膠原蛋白神經酰胺脂質體的制備及質量評價

唐春慧 張振博 吳冬琴 環(huán)飛 張靜姝 王玉邦

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20230144

收稿日期：2023-09-25

作者簡介：唐春慧（1998—），女，碩士研究生，研究方向為膠原蛋白脂質體的制備工藝及性能研究。E-mail：2582600514@qq.com

*通信作者，王玉邦（1965—），男，教授，研究方向為生殖內分泌毒理學。E-mail：ncsa@njmu.edu.cn

摘要：以蛋黃卵磷脂、膽固醇和神經酰胺為成膜材料，采用薄膜分散法制備膠原蛋白神經酰胺脂質體（CO-CS）。以包封率為響應值，以藥脂比、膜材比、超聲時間和水合時間為影響因素對工藝進行優(yōu)化。結果表明，當藥脂比為1：16、超聲時間為8.5 min、膜材比為4.3：1時，包封率可達90.73%。在此條件下，樣品的粒徑為（206.63±2.06） nm，聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）為0.187±0.010，Zeta電位為（-34.90±0.82） mV。避光保存60 d后，CO-CS的包封率為87.2%，粒徑為（223.70±1.85） nm、PDI為0.174±0.013、Zeta電位為（-33.51±2.10） mV。結果表明，本研究制備的CO-CS包封率高，穩(wěn)定性良好，制備工藝合理可行。

關鍵詞：膠原蛋白；神經酰胺脂質體；響應面；包封率

中圖分類號：TQ658.2??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1002-4026（2024）03-0018-09

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

Preparation and quality evaluation of collagen ceramide liposomes

TANG Chunhui1，ZHANG Zhenbo1，WU Dongqin1，HUAN Fei1，2，ZHANG Jingshu1，2，WANG Yubang1，2*

（1.School of Public Health， Nanjing Medical University，Nanjing 211166，China;2.Jiangsu Pharmaceutical Pesticide

Veterinary Drug Safety Evaluation and Research Center， Nanjing 211166，China）

Abstract∶In this study， egg yolk lecithin， cholesterol，and ceramide were used as film-forming materials to prepare collagen ceramide liposomes （CO-CS） by the thin film dispersion method. To optimize the process， encapsulation efficiency was used as the response value， and it was evaluated by influencing factors such as drug-lipid ratio， film-material ratio， ultrasonic time， and hydration time. Results showed that encapsulation efficiency reached 90.73% when the drug-lipid ratio， film-material ratio， and ultrasonic time were 1：16， 4.3：1， and 8.5 min， respectively. Under these conditions， the particle size， polymer dispersity index （PDI）， and zeta potential of CO-CS were（206.63±2.06） nm， 0.187±0.010， and （34.90±0.82

） mV， respectively. After 60 days of storage at room temperature in the dark， the encapsulation efficiency was 87.2 %. Furthermore， the particle size， PDI， and zeta potential of CO-CS changed to （223.70±1.85） nm， 0.174±0.013， and （33.51±2.10） mV， respectively. In summary， CO-CS produced in this study revealed high encapsulation efficiency and good stability， and the preparation process is reasonable and feasible.

Key words∶collagen; ceramide liposome; response surface; encapsulation efficiency

膠原蛋白（collagen，CO）是哺乳動物皮膚、肌腱、骨骼和軟骨等結締組織中含量最豐富的結構蛋白，占人體總蛋白質含量的30%以上［1］。膠原蛋白生物材料具有低免疫原性、可生物降解、生物相容性、親水性以及促進細胞增殖分化等優(yōu)良特性，應用于食品、化妝品、制藥和生物醫(yī)學等領域［2］。膠原蛋白作為化妝品原料的有效性已經確立，通常以原液的形式添加到乳液、面膜、保濕霜等中，用來改善皮膚的色澤、細紋及皺紋，但皮膚對膠原蛋白的吸收程度是影響其發(fā)揮功效的關鍵因素［3］。

從皮膚結構來看，物質透皮吸收的途徑主要有三條：角質層、毛囊及汗管［4］。孫婭楠等［5］觀察了分子量為58 kDa左右的重組人源膠原蛋白的透皮吸收情況，發(fā)現(xiàn)重組人源膠原蛋白可以沿著毛囊進入真皮層，并從毛囊中擴散至膠原纖維層從而補充皮膚中的膠原纖維［12］；Sun等［6］研究發(fā)現(xiàn)，分子量為55 kDa的外源性重組人源膠原蛋白通過毛囊滲透表皮、皮脂腺到達真皮，形成網狀結構。這些研究結果顯示，膠原蛋白這種大分子物質主要通過毛囊途徑進入皮膚真皮層中，然而毛囊及汗管等皮膚附屬器官與整個皮膚表面積相比僅占1%以下，透皮效率低，因此，單純體外涂敷膠原蛋白不能被良好地吸收，其利用率很低，需考慮促透皮的策略。

神經酰胺脂質體（cerosomes，CS）是由磷脂、神經酰胺、膽固醇等組成的具有類脂雙分子層結構的脂質體，能夠高效經皮遞送包封在其中的活性成分，并具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和皮膚耐受性，另因其中添加了神經酰胺，還能夠更新皮膚的天然保護層并形成有效的屏障以防止水分流失［7］。

因此，為了提高膠原蛋白的生物利用度，將其制備成脂質體。目前常用制備脂質體的方法有薄膜分散法［8］、逆向蒸發(fā)法［9］、乙醇注入法［10］等。在我們前期的實驗中，分別考察了乙醇注入法、薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法制備膠原蛋白神經酰胺脂質體（CO-CS）。結果顯示薄膜分散法制備的CO-CS包封率較高，粒徑分散性良好，且制備工藝簡單，故采用此方法制備CO-CS，以包封率為評價指標設計單因素實驗和響應面實驗優(yōu)化其制備工藝，并測定了CO-CS平均粒徑、粒徑分布和電位等質量評價指標，考察CO-CS的最佳制備工藝，為膠原蛋白產品的進一步開發(fā)利用提供參考依據。

1? 實驗部分

1.1? 材料與儀器

重組人源膠原蛋白（分子量為55 kDa，批號LA22007004，江蘇江山聚源生物技術有限公司）；蛋黃-卵磷脂（批號EK21009，上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；膽固醇（批號C10780，上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；油溶性神經酰胺3（批號CONA23，韓國斗山集團）；無水乙醇（分析純，批號20230412，國藥集團化學試劑有限公司）；吐溫-80（化學純，批號20200609，國藥集團化學試劑有限公司）；曲拉通（TritonX-100，批號9002-93-1，北京博奧拓達科技有限公司）；BCA試劑盒（批號P0011-1，上海碧云天生物技術有限公司）；透析袋（截留分子量300 kDa，批號SBJ131456-1M，南京森貝伽生物科技有限公司）。

ME503T型精密分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；NANOZS-90型馬爾文粒徑分析儀（馬爾文帕納科公司）；TP-350E型磁力攪拌器（杭州米歐有限公司）；VORTEXX-5型渦旋振蕩儀（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；FEI Tecnai G2型透射電子顯微鏡（FEI捷克有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? CO-CS的制備

CO-CS基本處方見表1。按處方量精密稱取蛋黃卵磷脂、膽固醇、神經酰胺，加入無水乙醇，超聲10 min溶解，轉移至圓底燒瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上40 ℃減壓旋轉蒸發(fā)40 min，去除無水乙醇，形成均勻脂質薄膜。加入處方量膠原蛋白原液和1%吐溫-80至圓底燒瓶，旋轉水合（水合溫度40 ℃）1 h至薄膜完全脫離形成乳白色混懸液，超聲處理10 min（功率60 W）。所得膠原蛋白混懸液經0.45 μm水性微孔濾膜過濾，即得CO-CS混懸液，室溫避光保存［3，11］。

1.2.2? 包封率的測定

本實驗采用透析法分離游離膠原蛋白與CO-CS，采用BCA（二喹啉甲酸，Bicinchoninic acid） 方法測定CO-CS的包封率［3］。將0.5 mL新鮮制備的脂質體放入透析袋中，在200 mL、pH 7.4 PBS（磷酸緩沖鹽溶液，phosphate buffer saline）透析液中4 ℃透析24 h以除去游離的膠原蛋白。分別采用2.0 mL 的0.3% Trition X-100溶液對透析前后的0.5 mL脂質體進行破乳，釋放出包裹在脂質體中的膠原蛋白。采用BCA蛋白測定法，在562 nm 波長處測定膠原蛋白的質量濃度。包封率按公式（1）計算：

包封率=WW總×100%，（1）

其中，W總表示破乳前脂質體中膠原蛋白質量濃度；W表示破乳后脂質體中膠原蛋白質量濃度。

1.2.3? 透射電鏡觀察

取10.0 μL 脂質體，加入990 μL 超純水將其稀釋，于干燥的銅網上滴加樣品，紅外燈源下一定距離進行烘干，待銅網完全干燥后，銅網上滴加一滴 1%的磷鎢酸溶液進行負染，用濾紙吸干銅網多余的磷鎢酸。完全干燥后，透射電鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.4? 粒徑、PDI和Zeta 電位的測定

采用動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）技術對CO-CS進行粒徑、PDI（聚合物分散性指數，polymer dispersity index）和 Zeta電位的測定。取10.0 μL新鮮制備的CO-CS溶液，加入990 μL超純水稀釋至 1.0 mL 后，用馬爾文粒徑分析儀測定粒徑、PDI 和 Zeta 電位。

1.2.5? 單因素實驗

（1）篩選藥脂比。固定其他條件不變，考察膠原蛋白與蛋黃卵磷脂質量比分別1∶20、1∶16、1∶12、1∶8、1∶4時對CO-CS包封率的影響，每個水平平行實驗3次，取平均值。

（2）篩選膜材比。固定其他條件不變，考察蛋黃卵磷脂和神經酰胺的量與膽固醇質量比分別為3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1時對CO-CS包封率的影響，每個水平平行實驗3次，取平均值。

（3）篩選超聲時間。固定其他條件不變，考察超聲時間分別為5、10、15、20、25 min時對CO-CS包封率的影響，每個水平平行實驗3次，取平均值。

（4）篩選水合時間。固定其他條件不變，考察水合時間分別為15、30、45、60、75 min時對CO-CS包封率的影響，每個水平平行實驗3次，取平均值。

1.2.6? 響應面分析實驗

在單因素實驗的基礎上，選取出藥脂比、超聲時間、膜材比3個顯著因素，以包封率為響應值，采用三因素三水平的響應面分析實驗，通過 Design-Expert 8.0.6 軟件對實驗結果進行響應面分析，具體實驗設計見表2。根據響應面分析結果預測CO-CS的最佳制備工藝，按照最佳制備工藝制得CO-CS 5組，將其包封率與預測值進行比較。

1.2.7? 穩(wěn)定性試驗

將CO-CS置于室溫下避光保存，分別于當天及7、14、21、28 、60 d取樣，測其包封率、粒徑、PDI及電位。

2? 結果與討論

2.1? 單因素結果分析

不同因素對 CO-CS包封率的影響見圖1。

由圖1（a）可知，當膠原蛋白與蛋黃卵磷脂的質量比為1：16時包封率最大為89.04%。隨著膠原蛋白用量的增加，包封率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這是因為一定量的脂質體膜所能包封的膠原蛋白是有限的，在超過脂質體膜的飽和度后，膠原蛋白的質量再增加，脂質體膜不能繼續(xù)包封，故其包封率下降［11］。綜上所述，膠原蛋白與蛋黃卵磷脂質量比在1：16較為合適。

由圖1 （b）可知，隨著膜材比的增加，包封率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在膜材比為5：1時其包封率最大為86.16%。由于單獨磷脂形成的脂質膜不穩(wěn)定，膽固醇具有調節(jié)膜流動性及穩(wěn)定磷脂雙分子層的作用，因此在制備時加入膽固醇［12］。當膽固醇加入量較少時，膽固醇的加入使脂質體膜變得越來越牢固；當膽固醇的量超過最佳添加量時，制成的脂質膜親水性太強，容易被破壞。因此隨著膜材比的逐漸增大，脂質體的包封率漸漸增大，在其質量比超過5：1 后，包封率隨之減小。綜上所述，膜材比應在5：1較為合適。

由圖1 （c）可知，隨著超聲時間的延長，CO-CS包封率呈先上升再下降的趨勢，當超聲時間10 min時，脂質體包封率最大為87.40%；隨著超聲時間的延長，脂質體包封率反而減小。出現(xiàn)該結果可能是因為適當的超聲可以使團聚的脂質體粒子逐漸分開，從而更好地包裹膠原蛋白，但是過長時間的超聲，導致脂質體粒子被過度振蕩碎裂而一定程度發(fā)生泄漏，包封率下降［13］。因此，最佳的超聲時間在10 min。

由圖1 （d）可知，為了避免脂質體制備過程中水合時間過久而被氧化，本實驗考察了水合時間對脂質體包封率的影響，由實驗結果可知，水合時間在15～75 min范圍內，包封率受水合時間的影響并不明顯，在水合時間為45 min時CO-CS包封率最大，之后緩慢下降，因此水合時間固定為45 min。

2.2? 響應面試驗結果分析

2.2.1? 響應面分析試驗方案及結果

為進一步優(yōu)化CO-CS的制備條件，在單因素實驗的基礎上，選取出藥脂比、超聲時間、膜材比3個顯著因素，以包封率為響應值，進行三因素三水平的響應面分析試驗，響應面試驗結果見表3。

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件對表3數據進行多元回歸擬合，得到CO-CS包封率對藥脂比A、超聲時間B、膜材比C的二次多項回歸模型為Y=89.29+2.31A-1.18B-4.22C-0.16AB-0.57AC+2.03BC-6.85A2-6.23B2-5.88C2，R2=0.991 6。對回歸方程系數進行顯著性檢驗見表4。

回歸方程式描述了CO-CS包封率與各影響因素間的關系，由表4 的回歸模型的顯著性分析可知，一次項A、C，交互項BC和二次項A2、B2、C2對CO-CS包封率的影響極顯著，一次項B對CO-CS包封率的影響顯著，其他因素的影響不顯著。F值的大小可以分析出CO-CS的包封率被單個因素所影響的程度。表中F值：FC>FA>FB，易得影響包封率的因素排序由大到小為膜材比、藥脂比、超聲時間。另外由該模型的顯著性分析得F值為91.60，相應總模型的P<0.000 1，響應面回歸模型達到了極顯著水平（P<0.01），失擬項不顯著（P=0.199 5>0.05），變異系數為1.21%（<10%），說明非試驗因素對結果的影響不大，模型具有較好的試驗穩(wěn)性?？偰Ｐ偷南嚓P系數R2為0.991 6，說明該模型的可信度為99.16%，試驗模型與實際試驗擬合較好，實際實驗中約99.16%的結果可通過該擬合模型進行解釋。校正后的決定系數R2adj為0.980 8，說明此模型有充分的準確性和通用性，可信度高，實驗誤差小，可用此模型對CO-CS的包封率進行分析預測。

2.2.2? 響應面分析交互作用

在回歸模型方差分析結果的基礎上，通過Design-Expert 8.0.6軟件依據回歸方程式，繪制出各實驗因素的響應面圖及等高線圖，分析藥脂比、超聲時間、膜材比對CO-CS包封率的影響。當固定藥脂比、超聲時間、膜材比三個因素中其中一個因素時，剩下的兩個因素的交互作用及其對包封率的影響可用等高線和響應面圖表示，響應面圖和等高線圖能夠直觀地看出顯著實驗因素及各實驗因素之間的相互作用對響應值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，則該實驗因素越顯著，等高線越接近橢圓，則兩個因素的交互作用越強［14-15］。根據CO-CS包封率的回歸方程作出各實驗因素的響應面圖及等高線圖，結果如圖 2。

由圖2可知，超聲時間和膜材比的交互作用對脂質體包封率影響最大，藥脂比和超聲時間的交互作用及藥脂比和膜材比的交互作用對脂質體包封率影響不顯著。

圖2（a）表示膜材比在中心水平時，藥脂比和超聲時間的交互作用對脂質體包封率的影響。如圖所示，當超聲時間一定時，脂質體包封率受藥脂比的影響不大，隨著藥脂比的增大，制備的脂質體包封率先增大后減?。划斔幹纫欢〞r，超聲時間對脂質體包封率的影響也不顯著。

圖2（b）表示超聲時間在中心水平時，藥脂比和膜材比的交互作用對脂質體包封率的影響。當藥脂比一定時，脂質體包封率受膜材比的影響不大，隨著膜材比的增加，脂質體包封率先增大后有所下降；當膜材比一定時，脂質體包封率與藥脂比保持不變時有相同的變化趨勢，則表示藥脂比和膜材比的交互作用不顯著。

圖2（c）表示藥脂比在中心水平時，超聲時間和膜材比的交互作用對脂質體包封率的影響。在超聲時間一定時，隨著膜材比的增加，脂質體包封率先增大后逐漸減?。划斈げ谋纫欢〞r，隨著超聲時間的延長，脂質體包封率先增大后逐漸減小。響應面圖形曲面較陡，等高線呈橢圓形且密集，表明超聲時間和膜材比的交互作用極顯著。

2.2.3? CO-CS優(yōu)化工藝驗證實驗

將脂質體的包封率作為考察指標，通過軟件Design-Expert 8.0.6得到CO-CS的最優(yōu)制備條件為藥脂比為1：16.37，超聲時間為8.55 min，膜材比為4.29：1，此時得到的脂質體包封率為90.25%。根據實際操作的可能性，將最佳制備條件調整為：藥脂比為1：16，超聲時間8.5 min，膜材比為4.3：1，利用該條件制備CO-CS，驗證包封率是否為預測的最大包封率值，進行5次重復實驗，結果如表5。

據表5可知，在最優(yōu)制備條件下制備的CO-CS與通過Design-Expert 8.0.6軟件預測的脂質體最大包封率接近，CO-CS的平均包封率為90.73%，與理論預測值相差不大，相對標準偏差為2.29%，表明采用響應面法優(yōu)化得到的CO-CS工藝可靠，具有一定的實際應用價值。

2.3? 優(yōu)化工藝制備的CO-CS的質量與穩(wěn)定性評價結果

2.3.1? CO-CS的外觀與電鏡觀察結果

CO-CS的外觀如圖3所示，外觀呈乳白色的混懸液，流動性良好。圖4為CO-CS的透射電鏡觀察結果，結果顯示其為分散、單一的圓球形顆粒，無明顯聚集現(xiàn)象，排列相對均勻，粒徑在200 nm左右。

2.3.2? 粒徑分布及 Zeta 電位

CO-CS的粒徑分布較為均勻，平均粒徑為206.63 nm，電位為-34.9 mV，粒徑分布及Zeta電位圖見圖 5。

2.3.3? 儲存穩(wěn)定性

將制備的CO-CS放置在常溫避光的儲存條件下進行保存，考察其儲存穩(wěn)定性。在儲存的第7、14、21、28及60 d后取樣，測定其包封率、粒徑、PDI 和Zeta 電位。

避光保存60 d后，CO-CS外觀為白色溶液，色澤均勻，與剛制備的脂質體溶液外觀無明顯差異。在粒徑、PDI、Zeta電位和包封率方面，粒徑稍有增大，變化不明顯；電位絕對值在30 mV以上，可認為是比較穩(wěn)定的；包封率稍有下降，但都大于80% ，符合《中國藥典》2020 年版要求［16］，表明CO-CS避光儲存60 d的穩(wěn)定性較好。

3? 結論與討論

粒徑大小被認為是與穩(wěn)定性、生物利用度和包封率相關的一個重要因素。只有50～500 nm的顆粒才能滲透到皮膚中，較小的顆粒可以使藥物更容易穿過角質層的屏障［17］。PDI 表明顆粒尺寸分布非均勻性的程度，范圍為0～1.0，PDI 數值越小表明粒度分布的均勻性越高。對于脂質體納米粒子而言，PDI 值在0～0.3，表明粒子分散均勻［18］。Zeta 電位是脂質體穩(wěn)定性的屬性之一，Zeta 電位是脂質體表面電荷的指標，絕對值越高，相互排斥作用越大，脂質體碰撞的頻率就降低，從而體系越穩(wěn)定，相對較高的 Zeta 電位對于脂質體的物理和化學穩(wěn)定性非常重要。Zeta電位絕對值大于30 mV，表明脂質體具有較好的穩(wěn)定性。本實驗制備的CO-CS粒徑為206.63 nm，PDI為0.187，Zeta 電位為-34.9 mV，可見試驗所制備的脂質體符合預期要求。

本研究成功優(yōu)化并建立起了一種簡單高效的CO-CS制備工藝，制得脂質體粒徑小、包封率高、分散性較好、較為穩(wěn)定，但將其轉化成產品進行實際應用時還需對其成本、貨期等進行評價。目前關于CO-CS制備的文章較少，故本研究制備的CO-CS具有良好的應用推廣前景，可為膠原蛋白產品進一步開發(fā)應用提供參考依據。

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