體組織中廣泛表達，以腦組織中的Sox8基因相對表達量最高，顯著高于其他組織（Plt;0.05，下同）；在紅鯽胚胎發(fā)育過程中，Sox8基因的表達從受精后到14體節(jié)期呈逐漸下降趨勢，但從21體節(jié)期開始Sox8基因相對表達量顯著增高，直到孵化期始終維持在較高水平。在大多數(shù)情況下，NP暴露能顯著影響紅鯽胚胎發(fā)育過程中Sox8基因的表達，特別是14體節(jié)期后的發(fā)育階段，NP暴露主要是不同程度地激活Sox8基因表達。【結論】Sox8基因表達在紅鯽成體中具有組織特異性，且在胚胎發(fā)育過程中呈先降低后升高的變化趨勢。NP暴露能顯著影響紅鯽胚胎發(fā)育過程中Sox8基因的表達，14體節(jié)期后Sox8基因表達水平升高可能是NP致畸紅鯽胚胎的重要原因之一。

關鍵詞：紅鯽；Sox8基因；壬基酚；胚胎發(fā)育；毒性；致畸

文章編號：2095-1191（2024）04-1149-11

中圖分類號：S965.117

文獻標志碼：A

Response of Sox8 gene to nonylphenol stress during red crucian carp（Carassius auratus red var.） development

ZHANG Qiong-yu1， PENG Juan1， TIAN Yu-su2， SUN Yuan-dong2*

（1School of Fundamental Sciences， Yongzhou Vocational Technical College， Yongzhou， Hunan 425100， China; 2School of Life and Health Sciences， Hunan University of Science and Technology， Xiangtan， Hunan 411201， China）

Abstract： 【Objective】To elucidate the expression pattern of the SRY-related high mobility group box protein 8 gene （Sox8） in red crucian carp （Carassius auratus red var.） and the impact of nonylphenol （NP） exposure on Sox8 gene expression during embryonic development， providing a scientific basis for uncovering the molecular mechanisms of NP- induced embryonic developmental deformities in red crucian carp. 【Method】The full-length cDNA sequence of Sox8 gene from red crucian carp was cloned using RACE technique. Bioinformatics analysis were conducted using online tools such as ProtParam， ProtScale， InterPro， PredictProtein and DeepTMHMM. Real-time fluorescence quantitative PCR was em- ployed to detect the expression of Sox8 gene in various adult tissues and at different embryonic developmental stages， as well as the effect of different NP concentrations exposure on Sox8 gene expression during the embryonic stage of red cru- cian carp. 【Result】The full-length cDNA sequence of Sox8 gene in red crucian carp was 2163 bp， with an open reading frame （ORF） of 1176 bp encoding 391 amino acid residues. The relative molecular weight of the SOX8 protein was 43798.30 Da， with a theoretical isoelectric point （pI） of 6.90， a lipophilicity index of 49.92， an instability index of66.04， and a grand average of hydropathicity （GRAVY） of -1.026. The N-terminus contained a Sox_N dimerization do-main and an HMG-box domain. Phylogenetic analysis based on the SOX8 amino acid sequences revealed a close relationship between C. auratus red var. and Carassius carassius （common crucian carp）. The Sox8 gene was broadly expressed in various adult tissues of red crucian carp， with the highest relative expression in the brain， which was significantly higher than that in other tissues （Plt;0.05， the same below）. During embryonic development， Sox8 gene expression decreased gradually from post-fertilization to the 14-somite stage， but significantly increased from the 21-somite stage， maintained at a high level until the hatching stage. Under most conditions， NP exposure significantly affected Sox8 gene expression during embryonic development of red crucian carp， particularly activating Sox8 gene expression to varying degrees after the 14-somite stage. 【Conclusion】Sox8 gene expression exhibits tissue specificity in adult red crucian carp and presents a trend of initial decrease followed by increase during embryonic development. NP exposure significantly affects Sox8 gene expression during embryonic development， with the increased expression of Sox8 gene after the 14-somite stage potentially contributing to NP-induced embryonic deformities in red crucian carp.

Key words： red crucian carp; Sox8 gene; nonylphenol; embryonic development; toxicity; deformity

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （3187130957） ;Outstanding Youth Project of Scientific Research Fund of Hunan Education Department（21B0923）

0 引言

【研究意義】壬基酚（Nonylpheno，NP）是典型的烷基酚類環(huán)境激素，廣泛應用于現(xiàn)代工業(yè)生產，通過污水進入水環(huán)境中而對各類水生動物的生理和發(fā)育造成負面影響，并經生物富集對人類健康造成威脅（Bhandari et al.，2021）。NP污染問題日趨嚴重，引起了社會的廣泛關注，我國已將其列入《重點管控新污染物清單（2023年版）》。作為兼具食用與觀賞經濟價值的重要淡水魚類——紅鯽（Carassius auratusred var.）對NP較敏感，已有研究表明NP暴露可導致紅鯽胚胎發(fā)育畸形（田雨蘇等，2020）。SRY相關高遷移率族盒蛋白（SRY-related high mobility group box，Sox）基因家族是一類與Sry（Sex determining regionof Y chromosome）基因同源的轉錄因子，其編碼蛋白SOX通過保守的高遷移率族盒（HMG-box）結構域與DNA結合，從而調控靶基因表達，在動物胚胎發(fā)育、細胞增殖和分化過程中揮重要作用（Wegner，2010;Haseeb and Lefebvre，2019）。根據(jù)序列同源性及蛋白結構特征，Sox基因家族又可分為SoxA～SoxK等11個亞族（Hu et al.，2021）。其中，SoxE亞族轉錄因子在軟骨和骨發(fā)生、性別決定與分化、神經分化和神經系統(tǒng)發(fā)育及多種組織器官形成過程中發(fā)揮重要作用（She and Yang，2017;Weider and Wegner，2017;Lefebvre，2019）。Sox8基因是SoxE亞族的重要成員之一，因此，明確紅鯽Sox8基因表達模式及其在胚胎發(fā)育階段對NP脅迫的響應，對揭示NP致畸胚胎的分子毒理機制具有重要意義。【前人研究進展】NP對機體的影響已得到廣泛關注。NP在機體內可模擬雌激素干擾內分泌代謝并引發(fā)機體多種毒性應答和應激反應，導致生殖系統(tǒng)、神經系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等受損（Corrêa et al.，2020）。除此之外，NP還具有顯著的發(fā)育毒性作用（Sun et al.，2021）。在大鼠（Rat-tus norvegicus）中，NP可導致其卵黃囊生長和血管分化不良、胚胎生長遲緩及多個器官形態(tài)分化異常（龍鼎新等，2004）。在爪蟾（Xenopus laevis）中，NP可導致胚體長度縮短及彎曲、出現(xiàn)水腫和腸道卷曲異常，并干擾蝌蚪發(fā)育及變態(tài)發(fā)生（Sone et al.，2004;Xu et al.，2019）。在玫瑰無須鲃（Puntius con-chonius）中，NP會暴露引發(fā)受精卵發(fā)育延遲和胚胎脊椎畸形，其最敏感的階段為體節(jié)形成期（肖勤和許玉艷，2010）。在斑馬魚（Danio rerio）中，NP暴露會影響斑馬魚的脊索形態(tài)發(fā)生、肌肉功能和神經內分泌系統(tǒng)，導致脊索畸形、運動能力下降及行為異常等（Chandrasekar et al.，2011;Phillips et al.，2022）。在紅鯽中，NP暴露可導致胚胎脊柱彎曲、尾部畸形、心包異常和循環(huán)障礙等發(fā)育異常（田雨蘇等，2020）。SoxE亞族基因包括Sox8、Sox9和Soxl0等3個主要成員，在諸多發(fā)育事件中扮演著重要角色（Haseeb and Lefebvre，2019）。其中，Sox9基因對多個器官的發(fā)育至關重要，包括骨骼、睪丸、心臟、肺臟、胰腺、腸道和神經系統(tǒng)（Ming et al.，2022）；Soxl0基因主要參與神經嵴的誘導、發(fā)育、遷移和分化，以及神經膠質的發(fā)生（Stolt and Wegner，2010）。Sox8基因表達模式及其編碼產物所結合的DNA靶序列與其他 SoxE 亞族基因成員類似（Schepers et al.，2000;Haseeb and Lefebvre，2019）。一般認為，Sox8基因是SoxE 亞族其他基因成員的備份，具有功能冗余或功能補償?shù)淖饔茫⊿tolt et al.，2004;Barrionuevoand Scherer，2010;Richardson et al.，2020）。至今，已在包括斑馬魚、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）、河豚（Takifugu rubripes）、牙鲆（Paralichthys oliva-ceus）、金頭鯛（Sparus aurata）等多種魚類中克隆獲得 Sox8 基因，根據(jù)其表達模式，推測 Sox8基因在魚類性別決定、性腺發(fā)育、神經發(fā)生及多種組織器官的形成過程中發(fā)揮重要作用（Hu et al.，2021）。[本研究切人點]目前，有關NP對動物發(fā)育毒性影響的研究主要聚焦在精子活性、半致死濃度（LCo）、致死率及形態(tài)學變化等方面（Hong et al.，2020），鮮見探究NP導致胚胎發(fā)育畸形的分子機制，尤其在胚胎發(fā)育的關鍵階段尚未明確NP如何影響特定基因表達而導致胚胎發(fā)育異常。[擬解決的關鍵問題]克隆紅鯽Sox8基因并進行生物信息學分析，利用實時熒光定量 PCR檢測 Sox8 基因表達模式，同時探究NP暴露對紅鯽胚胎發(fā)育過程Sox8基因表達的影響，為揭示NP脅迫下紅鯽胚胎發(fā)育畸形的分子機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

2齡性成熟紅鯽（體質量約200±10g，平均體長 15±3cm）取自湖南省水產養(yǎng)殖實踐教學示范中心。 試驗前將12尾紅鯽暫養(yǎng)于（25±1）°℃的室內淡水池 中，每天上午8：00-9：30和下午16：00-17：30各投 喂1次商業(yè)飼料，2次投喂需間隔8h。暫養(yǎng)1周后觀 察無異常癥狀即進行后續(xù)試驗。動物試驗由永州職 業(yè)技術學院科技倫理委員會審查和批準，批準號EAE-YZZY-2022-P02。

隨機選取3尾紅鯽，麻醉后剖檢采集鰓、肝臟、 脾臟、腸道、頭腎、腎臟、肌肉、心臟、腦、垂體及精巢/ 卵巢等組織樣品，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)?用。紅鯽胚胎在繁殖季節(jié)通過干法人工授精獲得： 將卵子和精液擠入干燥的培養(yǎng)皿中，用羽毛輕輕攪 拌，使卵子與精子充分結合，30s后加入曝氣水激活 精子，使卵子受精。受精5min后將培養(yǎng)皿中的曝氣 水換成不同濃度的NP試驗液，體視顯微鏡下觀察胚 胎發(fā)育過程，用鑷子挑走未受精卵，再進行后續(xù)試 驗。胚胎發(fā)育時期參考Tsai等（2013）的研究結果進 行判斷確定。

1.2試驗方法

1.2.1胚胎毒性試驗

以無水乙醇為助溶劑配制NP儲備液，4℃避光保存?zhèn)溆?。用曝氣水配制NP試驗液，最終乙醇體積分數(shù)控制不超過0.01%（以免造成胚胎死亡和器官發(fā)育畸形）。通過預試驗確定紅鯽胚胎對NP的敏感性，結果顯示，NP處理74h的紅鯽胚胎LC3。為3.51umol/L；當NP濃度提升至5 umol/L時，胚胎發(fā)育的畸形表型更明顯；當NP濃度增加至7umol/L時，胚胎存活率急劇下降。基于此，NP暴露胚胎毒性試驗設3個濃度組（3、5和7umol/L）和1個空白對照組（0.01%無水乙醇，CK），每個濃度設3個平行。受精5min后，將紅鯽受精卵（200枚/組）分別暴露于不同濃度的NP試驗液中，置于（25±1）℃下繼續(xù)孵育。各處理組分別在神經胚期（Neurula stage，N）、5體節(jié)期（5-somitestage，5S）、14體節(jié)期（14-somite stage，14S）、21體節(jié)期（21-somite stage，21S）、25%耳囊閉合期（25% oticvesicle closure stage，25% OVC）、65%耳囊閉合期（65%OVC）及孵化期（Hatching period，H）等7個發(fā)育時期，混合取樣12～20枚胚胎，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總RNA提取及cDNA合

成采用TRIzol分別提取紅鯽各成體組織及不同發(fā)育時期胚胎材料的總RNA，以DNase I（TaKaRa）處理去除基因組DNA，然后通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000超微量分光光度計檢測總RNA質量及其濃度。利用Oligo（dT）接頭引物和ReverTra Ace逆轉錄酶（日本TOYOBO公司）將紅鯽成體組織及不同發(fā)育階段胚胎的總RNA逆轉錄合成cDNA第一條鏈。

1.2.3紅鯽Sox8基因克隆

根據(jù)GenBank已公布的鯽Sox8基因（XM 026277412.1）和鯉Sox8基因（XM019063104.1）的編碼區(qū)保守序列設計引物（表1），以神經胚期紅鯽胚胎RNA逆轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系25.0μL：10×Ex Taq Buffer （Mg2+ Plus） 2.5 uL， dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，Sox8-F/Sox8-R（10 umol/L）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5U/pL）0.25uL，ddH2O補足至25.0μL。擴增程序：94℃預變性5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，進行35個循環(huán)；72℃延伸10min。目的片段經純化回收及測序后，通過NCBI網(wǎng)站（https：∥/www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST功能進行序列比對分析，以確認其是否擴增獲得紅鯽Sox8基因cDNA序列。依據(jù)已獲得的Sox8基因cDNA序列設計合成特異的3'-RACE和5'-RACE嵌套擴增引物（表1），然后按照 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clonetech）說明完成3'-RACE和5'-RACE擴增（張瓊宇等，2020）。RACE擴增產物經純化回收及測序鑒定后，與擴增獲得的cDNA序列進行拼接，得到紅鯽Sox8基因cDNA全長序列，并提交至GenBank。所有擴增引物合成及測序均委托天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.2.4生物信息學分析

利用DNASTAR7.0中的SeqMan功能進行序列拼接，以獲得Sox8基因cDNA全長序列。使用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找開放閱讀框（ORF）并推導其氨基酸序列；通過ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測SOX8蛋白理化性質；運用Prot-Scale（https：//www.expasy.org/resources/protscale）預測 SOX8 蛋白親/疏水性;采用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）預測 SOX8 蛋白保守結構域;以PredictProtein（https：//predictprotein.org/）預測 SOX8蛋白序列核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）及核輸出信號（Nuclear export signal， NES）;使用DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預測 SOX8蛋白跨膜結構;利用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）查找 SOX8 氨基酸磷酸化位點;通過 SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcpfr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和 SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分別預測 SOX8蛋白二、三級結構;運用BLASTp（https：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索GenBank的 Nr數(shù)據(jù)庫，進行 SOX8 氨基酸序列同源比對分析;在MEGA 11.0 中利用ClustalW 進行多序列比對，并通過鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap設為1000次（潘傳燕等，2021）。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測

根據(jù)Sox8基因 cDNA全長序列設計實時熒光定量PCR擴增引物Sox8-qF和Sox8-qR（表1），利用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對引物特異性進行評價，并通過SDS-PAGE電泳檢測其目的條帶，然后利用StepOnePlusTM Real-Time PCR System（ABI）檢測Sox8基因在紅鯽各成 體組織和胚胎樣本中的相對表達量。各成體組織或 不同發(fā)育階段的胚胎材料均來源于3次獨立采樣， 每個樣本設3次重復。以β-Actin為內參基因，采用 2：A△a法計算相對表達量（Livak and Schmittgen， 2001）。比較不同組織中Sox8基因表達水平時，以心臟中的Sox8基因表達量為基線（1.0）；比較不同發(fā)育階段Sox8基因表達水平時，則以對照組神經胚期胚胎Sox8基因表達量為基線（1.0）。

1.3統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS20.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Tukey's多重比較檢驗，并以GraphPad Prism 8制圖。

2結果與分析

2.1紅鯽Sox8基因cDNA序列及其推導氨基酸序列分析結果

紅鯽Sox8基因cDNA序列（GenBank登錄號MT322309）全長2163bp，包含1176bp的ORF、194bp的5'非編碼區(qū)（5'-UTR）和793bp的3'非編碼區(qū)（3'-UTR），且3'-UTR含有2個“aataa”多聚腺苷酸加尾信號（圖1）。紅鯽Sox8基因共編碼391個氨基酸殘基，以絲氨酸（Ser）和脯氨酸（Pro）的含量較高，分別占12.30%和10.00%（圖2）。紅鯽SOX8蛋白分子式為C191H292N564O603S11，相對分子量為43798.30 Da，理論等電點（pI）為6.90，脂溶指數(shù)為49.92，不穩(wěn)定指數(shù)為66.04。ProtScale預測結果表明，紅鯽SOX8蛋白序列中位于第94位的色氨酸（Trp）得分為1.300，疏水性最強；位于第219位的天冬酰胺（Asn）得分為-3.300，親水性最強；總平均親水性指數(shù)（GRAVY）為-1.026（圖3），即該蛋白是一種不穩(wěn)定的酸性親水性蛋白。NetPhos3.1預測分析發(fā)現(xiàn)，紅鯽SOX8蛋白 含有36個絲氨酸磷酸化位點、12個蘇氨酸磷酸化位 點和8個酪氨酸磷酸化位點。InterPro預測結果表明，在紅鯽SOX8蛋白序列第10～72位氨基酸為Sox N二聚化結構域，含特征性基序“YDW”；第82～160位氨基酸是SOX蛋白家族特有的HMG-box結構域，含特征性基序“AQAARRKL”及2個獨立的NLS和1個NES（圖1）。DeepTMHMM預測結果顯示，紅鯽SOX8蛋白不含跨膜結構。

利用SOPMA預測紅鯽SOX蛋白二級結構，結 果顯示，該蛋白二級結構由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、 延伸鏈和β-折疊組成，其中，無規(guī)則卷曲占70.34%，

a-螺旋占20.46%，延伸鏈占6.39%，β-折疊占2.81% （圖4-A）。以斑馬魚SOX8蛋白三級結構（A0A0R4ITJ3.1.A）為模板，通過SWISS-MODEL對紅鯽SOX8蛋白三級結構進行建模，結果（圖4-B）顯示，紅鯽SOX8蛋白三級結構與模板的一致性為81.56%，模型覆蓋率為98.0%，主要由無規(guī)則卷曲和a-螺旋組 成，與其二級結構預測結果一致。

2.2同源比對分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建

通過NCBI查找紅鯽SOX8蛋白的直系同源物， 經BLASTp在線比對發(fā)現(xiàn)紅鯽SOX8蛋白與其他物 種SOX8蛋白的HMG-box結構域氨基酸序列高度

一致（圖5），說明該結構域高度保守。同源比對分析 結果（表2）顯示，紅鯽SOX8氨基酸序列與其他鯉形目魚類的SOX8氨基酸序列高度同源，與泥鰍、斑馬 魚、翹嘴鲌（Culter alburnus）鱇浪白魚（Anabarilius grahami）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、鯉（Cyp- rinus carpio）、鯽（C.auratus）和銀鯽（C.gibelio）的SOX8氨基酸序列相似性為71.33%～96.93%；與非鯉形目魚類的SOX8氨基酸序列相似性較低，與 青鳉（Oryzias latipes）、金頭鯛、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的SOX8氨基酸序列相似性為53.30%～56.13%；與哺乳、鳥類、 爬行、兩棲等脊椎動物的SOX8氨基酸序列相似性 為54.61％～58.35％。

基于SOX8氨基酸序列相似性，以MEGA11.0的NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果（圖6）顯示，構建 的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分為兩大支，所有魚類聚為一支， 而哺乳、鳥類、爬行、兩棲等脊椎動物聚為一支。其中，紅鯽與鯽的親緣關系最近，最先聚類在一起，再與其他鯉形目魚類聚為一小支?？梢?，基于SOX8氨基酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹反映了這些物種在進化過程中的遺傳關系。

2.3紅鯽Sox8基因在各成體組織中的表達

情況以β-Actin為內參基因，通過實時熒光定量PCR檢測紅鯽Sox8基因在各成體組織中的表達情況， 結果顯示，在心臟、腦、垂體、卵巢/精巢、鰓、肝臟、脾 臟、腸道、頭腎、肌肉及腎臟等組織中均可檢測到 Sox8基因表達。以心臟中Sox8基因表達量為基線（1.0），進一步對其他組織中的Sox8基因表達量進行數(shù)據(jù)校準，結果（圖7）表明，以腦組織中的Sox8基因 相對表達量最高（225.10倍），顯著高于其他組織中 的相對表達量（Plt;0.05，下同）；其次是精巢（92.23 倍）、鰓組織（48.32倍）、肌肉（31.09倍）及卵巢（21.61 倍）；在垂體和肝臟中的相對表達量較低，顯著低于 其他組織中的相對表達量。

2.4紅鯽Sox8基因在不同胚胎發(fā)育階段的表達情況

采用實時熒光定量PCR檢測紅鯽Sox8基因在 不同胚胎發(fā)育階段的表達情況，結果（圖8）顯示，在 正常胚胎發(fā)育過程中紅鯽Sox8基因相對表達量呈 先降低后升高的變化趨勢。受精后，隨著胚胎發(fā)育 的進行，紅鯽Sox8基因相對表達量逐漸降低，至14S 期降至最低值，顯著低于其他發(fā)育階段的相對表達 量；但從21S期開始紅鯽Sox8基因相對表達量迅速 增加，且一直維持在較高水平，H期的相對表達量達 最高值，顯著高于其他發(fā)育階段的相對表達量。

2.5NP暴露對紅鯽胚胎期Sox8基因表達的影響

通過比較各發(fā)育階段正常胚胎和NP暴露胚胎 中的Sox8基因表達情況，以確定NP暴露對紅鯽胚胎期Sox8基因表達的影響。實時熒光定量PCR檢測結果（圖9）顯示，在胚胎發(fā)育過程中，3umol/LNP 暴露組紅鯽胚胎中Sox8基因相對表達量的最低值 出現(xiàn)在5S期，最高值出現(xiàn)在H期；Sox8基因在N期、5S期、14S期、25%OVC期、65%OVC期和H期的相對表達量與CK正常胚胎間存在顯著差異。5umol/LNP 暴露組紅鯽胚胎中Sox8基因相對表達量的最低值 出現(xiàn)在14S期，最高值出現(xiàn)在25%OVC期；Sox8基因在N期、14S期、25%OVC期、65%OVC期和H期的相對表達量與CK組正常胚胎間存在顯著差異。7umol/LNP暴露組紅鯽胚胎中Sox8基因相對表達量的最低值出現(xiàn)在14S期，最高值出現(xiàn)在21S期；Sox8基因在N期、5S期、14S期、21S期、25%OVC期 和65%OVC期的相對表達量與CK組正常胚胎間存 在顯著差異（7μmol/LNP暴露組H期因沒有存活 胚胎而缺少相關數(shù)據(jù)）。綜上所述，在大多數(shù)情況 下，NP暴露能顯著影響紅鯽胚胎發(fā)育過程中Sox8基 因的表達。

3討論本研究通過RACE克隆獲得的紅鯽Sox8基因 cDNA序列全長2163bp，共編碼391個氨基酸殘基；紅鯽SOX8蛋白是一種不穩(wěn)定的酸性親水性蛋白， 與其他鯉形目魚類的SOX8氨基酸序列相似性較 高，在其N端含有Sox N二聚化結構域和HMG-box結構域，其中，HMG-box結構域氨基酸序列與其他物種SOX8蛋白的HMG-box結構域氨基酸序列高度一致，含有2個獨立的NLS（NLS1和NLS2）及1個NES，表明SOX蛋白功能在進化過程中非常保守，也提示紅鯽SOX8蛋白可形成同源或異源二聚體，通過HMG-box結構域與DNA核心基序（A/T）（A/T）CAA（A/T）G相結合，而調控下游基因表達，進而在胚胎發(fā)育及細胞分化過程中發(fā)揮重要作用（Kondoh and Kamachi，2010）。紅鯽SOX8氨基酸序列與鯽、銀鯽的SOX8氨基酸序列相似性分別為96.93%和96.68%，低于鯽與銀鯽的SOX8氨基酸序列相似性 （99.00%）。由于紅鯽長期由人工飼養(yǎng)、馴化及選育（吳端生，2016），與鯽和銀鯽在自然界的生存條件明 顯不同，因此這種氨基酸序列差異可能源于人工環(huán) 境中的選擇壓力和遺傳漂變。

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，紅鯽Sox8基 因在成體多種組織中廣泛表達，但不同組織中的相 對表達量存在差異，相對表達量較高的是腦和精巢， 其次是鰓、肌肉和卵巢，呈現(xiàn)明顯的組織表達特異 性，與在許多其他魚類中觀察到Sox8基因主要表達于神經系統(tǒng)、性腺和骨骼肌（Hu et al.，2021）的結論基本一致。已有研究表明，Sox8基因在這些器官系 統(tǒng)中發(fā)揮重要功能作用。在哺乳動物和兩棲動物 中，Sox8基因在神經膠質的特化過程中發(fā)揮重要作 用（Weider and Wegner，2017）；在小鼠性腺發(fā)育過程中，雖然Sox8基因不起決定性作用，但在小鼠出生 后其表達對血睪屏障形成及精子發(fā)生微環(huán)境的維持 具有重要意義（Barrionuevo et al.，2009）；Sox8在哺 乳動物胚胎肌肉發(fā)生時高表達，而成體骨骼肌中 Sox8基因的表達局限于肌衛(wèi)星細胞中，以維持其未分化的狀態(tài)（Schmidt et al.，2003）。此外，紅鯽Sox8 基因在精巢中的相對表達量明顯高于卵巢，與在大 鱗副泥鰍（Xia et al.，2010）、泥鰍（Xia et al.，2011）和牙鲆（Yu et al.，2019）中的研究結論一致，故推測 Sox8基因對促進精巢發(fā)育分化及維持雄性生育能力 更重要。

在紅鯽胚胎發(fā)育過程中，Sox8基因從受精后到14體節(jié)期呈逐漸下降趨勢，但從21體節(jié)期開始Sox8基因相對表達量顯著增高，直到孵化期始終維持在 較高水平，在其他脊椎動物胚胎中也有類似的表達模式（Sock et al.，2001;Xia et al.，2010，2011;Yu etal.，2019）。綜合考慮到Sox8基因在紅鯽成體組織中廣泛表達，提示Sox8基因在體節(jié)形成后的發(fā)育過 程中參與多個組織器官形成及其功能維持。實時熒 光定量PCR檢測結果表明，NP暴露能顯著影響紅鯽胚胎發(fā)育過程中Sox8基因的表達。雖然不同濃度 NP暴露對紅鯽胚胎發(fā)育過程中Sox8基因表達的影 響存在差異，有時呈上調表達，有時呈下調表達，但 發(fā)育至14體節(jié)期后，NP暴露主要是不同程度地激活Sox8基因表達。田雨蘇等（2020）觀察到NP暴露組紅鯽胚胎均在胚體伸長后出現(xiàn)明顯畸形，與Sox8基因表達的升高同步發(fā)生。因此，推測Sox8基因表達水平升高在NP致畸紅鯽胚胎中發(fā)揮重要作用。

目前，SoxE亞族基因功能研究最清楚的是Sox9基因。在Sox9基因缺陷型小鼠及其他物種中的研究已證實，Sox9基因在骨骼、性腺、心臟、視網(wǎng)膜、胰 腺、神經系統(tǒng)等多個器官系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮重 要作用（Ming et al.，2022）。一般認為，Sox8基因在功能上與Sox9基因存在冗余或補償關系，但也有研 究指出Sox8基因在發(fā)育過程中具有其獨特的生物 學功能。在小鼠中，Sox8基因參與睪丸分化及其性功能維持，成體支持細胞產生的SOX8蛋白對維持精子發(fā)生和正常精子功能至關重要（O'Bryan et al.，2008）；Sox8基因還是肌衛(wèi)星細胞的特異性標記物， 對保持肌衛(wèi)星細胞的未分化狀態(tài)起重要作用，過 表達Sox8基因可抑制成肌細胞分化為肌纖維 （Schmidt et al.，2003）。在雞胚中，Sox8基因是啟動 耳形態(tài)發(fā)生的主調控基因，能誘導顱外胚層發(fā)育產 生耳（Buzzi et al.，2022）。在中華絨螯蟹中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因（Bmp2）是SOX8蛋白的潛在靶基因，體外試驗證實SOX8蛋白可通過結合Bmp2基因啟動子而激活其轉錄（Jia et al.，2022）。本課題組前期研究觀察到，紅鯽胚胎暴露于NP后，在胚體尾部 延伸階段出現(xiàn)明顯的脊椎畸形、神經管缺損、尾部向上卷曲和肌纖維分化異常等發(fā)育畸形現(xiàn)象（田雨蘇 等，2020）。這些畸形可能與NP暴露導致14體節(jié)期后Sox8基因的過表達有關，但NP調控Sox8基因表 達的具體分子機制還需進一步研究證實。

4 結論

Sox8基因表達在紅鯽成體中具有組織特異性， 且在胚胎發(fā)育過程中呈先降低后升高的變化趨勢。NP暴露能顯著影響紅鯽胚胎發(fā)育過程中Sox8基因的表達，14體節(jié)期后Sox8基因表達水平升高可能是NP致畸紅鯽胚胎的重要原因之一。

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（責任編輯

蘭宗寶）