獸用抗生素生物效價測定中注意事項及分析

郭玉翠 劉曉靜 韓鐫竹 邱月 張銘洋 李欣南

【摘要】檢驗檢測技術(shù)在保障獸用抗生素產(chǎn)品質(zhì)量中發(fā)揮著重要作用。管碟法是抗生素效價測定常用的方法之一。本文針對抗生素效價測定過程中常見的一些技術(shù)問題進行總結(jié)梳理，結(jié)合日常實踐，對影響結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行剖析，提出合理化建議，以供獸藥檢驗檢測實驗室參考。

【關(guān)鍵詞】抗生素；效價；管碟法；準(zhǔn)確性

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.005

【基金項目】遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（SC202319）：一種新型動物營養(yǎng)速溶顆粒劑的開發(fā)與應(yīng)用。

Precautions and Analysis in the Biotiter Determination of Veterinary Antibiotics

GUO Yucui1， LIU Xiaojing2， HAN Juanzhu1， QIU Yue1， ZHANG Mingyang3， LI Xinnan1*

（1.Liaoning Inspection， Examination & Certification Centre〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China； 2.Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China； 3.Dalian Medical University， Dalian 116000， China）

Abstract： Testing technology plays an important role in ensuring the quality of veterinary antibiotic products. The tube plate method is one of the commonly used methods for determining the potency of antibiotics. This article summarized and sorted out some common technical issues in the process of determining antibiotic potency. Combining with daily practice， it analyzed the key links that affected the accuracy of results， and put forward reasonable suggestions for reference by veterinary drug testing laboratories.

Keywords： antibiotics； potency； tube plate method； accuracy

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展，很多品種的抗生素微生物檢定法都被化學(xué)分析方法所取代，但是由于部分抗生素依賴生物發(fā)酵生產(chǎn)，化學(xué)測定結(jié)果難以準(zhǔn)確表征抗生素的組分組成以及含量與生物活性間的關(guān)系，某些抗生素目前尚無適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性。因此，抗生素微生物檢定法便成了不二的選擇。在《中華人民共和國獸藥典》（2020年版）與《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版）含量測定的方法要求中，有54種藥物制劑運用了抗生素微生物檢定法。其中包括氨基糖苷類抗生素制劑23種、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素制劑19種、多肽類抗生素制劑6種、四環(huán)素類抗生素制劑4種，其他抗生素制劑2種。由此可見，未來抗生素微生物檢定法在抗生素含量檢測技術(shù)中仍占有重要地位。

抗生素微生物檢定法包括管碟法與比濁法。管碟法是抗生素效價測定的經(jīng)典方法，通常采用活菌檢測[1]。其主要依據(jù)量反應(yīng)平行線原理，將菌懸液與培養(yǎng)基混合均勻，覆蓋在底層培養(yǎng)基上，然后置放加入了抗生素與標(biāo)準(zhǔn)品的鋼杯?？股卦谂囵B(yǎng)基內(nèi)擴散，當(dāng)擴散到達一定范圍時能夠抑制試驗菌的生長，形成透明的抑菌圈。比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計算供試品抗生素活性（效價）[2]。管碟法具有成本低、準(zhǔn)確性高、能直接顯示抗生素的抗菌效果等優(yōu)點，但環(huán)境要求嚴(yán)苛，對技術(shù)人員的能力要求高，工作效率相對偏低?；诖?，本文梳理了獸用抗生素微生物檢定法中常見的問題并進行原因解析，以期為提升獸藥檢測實驗室的檢測能力與促進動物產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)展提供幫助。

1試驗準(zhǔn)備階段注意事項

1.1菌種

1）菌株的傳代與保存。通常實驗室標(biāo)準(zhǔn)菌株會在-80℃或-20℃保存，在使用前要進行復(fù)蘇和活化，如果沒有充分的復(fù)蘇與活化，會直接導(dǎo)致試驗失敗[3]。《中華人民共和國獸藥典》（2020版）附錄9203中要求冷凍菌株一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后，不得重新冷凍和再次使用。另外，工作菌株傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不能超過5代，以防止過度傳代增加菌種變異的風(fēng)險。

2）菌株的活性。菌株的活性是試驗成敗的關(guān)鍵因素[4]。因此在不能掌握菌濃和菌株活性的情況下，可以先做預(yù)實驗。當(dāng)使用枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿進行抗生素含量測定時，需保證芽孢生成率，應(yīng)采用革蘭染色法涂片鏡檢，芽孢率≥85%。

3）菌體的富集。制備菌懸液需要培養(yǎng)足夠的菌苔，要嚴(yán)格控制溫濕度，防止出現(xiàn)水汽過重產(chǎn)生斜面菌苔薄及觀察受阻的情況。

4）特殊菌種要求。金黃色葡萄球菌冷凍保藏的時間短，建議半年更換一次菌種，否則試驗菌活性會大大減弱，造成實驗結(jié)果出現(xiàn)誤差。藤黃微球菌自我保護能力差，在復(fù)活及傳代過程中易導(dǎo)致傳代失敗，須及時更新傳代。

1.2培養(yǎng)基

1）培養(yǎng)基的制備。獸藥檢測實驗室一般采用脫水培養(yǎng)基，稱量要保證精確度，且加入的水量要嚴(yán)格控制。脫水培養(yǎng)基應(yīng)完全溶解后，再進行分裝滅菌，避免因瓊脂分布不均勻?qū)е屡囵B(yǎng)基滅菌后分層，若需要加熱助溶，則要避免過度加熱。

2）培養(yǎng)基的滅菌。培養(yǎng)基的滅菌要嚴(yán)格按照生產(chǎn)商提供的說明書進行，避免因過度滅菌導(dǎo)致營養(yǎng)成分被破壞。培養(yǎng)基的理化性質(zhì)能夠影響抑菌圈的形成，如pH越高，生成的抑菌圈小。堿性條件下抗生素的滅菌作用被減弱，因此在滅菌后需要對配制好的培養(yǎng)基及緩沖液的pH值進行校對。如果培養(yǎng)基給出具體pH值，則pH值的范圍不能超過規(guī)定值的±0.2。

3）培養(yǎng)基的驗證。不同批次培養(yǎng)基所提供的營養(yǎng)物質(zhì)能導(dǎo)致菌落性狀產(chǎn)生差異。營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上細(xì)菌分裂繁殖速度較快，產(chǎn)生的抑菌圈相對較小，反之，產(chǎn)生的抑菌圈較大。為保證測量的準(zhǔn)確性，培養(yǎng)基在啟用前要進行培養(yǎng)基驗證，除包裝、性狀、pH值等外還應(yīng)進行適用性檢查試驗，一般同一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢查試驗可以只進行一次。

4）培養(yǎng)基的貯藏。培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)盡量立即使用，不得在高壓滅菌器長時間放置。培養(yǎng)基滅菌后再融化只允許一次。短時間放置可于45～50℃的水浴中保溫，不得超過8 h。如果需要長時間保存應(yīng)自然冷卻后在冰箱中（4～8℃）保存，一般不超過一周，不得在0℃以下保存，避免破壞瓊脂特性。

1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

獸用抗生素生物效價測定應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)要求選用效價用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保存要嚴(yán)格按照說明書進行，要定期對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行期間核查，確保標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)滿足量值溯源的要求。

1.4其他注意事項

1）培養(yǎng)皿。試驗用培養(yǎng)皿要使用直徑約為90 mm，高16～ 17 mm的定量平皿。

2）陶瓦蓋。陶瓦蓋使用前要充分烘干，避免水汽堵塞縫隙影響水蒸氣吸收。

3）鋼杯。內(nèi)徑為6 mm±0.1 mm，高為10.0 mm±0.1 mm，外徑為7.8 mm±0.1 mm。試驗前應(yīng)檢視鋼杯，邊緣應(yīng)光滑整齊，內(nèi)壁無殘留物，無銹蝕。要及時更換污損的鋼杯，避免影響實驗中抗生素的擴散。此外，鋼管的重量也會影響藥物在瓊脂中的擴散，為避免鋼管重量差異對藥物擴散產(chǎn)生影響而造成結(jié)果不準(zhǔn)確，在同一試驗中使用的鋼管，內(nèi)外壁及兩端均應(yīng)光滑平整，重量差異應(yīng)不超過±0.05 g。

2檢測過程中的注意事項

2.1雙碟的制備

1）菌懸液的制備。取新鮮試驗菌斜面培養(yǎng)物，在無菌條件下用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗掉，通過預(yù)試驗確定適宜菌濃。

2）底層的制備。為使培養(yǎng)基在平皿底部均勻攤布，加熱融化的培養(yǎng)基可直接傾注，且體積為20 mL，自然冷卻至凝固。吸取培養(yǎng)基時要輕吸慢放，避免產(chǎn)生氣泡。試驗臺應(yīng)使用水平尺進行校準(zhǔn)，避免培養(yǎng)基表面傾斜影響檢測的準(zhǔn)確性。

3）菌層的制備。取培養(yǎng)基適量加熱溶解后置于48～50℃水浴中至恒溫，加入適量菌懸液迅速混勻，取5 mL加注底層上迅速均勻攤布。制備上層時要盡量快，同時室溫不宜過低，避免瓊脂凝固導(dǎo)致表面不平從而影響檢測的準(zhǔn)確性。

4）鋼圈放置。建議使用鋼圈放置器，避免人工放置引入的誤差。鋼圈放置后應(yīng)靜止5 min。

5）上樣。使用移液器上樣時應(yīng)避免槍頭與鋼圈接觸，防止漏液發(fā)生。出現(xiàn)漏液、迸濺等情況應(yīng)及時剔除。上樣要平穩(wěn)且迅速，一組樣品的上樣時間應(yīng)控制在3 min內(nèi)[5]。

2.2培養(yǎng)

1）放置陶瓦蓋。目前，有些實驗室已經(jīng)不使用陶瓦蓋，但要控制好實驗室的濕度，避免水汽凝結(jié)滴落影響實驗。同時濕度較高也會導(dǎo)致菌層生長異常和雜菌污染。

2）恒溫培養(yǎng)。雙碟放入培養(yǎng)箱時盡量將同一批樣品放置在同一區(qū)域，同時在培養(yǎng)期間要監(jiān)控溫度波動，嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。

3）測量。手工測量用的游標(biāo)卡尺應(yīng)通過檢定，測量時為減少誤差應(yīng)由兩名檢測人員同時測量。使用抑菌圈測量儀測量，測量前要剔除結(jié)果異常的雙碟，然后進行掃描測量，至少重復(fù)測量1次。

3常見問題分析

3.1抑菌圈異常

1）無抑菌圈。發(fā)生此類情況，多半是試驗菌本身活性減弱或培養(yǎng)條件不適宜。一般優(yōu)先考慮是否因為制備雙碟時，菌層培養(yǎng)基沒有冷卻至指定溫度而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。其次可能是濕度不符合細(xì)菌生長要求，如枯草芽孢桿菌在濕度較大的條件下不易生長。此外需要注意的是，細(xì)菌活化后在斜面上不宜保存太久。保存菌種凍存時間太長或經(jīng)過反復(fù)活化凍存，都可能造成細(xì)菌活性減弱，雙碟無細(xì)菌生長。

2）抑菌圈大小不在規(guī)定范圍內(nèi)?！吨腥A人民共和國獸藥典》（2020年版）規(guī)定，二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑應(yīng)在18～22 mm。當(dāng)雙碟細(xì)菌生長良好，但試驗結(jié)果不符合要求時，一般情況下是細(xì)菌濃度不符合，應(yīng)調(diào)節(jié)菌濃，如距離要求太大，需以十倍增加或減少試驗菌的添加量。其中，土霉素對藤黃微球菌的抑菌性高，試驗使用的菌懸液濃度也比較高，所以土霉素的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的高、低濃度應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)選擇濃度值低的，避免試驗需要使用的菌懸液濃度太高，無法達到要求。

3）抑菌圈大小不均一。出現(xiàn)這種情況一般是由于試驗菌活性差、菌層試驗菌溶液未與培養(yǎng)基混合均勻，導(dǎo)致每碟的菌層試驗菌溶液添加量不一致，進而使每個雙碟的細(xì)菌量不同，同一藥物濃度產(chǎn)生的抑菌圈大小便不一致。

4）抑菌圈有“小耳朵”。鋼管在培養(yǎng)基中應(yīng)保持沉降深度相同，溶液擴散均勻一致。如果移動雙碟時沒有平行移動，雙碟震動時，會造成小鋼杯與培養(yǎng)基出現(xiàn)縫隙，溶液容易側(cè)漏[6-7]。此外，加樣時觸碰到鋼杯也會使鋼杯與培養(yǎng)基出現(xiàn)縫隙，導(dǎo)致藥液從小鋼杯中漏出，造成抑菌圈出現(xiàn)“小耳朵”（見圖1）。加樣時過快按動移液槍，導(dǎo)致藥液外濺，抑菌圈會出現(xiàn)圖2所示的情況。為了避免鋼杯與培養(yǎng)基接觸不緊密而造成抑菌圈出現(xiàn)“小耳朵”的結(jié)果，應(yīng)對鋼杯定期用超聲波振蕩，處理時需要清潔徹底，防止培養(yǎng)基殘留在鋼杯內(nèi)壁。