火龍果莖潰瘍病植株莖組織細(xì)菌群落特征分析

摘要：【目的】比較火龍果健康植株與潰瘍病植株莖組織的內(nèi)生細(xì)菌群落特征和功能差異，為揭示火龍果潰瘍病 發(fā)生機(jī)制和研究防治技術(shù)提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎杉瘕埞】抵仓旰蜐儾≈仓昵o組織，利用Ilumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)植株莖組織內(nèi)生細(xì)菌的16SrDNA序列進(jìn)行測(cè)定，分析健康植株與罹病植株莖組織中的細(xì)菌群落特征差異。 【結(jié)果】火龍果健康植株莖組織的細(xì)菌群落種類和擴(kuò)增子序列變體（Amplicon sequence variant，ASV）數(shù)均低于罹病 植株；健康植株與罹病植株莖組織的細(xì)菌群落多樣性無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。在細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)中，罹病植株莖組織的放 線菌門(mén)（Actinobacteriota）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）和異球菌門(mén)（Deinococcota）相對(duì)豐度較高，而健康植株莖組織的擬 桿菌門(mén)（Bacteroidota）相對(duì)豐度較高。罹病植株莖組織的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有27個(gè)，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢 桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異球菌屬（Deinococcus）、梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、 短小桿菌屬（Curtobacterium）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、毛梭菌屬（Lachnoclostridium）、微枝形桿菌屬（Micro- virga）、溶桿菌屬（Lysobacter）、Klenkia和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）相對(duì)豐度較高。健康植株莖組織的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌 屬有26個(gè)，其中絨毛桿菌科未分類屬（norank f_Muribaculaceae）、擬桿菌屬（Bacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、甲基桿菌屬群（Methylobacterium-Methylorubrum）、黃單胞菌科未知屬（unclassified f_Xanthomonadaceae）、副桿菌屬 （Parabacteroides）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、雙歧桿菌屬（Bifi- dobacterium）、放線桿菌屬（Acinetobacter）和纖維弧菌屬（Cellvibrio）的相對(duì)豐度較高。線性判別分析（LEfSe）結(jié)果顯 示，健康植株莖組織具有較多指示菌群，而罹病植株莖組織的指示細(xì)菌屬只有4個(gè)不同的屬，分別是黃單胞菌屬、短小 桿菌屬、毛梭菌屬和新鞘氨醇單胞菌屬（Novosphingobium）。細(xì)菌功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，潰瘍病植株莖組織內(nèi)生細(xì)菌在 膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物代謝、其他氨基酸代謝和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成等4個(gè)二級(jí)功能層中的基因拷貝數(shù)顯著高 于健康植株莖（Plt;0.05）。【結(jié)論】火龍果發(fā)生莖潰瘍病后其莖組織細(xì)菌群落多樣性無(wú)明顯改變，但部分優(yōu)勢(shì)菌屬的比 例發(fā)生明顯改變，其中4個(gè)指示細(xì)菌屬可能與潰瘍病發(fā)生有關(guān)。

關(guān)鍵詞：火龍果；潰瘍病；莖組織；細(xì)菌群落；多樣性

中圖分類號(hào)：S436.679

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-1191（2024）04-1023-12

Characteristics of bacterial community in the stems of cankerdiseased pitaya plants

LIANG Zhou-yong1， YAO Zi-ting2*， CAO Xue-ying1， WEI Zeng-ting1， ZHAO Yuan3，ZHU Gui-ning2， ZOU Cheng-wu1*

（1College of Agriculture， Guangxi University/National Demonstration Center for Experimental Plant Science Education， Nanning， Guangxi 530004， China; 2Key Laboratory of Green Prevention and Control on Fruits and Vegetables in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests/ Plant Protection Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China;3Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract：[Objective]The aim was to compare the characteristics and functional differences of the endophytic bacterial communities in the stem tissues of healthy and canker diseased pitaya plants， so as to provide theoretical basis for revealing the occurrence mechanism of pitaya canker and studying the prevention and comprehensive control techniques.【Method】Stem tissues of healthy and canker diseased pitaya plants were collected， and the 16S rDNA sequences of endo- phytic bacteria in the stem tissues were determined using Illumina Miseq sequencing platform to analyze the differences of bacterial community characteristics in the stems of healthy and diseased plants. 【Result]The bacterial community species and amplicon sequence variants （ASVs） in the stems of healthy pitaya plants were lower than those of diseased plants， there was no significant difference in bacterial community diversity between healthy plants and diseased plants （Pgt;0.05）.Among the bacterial dominant bacterial phyla， the relative abundances of Actinobacteriota， Chloroflexi and Deinococcota in the stem tissue of diseased plants were higher， while the relative abundance of Bacteroidota in the stem tissue of healthy plants was higher. There were 27 dominant bacterial genera in the stem tissue of diseased plants， and the relative abundance of Pseudomonas， Bacillus， Sphingomonas， Deinococcus， Clostridium_sensu_stricto_1， Curtobacterium， Xanthomonas， Lachnoclostridium， Microvirga， Lysobacter， Klenkia and Paenibacillus was higher. There were 26 dominant bacterial genera in the stem tissue of healthy plants， and the relative abundance of norank f Muribaculaceae， Bacteroides， Lactobacillus ， Methylobacterium-Methylorubrum， unclassified_f_Xanthomonadaceae， Parabacteroides， Ralstonia， Rhodococcus， Streptomyces， Bifidobacterium， Acinetobacter and Cellvibrio was higher. The results of linear discriminant analysis （LEfSe） showed that there were more indicator bacteria in the stem tissue of healthy plants than those in the stem tissue of diseased plants， while the indicator bacteria in the stems of diseased plants only belonged to four different genera， namely Xanthomonas， Curtobacterium， Lachnochlorostridium and Novosphingobium. The results of bacterial function prediction showed that the gene copy numbers of endophytic bacteria in the four secondary functional layers of membrane transport， carbohydrate metabolism， other amino acid metabolism and other secondary metabolite biosynthesis were significantly higher than those in healthy plant stems （Plt;0.05）. 【Conclusion]After the occurrence of pitaya stem canker， there is no obvious change in the diversity of the endophytic bacterial community in the stem tissues. How- ever， the proportions of some dominant bacterial phyla and genera change obviously. Among them， four indicator bacte- rial genera may be related to the occurrence of stem ulcer disease.

Key words： pitaya; canker; stem tissue; bacterial community; diversity

Foundation items： Guangxi Natural Science Foundation （2023GXNSFAA026271） ; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences （Guinongke 2023YM05） ; Science and Technology Development Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（ Guinongke 2021ZX28）

0引言

[研究意義]火龍果（Hylocereus undatus）是近年興起的熱帶、亞熱帶水果，隨市場(chǎng)需求量的增加，栽培面積逐年擴(kuò)大。2021年，我國(guó)火龍果種植面積約7萬(wàn)ha，超過(guò)越南成為全球火龍果種植面積和產(chǎn)量第一的國(guó)家（趙玉山，2023）。我國(guó)火龍果種植區(qū)主要分布在廣西、廣東、海南、云南和貴州等地，其中廣西種植面積最大（唐景美等，2020）。由新暗色柱節(jié)孢（Neoscytalidium dimidiatum）引起的火龍果潰瘍病是危害最嚴(yán)重的火龍果病害之一，該病原菌侵染火龍果莖和果實(shí)，導(dǎo)致火龍果減產(chǎn)甚至絕收（彭超等，2015;歐善生等，2019;柏自琴等，2020;姚姿婷等，2023a）。田間主要采用化學(xué)藥劑防治火龍果潰瘍病，但近年由于氣候反常，以及病原菌抗藥性的出現(xiàn)，導(dǎo)致火龍果潰瘍病防治難度增大，給火龍果生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重影響。植物內(nèi)生細(xì)菌是植物微生物組的重要成員，與宿主植物在自然界長(zhǎng)期影響下協(xié)同進(jìn)化，相互選擇，相互影響。揭示植物內(nèi)生細(xì)菌群落區(qū)系特征，不僅有助于了解宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，還可以挖掘利用有益內(nèi)生細(xì)菌功能菌株，為生物防治提供重要的微生物資源（呂嬌嬌等，2022）。目前對(duì)火龍果內(nèi)生菌及其功能認(rèn)識(shí)不足，需通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)探究火龍果莖潰瘍病相關(guān)內(nèi)生細(xì)菌組成和功能類群特征，明確植物微生物組變化與病害發(fā)生的關(guān)系，為篩選火龍果潰瘍病的生防細(xì)菌提供參考，為綜合防控火龍果潰瘍病提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，植物微生物組在植物營(yíng)養(yǎng)和植物健康中發(fā)揮著重要作用，植物病害的發(fā)生與植物微生物菌群及多樣性變化具有一定的相關(guān)性，當(dāng)植物微生物組中有害菌數(shù)量增加且有益菌數(shù)量減少時(shí)，植物病害發(fā)生率隨之增加，當(dāng)有益菌增加且多樣性復(fù)雜時(shí)，植物病害的發(fā)生率隨之降低（Larousse et al.，2017;Zhang et al.，2017;姬俊華等，2022）。內(nèi)生細(xì)菌是植物微生物組中的重要組成部分，廣泛分布在植物各器官組織中。在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，內(nèi)生細(xì)菌利用宿主植物分泌物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與宿主植物相互作用從而影響植物的生長(zhǎng)（Wanget al.，2021），如土壤中的鏈霉菌進(jìn)人馬鈴薯塊莖獲取養(yǎng)分后快速增殖而導(dǎo)致發(fā)生馬鈴薯瘡痂?。⊿hietal.，2019）。有些細(xì)菌通過(guò)分泌有益物質(zhì)或抑制植物病原體從而維持宿主植物的健康生長(zhǎng)，如內(nèi)生根瘤菌（Rahnella aquatilis）通過(guò)pH介導(dǎo)的趨化作用定位到受尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染的根部，通過(guò)向根內(nèi)部分泌葡萄糖酸導(dǎo)致環(huán)境酸化以抵消尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)的定殖環(huán)境堿化，從而降低尖孢鐮刀菌引起的枯萎病發(fā)生率（Palmieri et al.，2020）。研究發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)菌對(duì)火龍果潰瘍病菌具有較好的抑制作用。張振華等（2019）篩選到2株對(duì)火龍果潰瘍病室內(nèi)防效達(dá)48.85%和 50.41%的細(xì)菌菌株，但未對(duì)其進(jìn)行種類鑒定。皮氏類芽孢桿菌（Paenibacilluspeoriae）及多黏類芽孢桿菌（P. polymyxa）對(duì)火龍果潰瘍病菌具有較好的拮抗效果，田間防效有待進(jìn)一步確定（陳靜等，2015;逄崇洋等，2017）。Ratanaprom 等（2021）發(fā)現(xiàn)，利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）培養(yǎng)上清液可直接抑制新暗色柱節(jié)孢的生長(zhǎng)，當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液濃度達(dá)50%時(shí)，對(duì)新暗色柱節(jié)孢的菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá) 100%。以上研究明確了一些拮抗細(xì)菌對(duì)火龍果潰瘍病具有一定的生防應(yīng)用潛力。[本研究切人點(diǎn)]火龍果潰瘍病菌首先侵染火龍果嫩莖，病斑迅速擴(kuò)大，空氣干燥時(shí)，病斑呈灰白色木栓化突起;濕度大時(shí)，莖部腐爛，干燥后形成圓形穿孔病斑，病斑會(huì)迅速擴(kuò)散至成熟莖和果實(shí)，嚴(yán)重影響火龍果產(chǎn)量和質(zhì)量（姚姿婷等，2023b）。目前，對(duì)火龍果莖組織內(nèi)生細(xì)菌的研究較少，尤其是對(duì)火龍果莖組織的內(nèi)生細(xì)菌群落特征、火龍果莖潰瘍病相關(guān)細(xì)菌群落及其功能群和生防潛力缺乏了解。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]采用擴(kuò)增子測(cè)序方法分析和比較火龍果健康植株與發(fā)生莖潰瘍病植株莖組織之間內(nèi)生細(xì)菌群落特征差異，初步探索火龍果莖潰瘍病發(fā)生與其莖組織細(xì)菌群落組成及多樣性的關(guān)系，為揭示火龍果潰瘍病發(fā)生機(jī)制和研究防治技術(shù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采樣地點(diǎn)位于廣西南寧市廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科學(xué)研究基地（23°14'44\"N，108°12'56\"E）火龍果種植園，植株行距2.5 m。2021年 10月于該種植園采集健康及發(fā)生莖潰瘍病的金都一號(hào)火龍果植株莖。選擇3行采樣，每采樣行之間間隔5行，在每一采樣行隨機(jī)選取6株符合條件植株（健康植株或罹病植株），每株剪下2條嫩莖，將12條嫩莖混合均勻裝入無(wú)菌采樣袋作為1個(gè)重復(fù)樣本，每種植株各采集個(gè)重復(fù)樣本。罹病植株均處于潰瘍病發(fā)生初期，莖面病斑褪綠面積5%～15%，在同一行隨機(jī)選取6 株未罹病的健康植株采樣。樣本處理參考姚姿婷等（2023b）的方法。罹病莖組織樣本（處理組1）編號(hào)分別為SS1、SS2和SS3，健康莖組織樣本（處理組

2）編號(hào)分別為SH1、SH2和SH3，保存于超低溫冰箱（-80℃）待用。

1.2樣品DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（美國(guó)Omega Bio- Tek公司）提取細(xì)菌總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整度，使用NanoDrop 2000（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）檢測(cè)DNA濃度和純 度。使用引物799F（5'-AACMGGATTAGATACCCK G-3'）和1392R（5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3'）PCR擴(kuò) 增樣品細(xì)菌16SrDNA的V5～V7區(qū)，使用試劑盒 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國(guó)Axygen公司）純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè) 序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在Illumina Miseq PE300平臺(tái)完成對(duì)微生物DNA片段的雙端（Paired-end）測(cè)序。

1.3測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析

將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本拆分后，使用fastp和FLASH對(duì)Reads進(jìn)行引物去除、質(zhì)量過(guò)濾、去噪、拼接和嵌合體去除等步驟，使用序列降噪方法（DADA2/Deblur等）處理優(yōu)化數(shù)據(jù)，獲得擴(kuò)增子序列變體（Amplicon sequence variant，ASV）的代表序列和豐度信息。按樣本最小序列數(shù)對(duì)各樣本進(jìn)行抽平，將抽平后的ASV代表序列比對(duì)細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)Silval38/16S進(jìn)行物種分類注釋，從而獲得每個(gè)樣本中細(xì)菌群落在各分類水平的具體組成；基于ASV代表序列和豐度信息，進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性分析（Alpha多樣性和Beta多樣性）、物種差異分析和細(xì)菌功能預(yù)測(cè)分析等。用Mothur（version 1.30）計(jì)算Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)及覆蓋率等Alpha多樣性指數(shù)；用R軟件包vegan完成主坐標(biāo)分析（Principal coordi-nates analysis，PCoA）即Beta多樣性分析；使用線性判別分析（Linear discriminant analysis effect size，LEfSe）（LDAgt;3.5）確定從門(mén)到屬水平對(duì)兩組間劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的細(xì)菌類群；使用PICRUSt2（v2.2.2），通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.kegg.jp/）比對(duì)，進(jìn)行細(xì)菌功能預(yù)測(cè)分析。上述測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析均在美吉生物云交互式分析平臺(tái)（www.majorbio.com）完成。使用Geno Toul Bioinfo和Sige-nae團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的在線分析工具（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制韋恩圖。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析組間Alpha多樣性指數(shù)差異，用Welch's T-test檢驗(yàn)組間物種差異顯著性和預(yù)測(cè)功能類群差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1火龍果健康植株與潰瘍病植株莖組織細(xì)菌 群落多樣性分析結(jié)果

分別對(duì)健康莖和罹病莖組織的3個(gè)樣本進(jìn)行 16SrDNA測(cè)序，共獲得有效序列192373條，平均每 個(gè)樣本有效序列32122±1500條。將樣本序列數(shù)標(biāo) 準(zhǔn)化，經(jīng)DADA2處理序列和去重，以序列相似性100%聚類生成ASV，2組6個(gè)樣本共得到2061個(gè)ASVs，所有樣本覆蓋率均在99.99%以上，表明所得 數(shù)據(jù)可真實(shí)反映樣本的細(xì)菌群落多樣性。

韋恩圖（圖1）分析發(fā)現(xiàn)，火龍果健康植株與罹病 植株莖組織共有ASVs為350個(gè)，共有ASVs在健康 植株的相對(duì)豐度總和為60.74%，在罹病植株的相對(duì) 豐度總和為58.14%。健康植株的特有ASVs為718個(gè)，相對(duì)豐度總和為39.26%；罹病植株特有ASVs為 993個(gè)，相對(duì)豐度總和為41.86%。罹病植株與健康植 株共有ASVs的相對(duì)豐度總和接近，且均超過(guò)50.00%；健康植株特有ASVs比罹病植株少275個(gè)。

進(jìn)一步通過(guò)分析菌群豐富度（Chao1指數(shù)）、多 樣性（香農(nóng)指數(shù)）和優(yōu)勢(shì)類群均勻度（辛普森指數(shù)）比 較火龍果健康植株與罹病植株莖組織細(xì)菌群落的 Alpha多樣性差異，結(jié)果（表1）顯示，健康植株莖組 織細(xì)菌群落的Chaol指數(shù)和辛普森指數(shù)均低于罹病 植株，香農(nóng)指數(shù)高于罹病植株，但均未達(dá)顯著差異水 平（Pgt;0.05，下同）。

再通過(guò)PCoA比較火龍果健康植株與罹病植株莖組織細(xì)菌群落的Beta多樣性差異，結(jié)果如圖2所示，罹病植株與健康植株的莖組織樣本產(chǎn)生明顯分離，第一主坐標(biāo)（PCoA1）的貢獻(xiàn)率為42.7%，第二主坐標(biāo)（PCoA2）的貢獻(xiàn)率為19.1%，潰瘍病的發(fā)生使火龍果莖組織的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但差異不顯著。

2.2火龍果健康植株與潰瘍病植株莖組織細(xì)菌群落組成分析結(jié)果

對(duì)樣本的ASV進(jìn)行物種分類注釋，結(jié)果（表2）顯示，2組間內(nèi)生細(xì)菌群落物種數(shù)量存在差異，火龍果健康植株莖組織中各分類地位的細(xì)菌群落物種數(shù)量均少于潰瘍病植株莖組織，但差異均不顯著。健康植株莖組織樣本的細(xì)菌分屬于26門(mén)54綱127目217科397屬492種1068個(gè)ASVs；潰瘍病植株莖組織樣本的細(xì)菌分屬于31門(mén)68綱148目247科466屬569種1343個(gè)ASVs。

在門(mén)分類水平（圖3），所有莖組織樣本內(nèi)生細(xì)菌共隸屬于34門(mén)，在健康植株和罹病植株莖組織共有6個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為：變形菌門(mén)（Proteo-bacteria）39.79%和42.25%、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）16.37%和11.04%、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）16.25%和16.67%、放線菌門(mén)（Actinobacteriota）15.78%和18.47%、脫硫桿菌門(mén)（Desulfobacterota）6.28%和3.37%、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）1.05%和2.23%；罹病植株莖組織還有2個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，分別是異球菌門(mén)（Deinococ-cota，2.73%）和Patescibacteria（1.09%）。健康植株和罹病植株莖組織樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果（表3）顯示，罹病植株莖組織的放線菌門(mén)和異球菌門(mén)相對(duì)豐度極顯 著高于健康植株莖組織（Plt;0.01，下同）、綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于健康植株莖組織（Plt;0.05，下同），而 擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度極顯著低于健康植株莖組織。

在綱分類水平（圖4），所有莖組織樣本內(nèi)生細(xì)菌 共隸屬于78綱，在健康植株和罹病植株莖組織共有 8個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱，相對(duì)豐度分別為y-變形菌綱（Gam-maproteobacteria）25.48%和26.82%、擬桿菌綱（Bac-teroidia）16.20%和11.01%、a-變形菌綱（Alphaproteo-bacteria）14.30%和15.41%、放線菌綱（Actinobacte-ria）13.53%和16.33%、芽孢菌綱（Bacilli）10.00%和9.88%、梭菌綱（Clostridia）6.21%和6.76%、脫硫單胞菌綱（Desulfuromonadia）5.84%和2.87%、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）1.29%和1.54%；罹病植株莖組織還有3個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱，分別是異球菌綱（Deino-cocci，2.73%）、Saccharimonadia（健康植株和罹病植株莖組織相對(duì)豐度分別為0.77%和1.09%）和綠彎菌綱（Chloroflexia，1.00%）。健康植株和罹病植株莖組織樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果（表4）顯示，罹病植株莖組織的放線菌綱和異球菌綱相對(duì)豐度極顯著高于健康植株莖組織、綠彎菌綱相對(duì)豐度顯著高于健康植株莖組織，而擬桿菌綱相對(duì)豐度極顯著低于健康植株莖組織，與門(mén)分類水平上的差異情況一致。

在屬分類水平（圖5），所有莖組織樣本內(nèi)生細(xì)菌共注釋到580屬，健康植株莖組織中的特有屬比罹病植株莖組織中的特有屬少69個(gè)。將相對(duì)豐度大于1.00%的屬定義為優(yōu)勢(shì)屬。健康植株莖組織的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有26個(gè)，相對(duì)豐度總和為58.71%，罹病植株莖組織的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有27個(gè)，相對(duì)豐度總和為57.22%；健康植株和罹病植株莖組織共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有15個(gè)，相對(duì)豐度分別為叢毛單胞菌科未知屬（unclassified_f_Comamonadaceae）4.89%和5.28%、絨毛桿菌科未分類屬（norank f Muribaculaceae）7.48%和4.56%、假單胞菌屬（Pseudomonas）2.27%和4.19%、芽孢桿菌屬（Bacillus）1.24%和4.08%、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）1.52%和3.10%、馬賽菌屬（Mas-silia）4.24%和2.84%、地桿菌屬（Geobacter）5.78%和2.83%、微桿菌屬（Microbacterium）1.53%和2.30%、擬桿菌屬（Bacteroides）3.42%和1.75%、乳桿菌屬（Lac-tobacillus）2.73%和1.62%、類諾卡氏屬（Nocardioides）1.31% 和 1.50%、甲基桿菌屬群（Methylobacterium-Methylorubrum）2.86%和 1.39%、毛螺菌科未知屬（unclassified_f_Lachnospiraceae） 1.69%和 1.26%、伯克氏菌屬群（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）1.23%和 1.09%、根瘤菌屬群（AllorhizobiumNeorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）1.23%和1.02%。健康植株和罹病植株莖組織樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果（表5）顯示，在健康植株莖組織的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中，相對(duì)豐度顯著或極顯著高于罹病植株莖組織的有絨毛桿菌科未分類屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬、甲基桿菌屬群、黃單胞菌科未知屬（unclassifiedf_Xanthomonadaceae）、副桿菌屬（Parabacteroides）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、放線桿菌屬（Acinetobacter）和纖維弧菌屬（Cellvibrio）;在罹病植株莖組織的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中，相對(duì)豐度顯著或極顯著高于健康植株莖組織的有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、異球菌屬（Deinococcus）、梭菌屬（Clostridium_ sensu_stricto_l）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、黃單胞菌屬（Xan-thomonas）、毛梭菌屬（Lachnoclostridium）、微枝形桿菌屬（Microvirga）、溶桿菌屬（Lysobacter）、Klen-kia和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。

利用LEfSe分析火龍果健康植株和潰瘍病植株2組樣本中最能解釋二者差異的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)不同分類水平共5個(gè)分支上的細(xì)菌顯著富集在健康植株莖組織，分別是擬桿菌門(mén)（擬桿菌門(mén)～擬桿菌屬）、顫螺菌目[顫螺菌目（Oscillospirales）～顫螺菌目未分類科（norank_f_Oscillospirales）]、Defluvicoccales、雙歧桿菌屬和水桿菌屬（Aquabacterium）；只有4個(gè)不同的屬富集在罹病植株莖組織中，分別是黃單胞菌屬、短小桿菌屬、毛梭菌屬和新鞘氨醇單胞菌屬（Novosphingobium）（圖6）。上述細(xì)菌對(duì)2組樣本差異的影響最大，其LDA分?jǐn)?shù)均大于3.5。

2.3火龍果莖組織細(xì)菌的功能預(yù)測(cè)結(jié)果

使用PICRUSt2將ASV序列數(shù)據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)火龍果健康植株和潰瘍病植株莖組織細(xì)菌功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。一級(jí)功能預(yù)測(cè)結(jié)果（圖7和表6）顯示，潰瘍病植株莖組織內(nèi)生細(xì)菌在環(huán)境信息處理通路的基因拷貝數(shù)顯著高于健康植株莖組織樣本，2組樣本莖組織內(nèi)生細(xì)菌在其他各通路中的豐度水平無(wú)顯著差異。對(duì)細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和代謝4個(gè)基因拷貝數(shù)較高的一級(jí)功能進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)功能預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖8、表6和表7）顯示，潰瘍病植株莖組織內(nèi)生細(xì)菌在膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物代謝、其他氨基酸代謝和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成4個(gè)通路中的基因拷貝數(shù)顯著高于健康植株莖。

3討論

利用高通量測(cè)序技術(shù)研究植物健康植株和罹病植株的生態(tài)位微生物多樣性已有較多報(bào)道（Bezetal.，2021;Ewing et al.，2021;Yang and Ancona，2021）。Ewing等（2021）研究了毛山櫸葉斑病與非葉斑病的葉際微生物群落結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)二者間細(xì)菌群落多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)）無(wú)顯著差異，但病葉樣本的優(yōu)勢(shì)群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)（辛普森指數(shù)）顯著高于無(wú)病狀葉片樣本，且隸屬于沃爾巴克氏屬（Wolbachia）、歐文氏屬（Erwinia）、類芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的ASVs只出現(xiàn)在帶病斑的葉片樣本中，表明這些ASVs在病葉樣本中出現(xiàn)是其可能以某種方式與葉斑病相關(guān)聯(lián)。Yang和Ancona（2021）研究柑橘基腐病非感病植株與感病植株根系內(nèi)生微生物多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感病根系細(xì)菌豐富度顯著下降，尤其是可能對(duì)根系有益的假單胞菌屬和鏈霉菌屬在感病根系的相對(duì)豐度顯著降低，推測(cè)基腐病的發(fā)生可能與柑橘根系土壤有益細(xì)菌顯著減少有關(guān)。本研究通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)火龍果莖潰瘍病罹病植株和健康植株莖組織樣本進(jìn)行16SrDNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)雖然罹病植株莖組織的細(xì)菌豐富度高于健康植株，但無(wú)顯著差異，細(xì)菌群落多樣性也無(wú)顯著差異。健康植株與罹病植株莖組織的內(nèi)生細(xì)菌差異主要體現(xiàn)在感染潰瘍病的莖內(nèi)生細(xì)菌種群的豐度發(fā)生了變化，LEfSe分析結(jié)果進(jìn)一步顯示黃單胞菌屬、短小桿菌屬、毛梭菌屬和新鞘氨醇單胞菌屬可作為罹病植株莖組織樣本的指示種，4個(gè)細(xì)菌屬在罹病植株莖組織中富集，這些菌屬的成員菌株大多為條件致病菌，且均具有一定的降解宿主植物細(xì)胞壁作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行利用的能力，從而可能促進(jìn)病原菌的致病過(guò)程。黃單胞菌屬和短小桿菌屬是典型的植物病原菌屬，宿主范圍廣泛，但尚未見(jiàn)其對(duì)火龍果莖或果實(shí)致病的報(bào)道，該2種細(xì)菌屬是否能促進(jìn)病原菌致病還有待進(jìn)一步確認(rèn)。毛梭菌屬是革蘭氏陽(yáng)性菌，厭氧，研究報(bào)道該菌屬主要來(lái)源于人類和動(dòng)物腸道及土壤中，其成員菌株可作為結(jié)直腸腺瘤的無(wú)創(chuàng)診斷標(biāo)志物，而且該菌屬成員通常出現(xiàn)在急性結(jié)腸炎患者中，該菌屬的出現(xiàn)總伴隨著產(chǎn)生短鏈脂肪酸有益細(xì)菌的豐度下降，故被稱為“有害細(xì)菌”。但該菌屬對(duì)植物健康生長(zhǎng)是否有影響尚不清楚（Liang et al.，2020）。有研究發(fā)現(xiàn)毛梭菌屬可作為區(qū)分木薯根腐病耐感品種的指示菌屬之一，且該屬在木薯根腐病感病品種的塊根顯著富集，其出現(xiàn)是否有利于根腐病發(fā)生還有待進(jìn)一步研究確定（Li et al.，2020）。新鞘氨醇單胞菌屬不是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，只在罹病植株莖組織樣本中檢測(cè)到該菌屬ASV，其平均相對(duì)豐度僅為0.11%。該細(xì)菌屬的一些成員菌株具有形成聚集群落的能力，從而顯著促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)（Zhang et al.，2016;Wang et al.，2022）。由于該菌屬的比例不高，其功能還有待進(jìn)一步研究確定。

在健康植株莖組織的內(nèi)生細(xì)菌中，擬桿菌屬和雙歧桿菌屬既是優(yōu)勢(shì)菌屬又是與罹病植株莖組織存在極顯著差異的指示菌群，隸屬于這2個(gè)細(xì)菌屬的多個(gè)成員菌株已被鑒定為植物有益微生物，這些微生物可能有助于維持植物激素平衡，控制根系發(fā)育，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)獲取，并保護(hù)植物免受病原體的侵害（Ver-bon and Liberman，2016）。因此，火龍果種植過(guò)程中，提高有益菌屬尤其是擬桿菌屬和雙歧桿菌屬的比例，可能有助于提高對(duì)潰瘍病的抗性，促進(jìn)植株健康生長(zhǎng)。

潰瘍病植株莖組織的內(nèi)生細(xì)菌在膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物代謝、其他氨基酸代謝和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成4個(gè)通路中的豐度顯著高于健康植株莖組織，這一現(xiàn)象可能與潰瘍病植株莖組織中某些病原細(xì)菌屬的豐度增加有關(guān)。這些病原細(xì)菌屬豐度的增加可能增強(qiáng)了病原細(xì)菌對(duì)宿主植物細(xì)胞壁的降解能力，從而促進(jìn)了代謝過(guò)程。此外，這些變化可能為病原真菌提供了幫助，增強(qiáng)了其致病性，或者導(dǎo)致潰瘍病的癥狀更復(fù)雜和嚴(yán)重。表明植物體內(nèi)菌群比例的微妙變化與病害的發(fā)生和發(fā)展存在密切聯(lián)系。

在今后的研究工作中，可進(jìn)一步分析不同品種的火龍果、不同罹病等級(jí)以及不同生態(tài)位的微生物群落組成和變化與潰瘍病菌的相互作用關(guān)系，以期能更全面地解析火龍果潰瘍病的發(fā)生機(jī)制及火龍果微生物群落的功能，從而為研發(fā)火龍果潰瘍病綜合防治技術(shù)提供參考。

4結(jié)論

火龍果發(fā)生莖潰瘍病后其莖組織細(xì)菌群落多樣性無(wú)明顯改變，但部分優(yōu)勢(shì)菌屬的比例發(fā)生明顯改變，其中4個(gè)指示細(xì)菌屬黃單胞菌屬、短小桿菌屬、毛梭菌屬和新鞘氨醇單胞菌屬可能與潰瘍病發(fā)生有關(guān)。

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（責(zé)任編輯麻小燕）