豬丹毒的病原學(xué)診斷及藥敏試驗(yàn)

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(1.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310018；2.寧波市奉化區(qū)畜牧獸醫(yī)總站)

寧波市奉化區(qū)某豬場生豬存欄720頭，其中母豬68頭。該場豬群于2018年5月開始發(fā)病，病初病豬食欲不振，病重的甚至食欲廢絕，精神沉郁, 被毛粗亂，體溫達(dá)到41.5 ℃以上，病豬糞便干硬呈顆粒狀，部分病豬的背部、頸部、臀部、耳根等處出現(xiàn)扁平微凸起的紫紅色疹塊,多為方形、菱形或不規(guī)則的圓形，指壓紅色可出現(xiàn)暫時消退；病豬呼吸急促呈腹式呼吸；也有少量病豬出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹伴有跛行等臨床癥狀。對病死豬剖檢，主要病變表現(xiàn)為: 肺充血、水腫，胸腔有淡黃色積液，淋巴結(jié)腫大，呈紫紅色出血性炎癥，十二指腸及空腸前段發(fā)生出血性炎癥，脾臟充血腫大，呈淡紅色；腎臟淤血腫大，呈彌漫性暗紅色，縱切面皮質(zhì)部有小紅點(diǎn)，心內(nèi)外膜小點(diǎn)狀出血，關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)腔有多量漿液性纖維素性滲出液，滲出液為紅色粘稠性膠凍樣。發(fā)病由育肥豬開始，逐漸擴(kuò)散至母豬、公豬和保育豬。病情前后持續(xù)了20多天，各類日齡豬只總共死亡150多頭。2018年6月，該豬場將2頭病豬肺臟送至浙江省動物疫病預(yù)防控制中心作進(jìn)一步病原學(xué)診斷及藥敏試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設(shè)備 培養(yǎng)箱購自Binder公司，型號：KB115；顯微鏡購自ZEISS公司，型號：Scope. A1；生物安全柜購自Thermo scientific公司，型號：1300 Series A2，細(xì)菌鑒定儀購自生物梅里埃，型號：VITEK 2 COMPACT，滅菌器購自TOMY公司，型號：SX-700。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，革蘭氏染色液試劑盒購自青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司，三糖鐵瓊脂及產(chǎn)硫化氫微量反應(yīng)管購自青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司，革蘭氏陽性菌鑒定卡購自生物梅里埃，藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 樣本來源 2018年6月11日，浙江省寧波市奉化區(qū)某豬場送檢的2頭病豬肺臟，分別編號為肺1、肺2。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 無菌操作法切開病變組織，用接種環(huán)刮取病料接種于血平板，于37℃下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細(xì)菌鑒定

1.2.2.1 菌落形態(tài) 于血平板上培養(yǎng)18-24 h，觀察菌落形態(tài)。

1.2.2.2 細(xì)菌形態(tài)及染色特性 挑取可疑菌落作革蘭氏染色，油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)及染色情況。

1.2.2.3 過氧化氫酶試驗(yàn) 在潔凈的載玻片上滴1滴3%的H2O2溶液，用接種環(huán)挑取適量的可疑菌在H2O2溶液中混勻，觀察是否有氣泡產(chǎn)生。

1.2.2.4 H2S觀察 挑取可疑菌落穿刺接種于三糖鐵斜面培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24 h，觀察結(jié)果。

1.2.2.5 生化鑒定 用無菌棉簽刮取適量細(xì)菌純培養(yǎng)物混懸于3 mL無菌生理鹽水中，使用VITEK 2濁度計測試細(xì)菌濃度，將細(xì)菌濃度調(diào)整至0.5～0.63麥?zhǔn)蠁挝唬瑢P細(xì)菌鑒定卡吸液導(dǎo)管置于菌懸液中，并置于細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定[3]。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 按照NCCL推薦的K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法[4]，選用臨床上常用藥物分別對分離純化的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用無菌生理鹽水將待檢菌株制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，含菌量?×107～5×108，用滅菌棉簽拭子浸入細(xì)菌懸液中，在管壁擠去多余菌液，然后均勻涂布在90 mm血平板上，室溫靜止3-5 min后，無菌操作將藥敏紙片均勻貼在上述血平板上，37℃培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，判斷待檢菌株對各種藥物的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài) 肺1、肺2接種在血平板上培養(yǎng)24 h后，均出現(xiàn)細(xì)小、圓而凸起，有光澤，周圍有輕微的溶血菌落(圖1)。

圖1 肺1接種平板菌落生長情況

2.1.2 細(xì)菌形態(tài) 在肺1血平板培養(yǎng)物中，挑取可疑菌落(編號為ZJYK-01235菌株)涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陽性桿菌，菌體細(xì)長，菌體長短不一，平直或稍彎曲，有的呈長絲形，單獨(dú)存在，有的呈短鏈或V形排列[2](圖2)。

2.2 觸酶試驗(yàn)結(jié)果 ZJYK-01235菌株觸酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.3 H2S產(chǎn)生情況 ZJYK-01235菌株在三糖鐵斜面培養(yǎng)基中均有黑色沉淀，表明有硫化氫產(chǎn)生(圖3)。

圖2 ZJYK-01235菌株鏡檢(1000×)情況

圖3 ZJYK-01235菌株H2S產(chǎn)生情況

2.4 生化鑒定結(jié)果 生化鑒定結(jié)果顯示ZJYK-01235菌株為紅斑丹毒絲菌，生化反應(yīng)結(jié)果見表1。

表1 ZJYK-01235菌株兩株細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

注：+ 表示為陽性，- 表示為陰性

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 ZJYK-01235菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對阿莫西林、恩諾沙星等敏感，對慶大霉素、卡那霉素等耐藥(表2)。

表2 ZJYK-01235菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S-敏感；I-中介；R-耐藥

3 討 論

丹毒絲菌屬包括紅斑丹毒絲菌(E.rhusiopathiae)、產(chǎn)單核細(xì)胞丹毒絲菌(E.monocytogenes)、扁桃體丹毒絲菌(E.tonsillarum)。豬源紅斑丹毒絲菌最早于1882年首次分離鑒定，是一種世界性廣泛分布的病原菌。紅斑丹毒絲菌引起的豬丹毒是一種急性、熱性、人畜共患傳染病，其特征主要表現(xiàn)為急性敗血癥和亞急性疹塊型，也有表現(xiàn)慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或心內(nèi)膜炎[1]。丹毒絲菌可感染包括哺乳動物、禽和魚類等70多種動物，其中豬最為敏感。豬紅斑丹毒絲菌主要感染3-12月齡豬，一年四季均可發(fā)病，發(fā)病率一般為10%～15%，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%。豬丹毒廣泛流行于世界各地，為我國主要的豬傳染病之一，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

病豬和帶菌豬是本病的傳染源。帶菌豬以及其他帶菌動物的分泌物、排泄物排出菌體污染飲水、飼料、土壤、籠舍等，經(jīng)消化道傳染給易感豬。本病也可以通過損傷皮膚及蚊、蠅、虱等吸血昆蟲傳播。本病多發(fā)于夏秋季節(jié)，5-8月呈流行高峰期，尤其是氣候悶熱、暴雨之后較易流行，冬春寒冷季節(jié)發(fā)病則較少[5]。為防止天氣突變所帶來的應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)免疫，可在飲水中添加多維、黃芪多糖等抗應(yīng)激、提高免疫力藥物[6]。對豬舍、用具應(yīng)保持清潔，可采用 1%～2%的氫氧化鈉溶液對地面進(jìn)行消毒，對豬舍也可用10%的石灰乳涂刷墻面等[7]，以減少環(huán)境中有害微生物的生長。

該場發(fā)病初期用強(qiáng)力霉素、氟本尼考拌料防治，由于病豬食欲不振甚至食欲廢絕, 病豬并未攝入藥物，每天都有豬只死亡，防治效果不佳；后改用青霉素或阿莫西林肌注，用阿莫西林拌料, 并將豬群中的病豬迅速隔離治療，同時每天加強(qiáng)對豬舍消毒，病情得到有效控制。病情控制后又用豬丹毒、豬瘟二聯(lián)弱毒疫苗對全場豬只進(jìn)行免疫，20 d后回訪，豬群病情穩(wěn)定，無新病例發(fā)生。