CNV-seq應(yīng)用于產(chǎn)前診斷及流產(chǎn)物檢測意外發(fā)現(xiàn)DMD基因變異臨床分析

［收稿日期］2023-06-26

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金（82201865）；陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2023-YBSF-305）；西北婦女兒童醫(yī)院院內(nèi)科研項(xiàng)目（2020ZD03）

［作者簡介］吳秋華（1984—），女，主管技師，主要從事遺傳檢驗(yàn)相關(guān)研究。

［通訊作者］強(qiáng)" 榮，主任醫(yī)師。

［摘" 要］目的" 探討全基因組拷貝數(shù)變異測序技術(shù)（CNV-seq）應(yīng)用在產(chǎn)前診斷及流產(chǎn)物檢測中發(fā)現(xiàn)Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥（DMD）的重要價(jià)值。方法" 本研究使用CNV-seq技術(shù)對(duì)2019年9月至2020年7月來西北婦女兒童醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的羊水樣本和流產(chǎn)胎兒樣本共784例進(jìn)行檢測，對(duì)DMD基因變異樣本進(jìn)一步采用多重連接依賴性探針擴(kuò)增（MLPA）方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果" 本研究意外發(fā)現(xiàn)3例樣本存在DMD基因的缺失或重復(fù)，同時(shí)MLPA驗(yàn)證了這些突變。3例均為女胎，胎兒1為DMD基因64-79號(hào)外顯子重復(fù)，胎兒2為DMD基因1-7號(hào)外顯子重復(fù)，這兩例羊水樣本的變異為新發(fā)突變；流產(chǎn)胎兒3的變異遺傳自母親，母親檢測為DMD基因45-51號(hào)外顯子缺失。結(jié)論" CNV-seq技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷及流產(chǎn)物不僅能檢測染色體片段缺失或重復(fù)，還有助于發(fā)現(xiàn)基因重復(fù)或缺失所致的單基因疾病，提高了染色體及基因異常疾病的檢出率，從而為臨床診斷和遺傳咨詢提供更全面的理論依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］全基因組拷貝數(shù)變異測序技術(shù)；Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥；產(chǎn)前診斷；流產(chǎn)物

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.06.012

［中圖分類號(hào)］R173""" ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1673-5293（2024）06-0075-08

Clinical analysis of accidental discovery of DMD gene variations

in prenatal diagnosis and detection of abortus by CNV-seq

WU Qiuhua，SHI Fengrui，WANG Rui，LIU Yuan，WANG Lin，LOU Chao，QIANG Rong

（Center of Medical Genetics，Northwest Women and Childrens Hospital，Shaanxi Xi′an 710061，China）

［Abstract］ Objective To explore important value of copy number variation sequencing （CNV-seq） technology in identifying Duchenne muscular dystrophy （DMD） in prenatal diagnosis and abortus detection. Methods The amniotic fluid and abortus samples of 784 pregnant women who received prenatal diagnosis in our hospital from September 2019 to July 2020 were examined using CNV-seq technology，and those samples with DMD gene variations were validated further by multiplex ligation-dependent probe amplification （MLPA）. Results DMD gene deletions or duplication in three samples were accidentally discovered，and they were all validated by MLPA.All three samples were female fetuses.The Fetus 1 had duplication of exons 64-79 of the DMD gene and the fetus 2 had duplication of exons 1-7 of the DMD gene.The variations of the DMD gene in the two amniotic fluid samples were De novo （novel） mutations.The variation of the DMD gene in aborted fetus 3 was deletion of exons 45-51 of the DMD gene which inherited from the mother. Conclusion Application of CNV-seq technology in prenatal diagnosis and abortus examination can not only detect deletion or duplication of chromosome segments，but also contribute to identification of monogenic diseases caused by gene duplication or deletions，which improves detection rate of chromosome or gene abnormalities，and thus provides more comprehensive theoretical basis for clinical diagnosis and genetic consultation.

［Key words］ copy number variation sequencing;Duchenne muscular dystrophy;prenatal diagnosis;abortus

Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是由位于染色體Xp21.1的抗肌萎縮蛋白的基因（DMD基因）突變和肌營養(yǎng)不良蛋白缺失引起的X連鎖隱性遺傳疾病。大多數(shù)DMD患者為男性，女性一般為致病基因攜帶者，在活產(chǎn)男孩中的發(fā)病率約1/3 500［1］。DMD基因是人類基因組中最大的基因，其外顯子加內(nèi)含子總長超過2.2Mb，編碼的肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏導(dǎo)致肌纖維膜脆性和壞死，最終引起肌肉退行性變［2］。DMD在兒童早期表現(xiàn)為行走困難，在青少年時(shí)期發(fā)展為不能行走，并在成年早期導(dǎo)致死亡［3］。約1/3的DMD病例沒有家族史，為基因新發(fā)突變，通常在出生前無法被發(fā)現(xiàn)［4］。全基因組拷貝數(shù)變異測序技術(shù)（copy number variation sequencing，CNV-seq）作為近幾年新興發(fā)展的技術(shù)，與傳統(tǒng)核型技術(shù)相比能檢測到更多的染色體異常，然而關(guān)于該技術(shù)發(fā)現(xiàn)單基因疾病的報(bào)道甚少。我們通過CNV-seq檢測羊水和流產(chǎn)物樣本，意外發(fā)現(xiàn)了3例DMD基因外顯子重復(fù)或缺失病例，然后經(jīng)多重連接依賴性探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）方法驗(yàn)證使DMD得到了確診。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

本研究使用CNV-seq技術(shù)對(duì)2019年9月至2020年7月來西北婦女兒童醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的784例羊水樣本和流產(chǎn)胎兒樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)3例樣本存在DMD基因的缺失或重復(fù)，同時(shí)經(jīng)MLPA驗(yàn)證了這些突變。其中2例孕婦分別因血清學(xué)唐氏篩查異常和無創(chuàng)提示高風(fēng)險(xiǎn)選擇羊水穿刺產(chǎn)前診斷；1例孕婦因無創(chuàng)提示21三體高風(fēng)險(xiǎn)及B超提示胎兒嚴(yán)重異常選擇引產(chǎn)，進(jìn)行流產(chǎn)胎兒CNV檢測。3例孕婦均無DMD家族史。孕婦基本情況見表1。所有孕婦均簽署書面知情同意書。

1.無創(chuàng)提示胎兒21三體高風(fēng)險(xiǎn)；

2.胎兒全身皮膚水腫、胸腹腔積液、雙側(cè)足內(nèi)翻

流產(chǎn)胎兒皮膚組織

1.2 DNA提取

檢測樣本包括羊水、流產(chǎn)胎兒皮膚組織及孕婦的外周血。提取羊水基因組DNA和流產(chǎn)胎兒皮膚組織中DNA試劑盒分別為德國Qiagen公司的PureGene組織提取試劑盒、DNeasy組織試劑盒。外周血DNA由北京天根生產(chǎn)的血液基因組DNA試劑盒提取。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用江蘇蘇州閱微公司生產(chǎn)的熒光標(biāo)記短片段串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）復(fù)合擴(kuò)增檢測試劑盒對(duì)孕婦外周血及其羊水或流產(chǎn)物樣本中的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，以分析待檢樣本中是否存在母體細(xì)胞污染。

1.3 CNV-seq檢測及分析

使用北京貝瑞和康公司提供的CNV檢測試劑盒KR0040進(jìn)行文庫構(gòu)建，方法參考已有文獻(xiàn)［5］：通過限制性內(nèi)切酶水解50ng DNA，獲得平均大小為200bp的DNA片段，并通過小DNA片段末端填充、連接接頭和PCR擴(kuò)增建立DNA文庫。在美國Illumina公司生產(chǎn)的NextSeq CN500高通量測序平臺(tái)上測定所有序列。將測序結(jié)果與人類基因組數(shù)據(jù)庫hg19進(jìn)行比較。參考DGV、DECIPHER、ISCA、OMIM、ClinVar、PubMed等公共和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫針對(duì)≥100kb的CNVs片段進(jìn)行致病性分析。

1.4 MLPA檢測及分析

DMD基因檢測試劑盒由荷蘭MRC-Holland公司生產(chǎn)，含有SALSA MLPA P034/P035兩個(gè)探針，可檢測DMD基因的79個(gè)外顯子是否存在缺失或者重復(fù)。檢測方法參考已有文獻(xiàn)［6］。使用美國Thermo Fisher Scientific公司的ABI 3500DX測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，使用Coffalyser軟件（http//www.mlpa.com）用于數(shù)據(jù)分析。探針相對(duì)峰面積增加或減少30％分別提示DMD基因外顯子的重復(fù)或缺失。

2結(jié)果

2.1母源污染檢測結(jié)果

所有羊水和流產(chǎn)胎兒皮膚組織樣本均無肉眼可見性母血污染。經(jīng)STR檢測，3例樣本中均無母源污染，可用于后續(xù)檢測。

2.2 CNV-seq及MLPA檢測結(jié)果

胎兒1：女胎，CNV-seq提示Xp21.2（30860000-31260000）×3（重復(fù)約0.40Mb），MLPA提示DMD基因64-79號(hào)外顯子重復(fù)；孕婦1 MLPA未檢測出DMD基因變異，見圖1。

胎兒2：女胎，Xp21.1（32820000-33560000）×3（重復(fù)約0.74Mb），MLPA提示DMD基因1-7號(hào)外顯子重復(fù)；孕婦2 MLPA未檢測出DMD基因變異，見圖2。

流產(chǎn)胎兒3：女胎，21q11.2q22.3（14300000-48129895）×3（為21-三體綜合征），Xp21.1（31760000-32000000）×1（缺失約0.24Mb），流產(chǎn)胎兒未做MLPA檢測；孕婦3 MLPA提示DMD基因45-51號(hào)外顯子缺失，見圖3。

注：（A1）胎兒CNV-seq：seq［hg19］Xp21.2（30860000-31260000）×3；（A2）和（A3）胎兒MLPA：DMD基因64-79號(hào)外顯子重復(fù)；（A4）和（A5）孕婦1 MLPA未見DMD基因缺失或重復(fù)。

2.3妊娠結(jié)局

孕婦1經(jīng)遺傳門診咨詢和慎重考慮后選擇終止妊娠。孕婦2繼續(xù)妊娠，我們隨訪至女嬰出生后1年，體檢提示體格及智力發(fā)育正常。檢測結(jié)果及妊娠結(jié)局見表2。

3討論

3.1 DMD的研究現(xiàn)狀

DMD是一種致命的遺傳性肌病，至今尚無特異性治愈方法。盡管國內(nèi)外報(bào)道了各種治療手段，如基因治療、細(xì)胞治療和藥物治療等，但也只能暫時(shí)減緩疾病進(jìn)程［7-8］。因此在出生前及時(shí)發(fā)現(xiàn)并終止妊娠是阻止DMD患兒出生、降低出生缺陷率的關(guān)鍵。DMD女性攜帶者一般表型正常，沒有DMD家族史的女性一般不會(huì)主動(dòng)進(jìn)行DMD基因的篩查，這使得DMD患者尤其是新發(fā)病例通常在出生前無法被發(fā)現(xiàn)。目前產(chǎn)前診斷仍是防止DMD患者出生的主要手段。

3.2 CNV-seq在染色體及基因疾病診斷中的應(yīng)用價(jià)值

在臨床中，可通過產(chǎn)前篩查并對(duì)篩查高危人群進(jìn)行產(chǎn)前診斷來避免染色體病患兒的出生［9］。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，CNV-seq已廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷中。向萍霞等［10］提出可將CNV-seq作為高危孕婦的一線產(chǎn)前診斷方法，并作為羊水細(xì)胞染色體核型分析的補(bǔ)充診斷工具。CNV-seq可明顯提高羊水染色體嵌合體的診出率，并廣泛應(yīng)用于平衡易位攜帶者的產(chǎn)前診斷中［11-12］。雖然CNV-seq可識(shí)別常規(guī)核型分析無法檢測到的微缺失和微復(fù)制［13］，但關(guān)于該技術(shù)發(fā)現(xiàn)單基因疾病的報(bào)道甚少。本研究中，3例孕婦均存在高危因素，分別為血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、無創(chuàng)高風(fēng)險(xiǎn)及無創(chuàng)高風(fēng)險(xiǎn)伴B超指標(biāo)異常，3例胎兒均無DMD相關(guān)指征，然而CNV-Seq卻意外檢測出了3例樣本的染色體Xp21.2或Xp21.1區(qū)域存在小片段的缺失或重復(fù)，此區(qū)域覆蓋了DMD基因的外顯子部分片段，MLPA技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果與之一致。其中流產(chǎn)胎兒還被檢測出21q11.2q22.3區(qū)域的重復(fù)（即21-三體綜合征）。因此，當(dāng)孕婦存在產(chǎn)前診斷指征時(shí)及時(shí)進(jìn)行羊水染色體和基因診斷，也許會(huì)有意想不到的發(fā)現(xiàn)。

3.3 DMD的遺傳咨詢

DMD通常影響男性，然而在極少數(shù)情況下，女性也會(huì)受到影響，約8%的女性DMD攜帶者患有肌無力和心肌?。?4］。Takeshita和Chen等［15-16］報(bào)道了關(guān)于女性攜帶者患DMD的病例。本研究中孕婦1的女性胎兒Xp21.2處存在DMD基因的16個(gè)外顯子重復(fù)，重復(fù)范圍比較大，經(jīng)遺傳門診咨詢和慎重考慮后，該孕婦選擇了終止妊娠。孕婦2則選擇了繼續(xù)妊娠，胎兒出生后一切正常。由于女性攜帶者的發(fā)現(xiàn)與咨詢對(duì)于DMD的預(yù)防非常重要，本研究對(duì)比了胎兒和其母親的DMD基因，孕婦1和孕婦2的胎兒為新發(fā)突變，考慮兩例孕婦均存在生殖腺嵌合的可能性。孕婦3為DMD攜帶者。高值等［17］提出如果女性存在生殖腺嵌合，再孕時(shí)胎兒仍有可能發(fā)生DMD基因變異。因此對(duì)于有DMD患者妊娠史或生育史的女性，即使本人未攜帶DMD基因變異，我們?nèi)越ㄗh其再孕時(shí)選擇合適的診斷技術(shù)如CNV-seq進(jìn)行DMD產(chǎn)前診斷。

綜上所述，CNV-seq作為近年來新興發(fā)展的技術(shù)，應(yīng)用于羊水及流產(chǎn)物檢測有助于發(fā)現(xiàn)包括非整倍體在內(nèi)的染色體異常，還可能檢測出意想不到的染色體片段缺失或重復(fù)所致的單基因病，提高了染色體異常疾病的檢出率，為全面評(píng)估胎兒提供理論依據(jù)，同時(shí)有助于臨床醫(yī)生給有再孕需求的不良孕產(chǎn)史婦女提供更好的生殖遺傳咨詢。

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［專業(yè)責(zé)任編輯：童國慶］

［中文編輯：郭樂倩；英文編輯：楊周岐］