超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定地錦草中8種成分的含量

鄭璇杏 張煜帆 佘溢彬 鄭婧婧 郭漫炫

【摘要】目的：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）用于同時(shí)測(cè)定地錦草中2種有機(jī)酸類(lèi)和6種黃酮類(lèi)成分的含量。方法：采用Hypersil GOLD C18（150 mm×3.0 mm，3μm），流動(dòng)相為0.3%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，流速為0.3 mL/ min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為2μL；質(zhì)譜采用ESI源，負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)，噴霧電壓為-3000 V，離子化溫度為500℃，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）用于定量分析。結(jié)果：所測(cè)定地錦草中的8個(gè)成分在測(cè)定濃度范圍內(nèi)峰面積和濃度均呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r≥0.9910），加樣回收率在96.1%～99.9%，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好并符合方法學(xué)考察要求。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于地錦草中8種成分的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】地錦草；UPLC-MS/MS；有機(jī)酸；黃酮；含量

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.011

Simultaneous Determination of Eight Components in Euphorbiae Humifusae Herba by UPLC-MS/MS

ZHENG Xuanxing， ZHANG Yufan， SHE Yibin， ZHENG Jingjing， GUO Manxuan

（Chaozhou Institute for Drug Control， Chaozhou 521000， China）

Abstract： To develop a UPLC-MS/MSmethod for simultaneous determination of six flavonoids and two organic acids in Euphorbiae Humifusae Herba. Methods：The analysis was performed on a Hypersil GOLD C18 column （150 mm×3.0 mm，3μm） at 40℃. The mobile phase was 0.3% formic acid solution （A）-hexanenitrile （B） in a gradient elution， which was delivered at a flow rate of 0.3 mL/ min. The injection volume was 2μL. For the MS/MS analysis， the ESI source was operated in the negative-ion mode and the ions were monitored in multiple reaction monitoring （MRM） mode. The ionization temperature was 500℃，and the spray voltage was controlled at -3000 V. Result：Calibration curves showed good linearity for all 8 compounds in the settingconcentration （r≥0.9910）. The recovery rate was 96.1%～99.9%. The precision， repeatability， stability were all conformed to the validated requirements of methodology. Conclusion： The method simple and convenient， quick， celerity， precise and reliable， can be used for determination of above 8 compounds in Euphorbiae Humifusae Herba.

Keywords： Euphorbiae Humifusae Herba； UPLC-MS/MS； organic acid； flavonoid； content

地錦草是中藥中常用的草本藥材，主要來(lái)源于大戟科植物地錦和斑地錦的干燥全草部分。其常用于中藥、維吾爾藥、蒙藥等民族藥中，具有較高的研究?jī)r(jià)值。地錦草具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃的作用，用于痢疾、泄瀉、咯血、尿血、便血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等癥狀[1-2]。地錦草主要含黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、萜類(lèi)與香豆素類(lèi)等成分，其中有機(jī)酸類(lèi)和黃酮類(lèi)為地錦草主要活性成分，為沒(méi)食子酸、鞣花酸、異槲皮苷、紫云英苷等[3-4]。沒(méi)食子酸具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤生物活性，對(duì)心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝纖維化和腫瘤等具有防治作用[5]；異槲皮苷具有抗炎抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、神經(jīng)保護(hù)等生物活性[6]；鞣花酸具有抗腫瘤、抗突變、抗菌抗病毒等活性[7]；紫云英苷具有顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的活性，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲[8-9]；槲皮素具有抗氧化、保護(hù)器官及細(xì)胞、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗焦慮和抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿病等藥理活性[10]；木犀草素和山柰酚有抗癌、抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、防治骨質(zhì)疏松、保護(hù)肝臟和心肌等多種藥理活性[11-12]。

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中“地錦草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”只規(guī)定了槲皮素的含量限度，評(píng)價(jià)成分較單一。文獻(xiàn)中多采用高效液相色譜（HPLC）方法或者超高效液相色譜（UPLC）方法測(cè)定地錦草中有機(jī)酸類(lèi)或黃酮類(lèi)含量，最多只檢測(cè)出4種成分[13-16]，而采用UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定地錦草中有機(jī)酸類(lèi)和黃酮類(lèi)等8個(gè)活性成分的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用UPLCMS/MS技術(shù)，對(duì)4批地錦草藥材中沒(méi)食子酸、蘆丁、異槲皮苷、鞣花酸、紫云英苷、木犀草素、槲皮素、山柰酚8個(gè)成分進(jìn)行同步含量測(cè)定，該方法簡(jiǎn)便快速準(zhǔn)確，以期為地錦草的質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器

LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津公司），Triple Quad 3500三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)ABSciex公司），SQP電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器〔北京〕有限公司），AL204電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），F(xiàn)W100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），GT-1990QTS智能超聲波清洗機(jī)（廣東固特超聲股份有限公司），SorvallST16R高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技〔中國(guó)〕有限公司）。

1.2材料

沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)110831-201605，純度90.8%）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201811，純度91.7%）、異槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)111809-201904，純度97.2%）、鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)111959-201903，純度88.8%）、木犀草素對(duì)照品（批號(hào)111520-202006，純度94.4%）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)100081-201610，純度99.1%）、山柰酚對(duì)照品（批號(hào)118061-201611，純度95.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；紫云英苷對(duì)照品（批號(hào)：Y10J10H79707，純度98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純，默克公司）、甲酸（色譜純，賽默飛世爾科技〔中國(guó)〕有限公司）。4批地錦草產(chǎn)地分別為：浙江（上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，批號(hào)190531）、湖北（湖北金貴中藥飲片有限公司，批號(hào)A190601）、廣東（康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào) 191103160）、廣東（康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)180402001）。這些地錦草經(jīng)鑒定為大戟科植物地錦的干燥全草。

2方法與結(jié)果

2.1液相和質(zhì)譜條件

液相條件：色譜柱為Hypersil GOLD C18柱（150 mm×3.0 mm，3μm）；流動(dòng)相：0.3%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序：0～2.0 min，95%A；2.0～9.0 min，95%A～10%A；9.0～11.0 min，10%A；11.0～11.1 min，10%A～95%A，11.1～13.0 min，95%A。流速：0.2 mL/min。柱溫：40℃。進(jìn)樣量：2μL。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI，噴霧電壓（IS）為-3000 V，離子化溫度（TEM）為500℃，氣簾氣（CUR）為35 psi，碰撞氣（CAD）為Medium，霧化氣（GS1）為55 psi，輔助加熱氣（GS2）為55 psi，檢測(cè)方式為負(fù)離子檢測(cè)（Negative），掃描模式為多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1，提取的定量離子色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照溶液制備

精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品10.24 mg、蘆丁對(duì)照品11.80 mg、異槲皮苷對(duì)照品10.05 mg、鞣花酸對(duì)照品18.78 mg、紫云英苷對(duì)照品10.56 mg、槲皮素對(duì)照品10.96 mg，分別置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇適量，超聲溶解并定容至刻度，搖勻；精密稱(chēng)取木犀草素對(duì)照品11.86 mg、山柰酚對(duì)照品11.16 mg分別置于100 mL的容量瓶中，加入甲醇適量，超聲溶解并定容至刻度，搖勻；即得對(duì)照貯備液。

精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品貯備液0.50 mL、蘆丁對(duì)照品貯備液0.20 mL、異槲皮苷對(duì)照品貯備液0.50 mL、鞣花酸對(duì)照品貯備液2.00 mL、紫云英苷對(duì)照品貯備液0.40 mL、木犀草素對(duì)照品貯備液0.40 mL、槲皮素對(duì)照品貯備液0.25 mL、山柰酚對(duì)照品貯備液1.00 mL置于25 mL溶液，用甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液（每1 mL含有沒(méi)食子酸18.60μg，蘆丁8.656μg異槲皮苷19.54μg，鞣花酸133.4μg，紫云英苷16.56μg，木犀草素1.791μg，槲皮素10.86μg，山柰酚4.263μg）。

2.2.2供試品溶液的制備

稱(chēng)取地錦草粉末（過(guò)三號(hào)篩）0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞的錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞稱(chēng)質(zhì)量，超聲處理60 min（頻率40 kHz，功率300 W），放冷稱(chēng)質(zhì)量，加80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，7500 r/min離心10 min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1線(xiàn)性關(guān)系考察

取2.2.1項(xiàng)混合對(duì)照品溶液適量，將對(duì)照品溶液分別稀釋2、5、10、20、100、200倍，得系列濃度的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣2.0μL，以峰面積為噪聲10倍（S/N=10）時(shí)的進(jìn)樣濃度為定量限（LOQ）。8種成分的線(xiàn)性關(guān)系見(jiàn)表2。

2.3.2精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液2.0μL，按2.1項(xiàng)液相和質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以對(duì)照品峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果8個(gè)成分峰面積的RSD分別為0.7%、1.9%、1.4%、0.9%、1.4%、0.8%、1.4%、1.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取批號(hào)190531地錦草樣品6份，按2.2.2項(xiàng)方法平行制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)液相和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)樣品峰面積計(jì)算8個(gè)成分的含量。結(jié)果其含量的RSD分別為0.6%、0.9%、1.3%、1.2%、1.2%、2.1%、1.6%、2.4%，表明本法重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取批號(hào)19053地錦草樣品，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試溶液，室溫放置，在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣分析，根據(jù)樣品峰面積計(jì)算8種成分的含量。結(jié)果其含量的RSD分別為1.5%、1.5%、1.7%、1.9%、1.7%、3.0%、3.0%、3.9%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)知8種物質(zhì)含量批號(hào)19053地錦草樣品粉末0.1 g共6份，分別加適量對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試溶液，按2.1項(xiàng)液相和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，分別計(jì)算8個(gè)成分的平均回收率及其RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.6樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取4批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)液相和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定其8種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3討論

3.1液相和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別考察甲醇、乙腈、超純水、甲酸、甲酸銨等不同比例的流動(dòng)相體系的分離效果。結(jié)果表明，有機(jī)相為乙腈時(shí)，響應(yīng)值偏高，故選用乙腈為有機(jī)相。為改善待測(cè)組分色譜峰的峰形，流動(dòng)相中加入一定量的酸，分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.5%甲酸溶液，發(fā)現(xiàn)0.3%甲酸水溶液時(shí)各組分峰型比較好，最終確定以0.3%甲酸-乙腈為流動(dòng)相，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化建立梯度洗脫程序。

在研究離子掃描模式時(shí)采用正負(fù)模式發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸類(lèi)及黃酮類(lèi)成分實(shí)驗(yàn)在正負(fù)離子監(jiān)測(cè)下都能測(cè)定，但是在負(fù)離子條件下檢測(cè)響應(yīng)強(qiáng)于正離子條件，因此選擇負(fù)離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)。鞣花酸和紫云英苷的定量子離子質(zhì)荷比相同，但是其母離子質(zhì)荷比不同且通道不同，不影響各自的定量分析。

3.2藥材提取方法優(yōu)化

以甲醇和乙醇為提取溶劑，考察冷浸法（24 h）、超聲提取法和加熱回流法對(duì)地錦草樣品中8種成分提取量的影響。結(jié)果表明，采用超聲提取法和加熱回流法提取效果差不多，因此采用操作方便的超聲提取法，溶劑為甲醇時(shí)的提取效果較好?？疾觳煌奶崛∪軇?0%、80%、100%的甲醇）提取時(shí)間（30 min、45 min、60 min、90 min）對(duì)提取效果的影響，確定最佳提取方法為80%甲醇超聲提取60 min。

4結(jié)束語(yǔ)

本文建立了UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定4批地錦草藥材中沒(méi)食子酸、蘆丁、異槲皮苷、鞣花酸、紫云英苷、木犀草素、槲皮素、山柰酚8種成分的含量，為地錦草的質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

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【作者簡(jiǎn)介】

鄭璇杏，女，1989年出生，學(xué)士，研究方向?yàn)榛瘖y品和藥品檢驗(yàn)。

（編輯：侯睿琪）