利用抗壞血酸過氧化物酶揭示生防放線菌XFS-4對大豆胞囊線蟲的抗性

項鵬　楊樹　李寶華　李艷杰　李紅鵬　鹿文成　栗銘徽　張武

摘要：于2021年在黑龍江省黑河市從大豆根際土壤中分離獲得1株對大豆胞囊線蟲具有較高活性的放線菌 XFS-4，為了解該生防放線菌XFS-4對大豆胞囊線蟲的作用機理，以黑河市主栽大豆品種黑河43為試材，用 XFS-4 發(fā)酵液做種子包衣處理，盆栽條件下人工接種大豆胞囊線蟲，以未接種作對照，接種后 4、7、11、14 d取樣，測定大豆葉內(nèi)抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性變化。同時，以抗壞血酸過氧化物酶基因序列設計引物，利用RT-PCR技術(shù)，分析該基因在菌株XFS-4包衣黑河43后抗大豆胞囊線蟲過程中的表達差異，從基因轉(zhuǎn)錄表達水平上對大豆抗壞血酸過氧化物酶基因（Gm-Apx）進行研究，以發(fā)現(xiàn)該基因與大豆胞囊線蟲（SCN）抗性之間的關系。結(jié)果表明，XFS-4包衣黑河43接種大豆胞囊線蟲4、7 d后，APX活性明顯高于對照，接種條件下的黑河43 APX活性隨大豆生長一直升高。在接種大豆胞囊線蟲后，其菌株XFS-4包衣黑河43處理組中，Gm-Apx相對表達量在接種后4、7 d表達上調(diào)，而在接種11、14 d表達下調(diào)，說明該基因參與了大豆早期防御胞囊線蟲的侵染過程，對植物抗性反應及解除脅迫誘導的氧化損害起了很重要的作用。

關鍵詞：放線菌；大豆胞囊線蟲；抗壞血酸過氧化物酶；RT-PCR

中圖分類號：S435.651文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）09-0159-06

大豆胞囊線蟲（SCN）是大豆根部病害之一，被認為是造成大豆減產(chǎn)的主要原因，可導致大面積減產(chǎn)，危害十分嚴重［1-2］。在我國可造成1.2億元的經(jīng)濟損失［3］，在全球范圍內(nèi)損失約為15億美元［4］。黑龍江省黑河市是我國大豆主產(chǎn)區(qū)，2022年大豆播種面積達143.86萬hm2［5］，大豆胞囊線蟲對當前大豆的安全生產(chǎn)構(gòu)成了嚴重威脅，一般發(fā)病田減產(chǎn)10%～20%，嚴重時可達30%～50%，在開花前后發(fā)生可引起死苗甚至造成絕產(chǎn)［6］。

為振興我國大豆產(chǎn)業(yè)，2019年3月，國家啟動了“大豆振興計劃”，主要目標是“一擴兩提”，其中：“擴”就是擴大面積，力爭到2022年全國大豆種植面積達到933.33萬hm2；“提”就是提高單位面積產(chǎn)量、提升品質(zhì)，力爭到2022年全國大豆平均產(chǎn)量達到135 kg/667 m2［7］。有效防控大豆胞囊線蟲危害，減少損失，提單位面積產(chǎn)量、提品質(zhì)是大豆振興計劃的重要環(huán)節(jié)。

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院黑河分院植保室在前期工作中，從大豆根際土壤中分離獲得1株對大豆胞囊線蟲具有較高活性的放線菌XFS-4，包衣處理后對苗期大豆第一代大豆胞囊線蟲抑制率達到59.77%，經(jīng)形態(tài)學特征、生理生化試驗測定及16S rDNA序列同源性分析，確定該菌株為沙阿霉素鏈霉菌［8］。為了解生防放線菌XFS-4對大豆胞囊線蟲的作用機理，本研究以合成關鍵酶抗壞血酸過氧化物酶基因序列設計引物，大豆黑河43和菌株 XFS-4 為試材，利用酶活測定和RT-PCR分析菌株XFS-4包衣黑河43后，在接種大豆胞囊線蟲前后抗壞血酸過氧化物酶活性的變化和基因表達量的變化，初步明確菌株XFS-4對大豆胞囊線蟲抗性過程中抗壞血酸過氧化物酶的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試大豆品種黑河43號由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院黑河分院提供；供試生防菌株XFS-4保存于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院黑河分院植保室；供試大豆胞囊線蟲3號生理小種取自筆者研究室試驗基地。

1.2 菌株發(fā)酵液的制備

將保存好的菌株XFS-4接種在高氏一號平面培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。將平板上培養(yǎng)好的菌落接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 三角瓶振蕩培養(yǎng)7d后過濾，獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液置于4 ℃冰箱中備用［9］。

1.3 種子處理方法

用5% NaClO溶液對大豆種子進行表面消毒，再用無菌水沖洗5次。用制備好的發(fā)酵液按1%的種子量進行種子包衣處理，待干燥后裝袋、編號備用［10］。

1.4 大豆胞囊線蟲的制備

采用改良淘洗-過篩法從采取的土樣中分離胞囊，在體視鏡下挑取新鮮、飽滿、成熟、均一的胞囊。胞囊先用0.5%NaClO溶液進行消毒，再用無菌水沖洗5次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行孵化，將孵化后得到的2齡幼蟲制備成200條/mL的懸浮液［11］。

1.5 大豆材料的播種與接種

將XFS-4發(fā)酵液包衣好的黑河43種子播種在16 cm×16 cm的黑色塑料缽中，缽中裝有滅菌沙土（50%細沙，50%有機土壤），以未包衣的黑河43作對照。當幼苗長出2張子葉時，將制備好的2齡幼蟲懸浮液進行接種，每株接種10 mL，以無菌水接種作對照。

1.6 取樣方法

分別在接種4、7、11、14 d后取樣，處理組和對照組分別取長勢一致的幼苗3株，用自來水快速沖洗葉部，再用蒸餾水洗凈，濾紙吸干后，記錄好處理、對照標簽分別放入收集袋中，液氮冷凍，-80 ℃保存。每個處理3次獨立的重復。

1.7 酶粗提液的提取

提取緩沖液為50 mmol/L pH值7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含2 mmol/L AsA和5 mmol/L EDTA）。參照沈文飚等的方法［12］提取。稱取1.0 g大豆葉片樣品放入研缽中，加入2.0 mL提取緩沖液和少量石英砂充分研磨，用3.0 mL上述提取緩沖液沖洗研缽和研柞，將沖洗液和勻漿一起轉(zhuǎn)入離心管中。4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，上清液即為酶粗提液。將酶粗提液放入冰箱中-20 ℃保存，待測定酶活。

1.8 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定

測定反應液為50 mmol/L pH值7.0磷酸緩沖液（內(nèi)含0.5 mmol/L AsA、0.1 mmol/L H2O2和 0.1 mmol/L EDTA-Na2）。參照沈文飚等的方法［12］測定。室溫下1 min 1 g鮮質(zhì)量氧化1 μmol ASA的酶量作為1個酶活性單位（U），酶活力以D290 nm/（min·g） FW表示。

APX活性（U/g FW）=（（ΔD290 nm×提取液體積（mL））/（樣品質(zhì)量（g）×加酶體積（mL） ×t（min）））。

1.9 抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因表達量分析

1.9.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒說明書進行總RNA的提取，RNA D260 nm/D280 nm 值在 2.0～2.2的范圍內(nèi)。將1 μg總RNA 加入微量離心管中并于70 ℃溫育10 min，短暫離心后置于冰上，加入試劑建立一個20 μL的反應體系，將反應體系置于42 ℃溫育60 min、95 ℃加熱5 min、5 ℃放置 5 min。

1.9.2 引物設計

APX基因在GeneBank的登錄號為NM_001251432.2，根據(jù)該序列利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，上游引物為5′-GGTGCTGTAGGAGTTGTAG-3′，下游引物為5′-AAAGTCTGAATGGCTGTG-3′，基因片段為216 bp。內(nèi)參基因上游引物為5′-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′，下游引物為5′-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3′，基因片段為126 bp。引物合成由哈爾濱生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.9.3 PCR反應條件

APX基因：95 ℃預變性 3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃充分延伸10 min。

1.9.4 RT-PCR反應條件

95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（熒光采集1次），95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。進行Real-time PCR反應時，為了盡可能減少因加樣引起的處理間及重復間的誤差，根據(jù)試驗要求盡可能先混合樣品再分裝。每個樣品的相對表達量的值等于目的基因的表達量均值減去內(nèi)參基因的表達量均值，應用比較CT值法（2-ΔΔCT）進行基因表達的相對定量計算和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XFS-4接種大豆胞囊線蟲后根內(nèi)抗壞血酸過氧化物酶的變化

從圖1可以看出，在接種SCN情況下，菌株XFS-4包衣黑河43的APX活性高于對照，隨大豆生長呈先升高后下降趨勢。接種條件下的黑河43，其APX活性隨大豆生長一直升高，說明植株在線蟲的侵染下，APX活性持續(xù)升高防御植物細胞外界氧化脅迫，而XFS-4包衣后的黑河43在7 d后開始下降。所以，抗壞血酸過氧化物酶的活性變化在XFS-4處理大豆抗大豆胞囊線蟲的過程中起重要作用。

2.2 樣品RNA的提取

取大豆樣品1 μL 總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，可以清晰分辨28S rRNA和18S rRNA，紫外分光光度計測得濃度較好，符合進一步RT-PCR的要求（圖2）。

2.3 PCR擴增結(jié)果

通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的特異性（圖3至圖6），Gm-Apx基因和Gm-Actin基因的凝膠電泳結(jié)果都僅有1條電泳條帶，均得到特異性擴增目的產(chǎn)物。其中A1-H3和I1-P3是指16個處理3次重復，共48個上樣樣品。

2.4 對PCR擴增產(chǎn)物測序

將得到的PCR產(chǎn)物進行測序，得到216 bp的片段，經(jīng)過BLAST比對分析表明，與已報道序列NM_001251432具有高同源性，相似度100%。結(jié)果如下：5′-GGTGCTGTAGGAGTTGTAGTTACTGCCGCAGTGGTGATCATCAGTTACTTGTATGAAGTTCGCAAAAGAGGGAAGTAAACTGGACTTGTTCATTTCACTTGGCTGTTACGTTTGCGTGACCCTGACCCATAATGTGAAAACAGGGTTCATTTTTGCAGCTTCAGATTCTGTTTACTTAGTACCAATAAAGAATAATGCCACAGCCATTCAGACTTT

-3′。

2.5 Gm-Apx和Gm-Actin基因的熒光定量曲線分析

通過對試驗中涉及的主要參數(shù)分析，目的基因的擴增曲線為標準的“S”形，熔解曲線的峰型單一（圖7、圖8），內(nèi)參基因的擴增曲線為標準的“S”形，溶解曲線的峰型單一（圖9、圖10），說明樣品的質(zhì)量較高，引物的特異性較好，無引物二聚體及非特異性擴增產(chǎn)物，內(nèi)參基因和目的基因的Tm值分別為84.5、83.5 ℃。

2.6 Gm-Apx基因的相對定量表達分析

綜合分析Real-time PCR的結(jié)果，大豆根內(nèi)Gm-Apx基因響應SCN的侵染，在各處理中響應的方式相似，接種前后的同期樣本中該基因的相對表達量差值整體上均出現(xiàn)先上調(diào)后下降的趨勢，但表達效率不同。在接種無菌水4、7、11、14 d后，Gm-Apx基因在菌株XFS-4包衣黑河43處理組中的相對表達量分別為黑河43對照中表達量的0.79、0.85、0.51、0.97倍（圖11），即菌株XFS-4包衣的黑河43在未接種線蟲的情況下，其Gm-Apx的表達下調(diào)。

Gm-Apx在接種大豆胞囊線蟲侵染后的4、7、11、14 d，其菌株XFS-4包衣黑河43處理組中相對表達量分別為黑河43對照中表達量的1.46、1.08、0.87、0.92倍（圖12），即在接種后4、7 d表達上調(diào)，而在接種11、14 d表達下調(diào)，說明該基因受到線蟲侵染的誘導表達，參與了大豆早期防御胞囊線蟲的侵染過程。

3 討論與結(jié)論

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是降解過氧化氫的關鍵酶，能提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性和增強抗氧化代謝的水平，是提高植物抗逆性的有效途徑之一。近年來，關于APX基因功能的研究主要集中在植物抗逆方面，目前多種植物的APX基因在誘導抗性方面的作用已有報道。在非生物脅迫條件下，水稻、白樺中APX基因表達上調(diào)［13-14］。Park等在甘薯中成功克隆到swAPX1基因，研究發(fā)現(xiàn)swAPX1基因在受到外界非生物脅迫時，其表達量均明顯升高，說明了swAPX1基因在清除甘薯葉片中的過氧化氫方面發(fā)揮了重要作用，從而有利于植株克服非生物和生物脅迫造成的氧化損傷［15］。Shi等研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下，轉(zhuǎn)大麥APX基因的擬南芥葉片正常，而非轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片出現(xiàn)大量枯黃［16］。Kornyeyev等獲得了轉(zhuǎn)葉綠體APX基因的棉花植株，APX在植物體內(nèi)過量表達，其葉片中APX活性比野生型的提高5倍［17］。Caldwell等研究大豆cAPXs中觀察到，APX的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后調(diào)控可增強大豆抵抗環(huán)境脅迫的能力［18］。Sarowar等將辣椒APX基因轉(zhuǎn)入煙草，同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化脅迫與抗真菌能力［19］。Li等向煙草中轉(zhuǎn)入過氧化物酶體APX基因，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱耐鹽能力［20］。Yabuta等研究表明，在轉(zhuǎn)基因煙草中，葉綠體APX在清除活性氧體系中發(fā)揮著很重要的作用，它保證了葉片的葉組織在水循環(huán)和光合作用中維持能量［21］。方濤等以OsApx7和OsApx8突變本為材料，證實了水稻葉綠體APX，特別是APX8，在水稻對抗干旱的逆境中發(fā)揮著重要的作用［22］。邵振啟等以水稻抗壞血酸過氧化物酶基因OsApx2為轉(zhuǎn)化對象，獲得轉(zhuǎn)OsApx2大豆，抗壞血酸過氧化物酶活性等干旱指標及產(chǎn)量相關性狀測定表明OsApx2超表達能夠顯著提高大豆的耐旱性［23］。

本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)，分析了Gm-Apx基因在菌株XFS-4包衣黑河43后抗大豆胞囊線蟲過程中的表達差異，從基因轉(zhuǎn)錄表達水平上對Gm-Apx進行研究，以發(fā)現(xiàn)該基因與SCN抗性之間的關系。綜合分析Real-time PCR的結(jié)果，在接種線蟲后，菌株XFS-4包衣的黑河43在4、7 d 時，Gm-Apx基因的表達呈上升趨勢，分別為對照的1.46、1.08倍，這表明在接種后的前期，由于線蟲的入侵，造成寄主細胞破壞，誘導了胞內(nèi) H2O2 的增加，繼而導致了Gm-Apx基因表達上調(diào)；接種后11、14 d，Gm-Apx表達下降，分別為對照的0.87、0.92倍。這可能一方面是 H2O2 濃度下降，另一方面由于活性氧對植物自身具有一定的損害作用，植物自身啟動了限制活性氧生成的機制。試驗結(jié)果表明，大豆在受到線蟲侵染時，菌株XFS-4能夠誘導Gm-Apx的表達，對植物抗性反應及解除脅迫誘導的氧化損害起了很重要的作用。

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收稿日期：2023-03-30

基金項目：國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項（編號：CARS-04）；農(nóng)業(yè)基礎性長期性工作植保中心愛輝試驗點項目（編號：NAES-PP-033）；黑龍江省第二批“揭榜掛帥”科技攻關項目（編號：2021ZXJ05B011）。

作者簡介：項 鵬（1986—），男，黑龍江肇州人，碩士，助理研究員，主要從事植物線蟲學研究。E-mail：xp_303@126.com。

通信作者：張 武，碩士，副研究員，主要從事大豆病蟲害研究。E-mail：guoguo_zw@163.com。