湖南省兩棲動(dòng)物新紀(jì)錄

摘 要 2023 年5 月26 日，在湖南省新寧縣崀山鎮(zhèn)（26°19'40″ N，110°42'54″ E；海拔441 m）進(jìn)行兩棲動(dòng)物調(diào)查時(shí)，采集到4號(hào)琴蛙屬（Nidirana）物種標(biāo)本，經(jīng)形態(tài)特征比較，與桂北琴蛙（Nidirana guibeiensis）相似；基于線(xiàn)粒體COI基因構(gòu)建的琴蛙屬部分物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，此次采集的琴蛙標(biāo)本與桂北琴蛙聚為一支，且具有較高的支持率（1. 00/99）；基于Kimura雙參數(shù)模型估算本次采集的琴蛙標(biāo)本與模式產(chǎn)地（廣西興安）標(biāo)本間的遺傳距離為0，遠(yuǎn)小于琴蛙屬物種間的遺傳距離（2. 7%～14. 4%）。綜合形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育比較，確定此次采集的琴蛙標(biāo)本為無(wú)尾目（Anura）蛙科（Ranidae）琴蛙屬的桂北琴蛙，系湖南省兩棲動(dòng)物分布新紀(jì)錄種。

關(guān)鍵詞：琴蛙屬；桂北琴蛙；新紀(jì)錄；湖南省

中圖分類(lèi)號(hào)：Q958. 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 02 - 0448 - 08

DOI：10.12375/ysdwxb.20240227

琴蛙屬（Nidirana）廣泛分布于東亞和東南亞的亞熱帶地區(qū)，目前該屬物種已報(bào)道20種［1］，中國(guó)記錄分布有19種，其中，湖南省記錄分布有4種，分別為彈琴蛙（N. adenopleura）、粵琴蛙（N. guangdongen?sis）、雷山琴蛙（N. leishanensis）和湘琴蛙（N. xian?gica）［2?6］。彈琴蛙曾被記錄在湖南廣泛分布［5］，近年來(lái)基于整合分類(lèi)學(xué)研究，琴蛙屬內(nèi)有多個(gè)隱存種被發(fā)現(xiàn)，且這些隱存種之前大多被誤定為彈琴蛙，因此，彈琴蛙在湖南是否有分布還有待進(jìn)一步研究［6］；粵琴蛙分布在湖南東南部八面山等地［2］；雷山琴蛙分布在湖南西部懷化、通道等地［3］；湘琴蛙分布在湖南湘江流域、湖南瀏陽(yáng)大圍山和雙牌陽(yáng)明山等地［2］。

2023年5月26日，在新寧縣崀山鎮(zhèn)進(jìn)行兩棲動(dòng)物調(diào)查時(shí)，于坪地村（26°19'40″ N，110°42'54″ E；海拔441 m）采集到4號(hào)（4 ）琴蛙屬成體標(biāo)本。經(jīng)形態(tài)學(xué)比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為桂北琴蛙（N. guibei?ensis），為湖南省兩棲動(dòng)物新紀(jì)錄種。本文對(duì)桂北琴蛙的形態(tài)特征及生態(tài)習(xí)性進(jìn)行描述，并初步探討其形態(tài)特征的地理變異，為琴蛙屬物種的系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究提供新信息。

1 材料與方法

1. 1 材料

對(duì)采集的標(biāo)本取少量肌肉組織存于95%的乙醇中用于提取DNA。標(biāo)本浸泡于10%福爾馬林溶液中，保存于茅臺(tái)學(xué)院生物學(xué)標(biāo)本室。本研究采集的4號(hào)標(biāo)本及用于系統(tǒng)發(fā)育分析的部分琴蛙屬物種信息見(jiàn)表1。

1. 2 形態(tài)鑒定與測(cè)量

使用游標(biāo)卡尺（無(wú)錫錫工量具有限公司，量程200 mm，精度0. 01 mm）測(cè)量4號(hào)標(biāo)本的頭體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)和頭寬等17項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)，并參照《中國(guó)兩棲動(dòng)物檢索及圖解》［7］、《中國(guó)兩棲動(dòng)物及其分布彩色圖鑒》［8］和桂北琴蛙形態(tài)描述［9］進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1. 3 分子鑒定

以高鹽法提取保存于乙醇中的肌肉組織DNA。參照Che等［10］引物序列擴(kuò)增COI基因部分片段并測(cè)序，選用引物Chmf4：5'-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATCGG-3'和Chmr4：5'-ACYTCRGGRT-GRCCRAARAATCA-3'。PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為2. 50 μL 10×Buffer，2. 00 μL dNTP，0. 25 μL Taq 酶，上、下游引物各1. 00 μL，DNA 模板1. 00 μL，最后加入17. 25 μL滅菌超純水補(bǔ)足至終體積25. 00 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，48 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小和純度，大小符合要求的產(chǎn)物交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。所得序列上傳到GenBank，登錄號(hào)為OR979474～OR979477。

在GenBank中下載琴蛙屬部分物種和近緣類(lèi)群拇棘蛙屬（Babina）物種的COI基因，結(jié)合本次采集標(biāo)本所測(cè)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。以琉球拇棘蛙（Babina holsti）和奄美拇棘蛙（Babina subaspera）為外群［9］。所有序列在軟件Clustal X v1. 8中比對(duì)［11］，采用貝葉斯法（Bayesian inference of phylogeny，BI）和最大似然法（maximum likelihood，ML）重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。建樹(shù)前，利用軟件jModelTest v2 基于AIC 標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳核苷酸替代模型［12］。最大似然樹(shù)（ML）在軟件PhyML v 3. 0 中完成［13］，并進(jìn)行1 000 次boot?strap 重抽樣分析，檢驗(yàn)各節(jié)點(diǎn)置信度。采用MrBayes 3. 2. 4軟件進(jìn)行貝葉斯分析［14］，以隨機(jī)樹(shù)為起始樹(shù)，在默認(rèn)熱值條件下同時(shí)運(yùn)行4條馬爾可夫鏈，運(yùn)行1×107代。每隔1 000代抽樣一次，舍棄25%的老化樹(shù)。使用Figtree軟件查看結(jié)果并獲得系統(tǒng)樹(shù)的支系結(jié)構(gòu)和各支系的后檢驗(yàn)概率。最后用MEGAv6. 0中的Kimura雙參數(shù)模型［15］計(jì)算表1中所列琴蛙屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2. 1 形態(tài)描述

本次采集的4號(hào)標(biāo)本均為雄性個(gè)體（XN20230526021～XN20230526024），頭體長(zhǎng)50. 38～56. 15 mm，其他部位量度見(jiàn)表2。標(biāo)本吻端鈍圓，頭長(zhǎng)和頭寬幾乎相等，瞳孔橫置，鼓膜明顯，大而圓，邊緣略突出，舌后端有明顯缺刻，犁骨齒發(fā)達(dá)；前臂較粗，手指纖細(xì)，指端略微膨大，指長(zhǎng)序Ⅲgt;Ⅰgt;Ⅳgt;Ⅱ，掌突2個(gè)，呈橢圓形，指關(guān)節(jié)下瘤明顯；左右跟部重疊明顯，脛跗關(guān)節(jié)貼體前伸達(dá)眼鼻之間，趾長(zhǎng)序Ⅳgt;Ⅲgt;Vgt;Ⅱgt;Ⅰ，趾端有腹側(cè)溝，趾間具2/3蹼，蹼式為I2-2Ⅱ1?-3-Ⅲ2-3+Ⅳ3+-2-V，趾關(guān)節(jié)下瘤明顯，第Ⅳ趾上有3個(gè)，第Ⅲ、V趾上有2個(gè)，第Ⅰ、Ⅱ趾上有1個(gè)；內(nèi)蹠突呈長(zhǎng)條狀，外蹠突橢圓；背部淺棕色，體側(cè)淡黃色；背部及體側(cè)有黑色斑；背中線(xiàn)明顯，呈棕色，四肢棕黃色；鼓膜棕褐色；頜腺和肩腺均為乳白色；腹部光滑，四肢及咽部肉色，腹部白色；具1對(duì)內(nèi)聲囊，第Ⅰ指具婚墊（圖1）。

2. 2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳距離

PCR擴(kuò)增獲得的琴蛙線(xiàn)粒體COI基因片段長(zhǎng)度為672 bp。在jModelTest v2軟件中基于AIC標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算了最佳核苷酸替代模型，本文用于系統(tǒng)發(fā)育分析的最佳核苷酸替代模型為GTR+G+I。

基于貝葉斯法和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）顯示，采自湖南新寧的琴蛙標(biāo)本與桂北琴蛙模式產(chǎn)地（廣西興安）的標(biāo)本聚為一支，且有較高的支持率（1. 00/99）?；贙imura雙參數(shù)模型估算本研究所采琴蛙屬部分物種的遺傳距離為2. 7%～14. 4%（表3），平均遺傳距離為7. 5%。本研究所采集的琴蛙標(biāo)本與桂北琴蛙模式產(chǎn)地（廣西興安）標(biāo)本間的遺傳距離為0，說(shuō)明兩個(gè)種群間共享同一單倍型，未出現(xiàn)遺傳分化。通過(guò)形態(tài)比較，在新寧采集的琴蛙標(biāo)本與桂北琴蛙原始文獻(xiàn)［8］的描述吻合，系統(tǒng)發(fā)育分析也支持采自湖南新寧的琴蛙標(biāo)本與桂北琴蛙模式產(chǎn)地標(biāo)本聚為一支。

因此，綜合形態(tài)比較與分子系統(tǒng)學(xué)分析，鑒定采集于湖南新寧崀山鎮(zhèn)的琴蛙標(biāo)本為桂北琴蛙，為湖南省兩棲動(dòng)物分布新紀(jì)錄。

2. 3 生境描述

本次桂北琴蛙標(biāo)本的采集地位于湖南省新寧縣崀山鎮(zhèn)坪地村海拔441 m的農(nóng)田附近，發(fā)現(xiàn)時(shí)雄蛙正在鳴叫（圖3）。與其同域分布的兩棲類(lèi)還有中華湍蛙（Amolops sinensis）、闊褶水蛙（Hylaranalatouchii）、澤陸蛙（Fejervarya multistriata）、三港雨蛙（Hyla sanchiangensis）、斑腿泛樹(shù)蛙（Polypedatesmegacephalus）和飾紋姬蛙（Microhyla fissipes）等。

3 討論

琴蛙屬物種在中國(guó)南方廣泛分布，大多數(shù)物種間形態(tài)較為相似，因此據(jù)形態(tài)特征很難對(duì)其進(jìn)行鑒定［8］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，采用形態(tài)比較結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)分析對(duì)物種進(jìn)行鑒定的方法已被廣泛應(yīng)用。

本研究通過(guò)下載已有報(bào)道的琴蛙屬部分物種的COI序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，計(jì)算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)本研究所采標(biāo)本和湖南省記錄分布的彈琴蛙、湘琴蛙、粵琴蛙和雷山琴蛙的遺傳距離分別為9. 1%、2. 7%、5. 7%和2. 7%，和模式產(chǎn)地（廣西興安）的桂北琴蛙遺傳距離為0，遠(yuǎn)小于其他琴蛙屬的遺傳距離。

采自湖南新寧的琴蛙標(biāo)本與湖南已記載的4種琴蛙屬物種在形態(tài)上存在一定差異［2?3，5，9］。桂北琴蛙頭長(zhǎng)與頭寬幾乎相等，區(qū)別于湘琴蛙、粵琴蛙和雷山琴蛙的頭長(zhǎng)大于頭寬；無(wú)雄性線(xiàn)，區(qū)別于彈琴蛙的有雄性線(xiàn)；掌突2個(gè)，區(qū)別于彈琴蛙、湘琴蛙、粵琴蛙和雷山琴蛙的3 個(gè)掌突；有弱的顳褶，區(qū)別于彈琴蛙、湘琴蛙、粵琴蛙和雷山琴蛙的無(wú)顳褶。本次采集的桂北琴蛙和模式產(chǎn)地（廣西興安）標(biāo)本在形態(tài)上也存在一些差異，新寧桂北琴蛙后肢貼體前伸達(dá)眼中部，不同于模式產(chǎn)地桂北琴蛙的達(dá)鼻眼之間。但由于本次所采桂北琴蛙樣本數(shù)量有限，上述差異是否為適應(yīng)不同環(huán)境而導(dǎo)致的形態(tài)變異，還有待進(jìn)一步論證。

桂北琴蛙為2022 年新發(fā)表的兩棲動(dòng)物新物種，此前在我國(guó)僅分布于廣西興安縣和貓兒山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，棲息在海拔300～1 300 m的稻田、靜水塘旁［9］。此次在湖南省新寧縣崀山鎮(zhèn)坪上村（海拔441 m）發(fā)現(xiàn)桂北琴蛙，不僅豐富了其分布信息，也將桂北琴蛙的分布區(qū)域向北擴(kuò)展至湖南中南部。結(jié)合已有的報(bào)道，本研究推測(cè)桂北琴蛙可能沿資江流域分布，因此，建議在該區(qū)域進(jìn)行全面詳細(xì)地調(diào)查，以了解桂北琴蛙確切的分布范圍及種群狀況。

參考文獻(xiàn)：

［1］ FROST D R. Amphibian species of the world： an online refer?ence： version 6. 0 ［DB/OL］. ［2023-09-20］. https：//amphibian?softheworld. amnh. org/.

［2］ LYU Z T， DAI K Y， LI Y， et al. Comprehensive approaches re?veal three cryptic species of genus Nidirana （Anura， Ranidae）from China［J］. ZooKeys， 2020， 914： 127-159.

［3］ 劉京， 程彥林， 周鋁， 等. 湖南通道發(fā)現(xiàn)雷山琴蛙［J］. 動(dòng)物學(xué)雜志， 2022， 57（1）： 105-111.

LIU J， CHENG Y L， ZHOU L， et al. Nidirana leishanensis foundin Tongdao， Hunan［J］. Chinese Journal of Zoology， 2022， 57（1）： 105-111.

［4］ 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所.“ 中國(guó)兩棲類(lèi)”信息系統(tǒng)［DB/OL］.［ 2023-09-20］. http：//www. amphibiachina. org/.Kunming Institute of Zoology. The database of Chinese amphibian［DB/OL］.［ 2023-09-20］. http：//www. amphibiachina. org/.

［5］ 沈猷慧， 楊道德， 莫小陽(yáng)， 等. 湖南動(dòng)物志： 兩棲綱［M］. 長(zhǎng)沙： 湖南科學(xué)技術(shù)出版社， 2014： 236-240.

SHEN Y H， YANG D D， MO X Y， et al. Fauna Hunan： Am?phibia［M］. Changsha： Hunan Science and Technology Press，2014： 236-240.

［6］ 高志偉， 錢(qián)天宇， 江建平， 等. 湖南省兩棲、爬行動(dòng)物物種多樣性及其地理分布［J］. 生物多樣性， 2022， 30（2）： 97-111.

GAO Z W， QIAN T Y， JIANG J P， et al. Species diversity anddistribution of amphibians and reptiles in Hunan Province， China［J］. Biodiversity Science， 2022， 30（2）： 97-111.

［7］ 費(fèi)梁， 葉昌媛， 黃永昭， 等. 中國(guó)兩棲動(dòng)物檢索及圖解［M］. 成都： 四川科學(xué)技術(shù)出版社， 2005： 6-13； 119-121.

FEI L， YE C Y， HUANG Y Z， et al. An illustrated key to Chi?nese amphibians［M］. Chengdu： Sichuan Publishing House of Sci?ence and Technology， 2005： 6-13； 119-121.

［8］ 費(fèi)梁， 葉昌媛， 江建平. 中國(guó)兩棲動(dòng)物及其分布彩色圖鑒［M］. 成都： 四川科學(xué)技術(shù)出版社， 2012：344-345.

and their distributions［M］. Chengdu： Sichuan Publishing Houseof Science amp; Technology， 2012：344-345.

［9］ CHEN W C， YE J P， PENG W X， et al. A new species of Nidi?rana（ Anura， Ranidae） from northern Guangxi， China［J］. ZooK?eys， 2022， 1135： 119-137.

［10］ CHE J， CHEN H M， YANG J X， et al. Universal COI primersfor DNA barcoding amphibians［J］. Molecular Ecology Re?sources， 2012， 12（2）： 247-258.

［11］ THOMPSON J D， GIBSON T J， PLEWNIAK F， et al. TheCLUSTAL_X windows interface： flexible strategies for multiplesequence alignment aided by quality analysis tools［J］. NucleicAcids Research， 1997， 25（24）： 4876-4882.

［12］ POSADA D. jModelTest： phylogenetic model averaging［J］. Mo?lecular Biology and Evolution， 2008， 25（7）： 1253-1256.

［13］ GUINDON S， DUFAYARD J F， LEFORT V， et al. New algo?rithms and methods to estimate maximum-likelihood phylog?enies： assessing the performance of PhyML 3. 0［J］. SystematicBiology， 2010， 59（3）： 307-321.

［14］ RONQUIST F， HUELSENBECK J P. MrBayes 3： Bayesian phy?logenetic inference under mixed models［J］. Bioinformatics，2003， 19（12）： 1572-1574.

［15］ TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6： mo?lecular evolutionary genetics analysis version 6. 0［J］. MolecularBiology and Evolution， 2013， 30（12）： 2725-2729.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31960099，32260136）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK［2022］一般540）；貴州省林業(yè)科研課題項(xiàng)目（黔林科合［2020］13號(hào)）；茅臺(tái)學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（mygccrc［2022］055，mygccrc［2022］067）