抗菌藥物影響禽腸道菌群及免疫應(yīng)答研究進(jìn)展

陳勝宏,聞曉波,冉旭華

(海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院,海南?？?570228)

人和動(dòng)物的消化道內(nèi)含有大量的微生物,其中細(xì)菌占絕對(duì)數(shù)量。腸道菌群不但有助于食物的消化、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝,而且在腸道發(fā)育、維持腸道上皮細(xì)胞屏障完整性、免疫系統(tǒng)發(fā)育以及抗感染等諸多方面具有重要作用。千百萬年來,腸道內(nèi)微生物與人、動(dòng)物共同進(jìn)化,構(gòu)成了必不可少的內(nèi)部生態(tài)系統(tǒng)或者稱之為“超級(jí)有機(jī)體”。正常情況下,動(dòng)物腸道解剖學(xué)位置、遺傳背景(品系)、飼料、養(yǎng)殖模式、日齡、氣候和地理位置等因素導(dǎo)致動(dòng)物腸道內(nèi)細(xì)菌種類和豐度存在較大差異,但總體可以保持特定生長階段的穩(wěn)態(tài),維護(hù)機(jī)體健康和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腸道微生物群落通過多種方式影響宿主的物質(zhì)代謝與吸收、生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)及病原抵抗等功能[1]。然而,當(dāng)這種穩(wěn)態(tài)紊亂后,則會(huì)對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)且復(fù)雜的影響,例如抗菌藥物的不規(guī)范使用會(huì)改變禽類菌群結(jié)構(gòu),降低腸道菌群的穩(wěn)定性、多樣性及豐度,進(jìn)而導(dǎo)致腸道菌群屏障功能減弱、宿主腸道免疫系統(tǒng)受損,影響機(jī)體生長發(fā)育、物質(zhì)代謝與營養(yǎng)吸收。為此本文對(duì)家禽腸道菌群的組成、腸道菌群與腸道免疫的關(guān)系、抗菌藥物對(duì)腸道菌群及免疫影響的研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)闡述。

1 禽腸道菌群概述

禽消化道內(nèi)包含了大量的、動(dòng)態(tài)變化的腸道微生物,包括細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、原生動(dòng)物、病毒,其中以細(xì)菌為主[2],且盲腸內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量最多[3]。在門分類水平上,主要為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門及放線菌門成員[4],占總數(shù)的90%以上[2],且在消化道的不同部位,腸道菌群的組成和豐度均存在一定差異[5]。禽嗉囊內(nèi)容物的細(xì)菌密度約為每克內(nèi)容物108～109菌落形成單位(colony-forming units,CFU),主要為厚壁菌門(主要為乳酸球菌屬)、放線菌門(雙歧桿菌屬)和變形菌門(腸桿菌屬);禽肌胃內(nèi)容物細(xì)菌密度約為107～108CFU/g,其組成基本與嗉囊內(nèi)一致;小腸內(nèi)菌群主要為厚壁菌門和變形菌門;盲腸內(nèi)細(xì)菌密度最高,約為1010～1011CFU/g,菌群的多樣性也最高,預(yù)測約含有2 200分類操作單元(operational taxonomic units,OTUs)和3 500個(gè)基因型[6]。綜合不同的研究數(shù)據(jù),厚壁菌門細(xì)菌占腸道菌群總數(shù)44%～56%,擬桿菌門細(xì)菌占23%～46%,變形菌門占1%～16%[5]。

動(dòng)物日齡、品系、性別、飼料以及抗菌藥物使用都是影響腸道菌群組成的因素,導(dǎo)致腸道菌群組成和豐度出現(xiàn)較大差異。如7～42日齡白羽肉雞糞便菌群多樣性差異不顯著,但在7日齡前存在顯著差異[7];雞和火雞的腸道菌群在種水平上的相似性僅16%[2]。有研究表明,公雞十二指腸、回腸和盲腸內(nèi)容物菌群多樣性高于母雞,但空腸內(nèi)容物中菌群多樣性低于母雞;公雞十二指腸和空腸內(nèi)容物菌群豐度低于母雞,但回腸和盲腸內(nèi)容物中的菌群豐度高于母雞[8]。與普通飼料相比,發(fā)酵飼料能夠增加雞腸道中厚壁菌門的相對(duì)豐度,增加瘤胃菌科和毛螺菌科等有益菌群比例,并且降低大腸埃希氏菌等有害菌所占的比例[9];通過飲水給予雛雞4種常用抗菌藥物——黏菌素、利高霉素、阿莫西林和恩諾沙星,發(fā)現(xiàn)使用抗菌藥物會(huì)破壞雛雞腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡,導(dǎo)致菌群失衡,其中利高霉素給藥對(duì)腸道菌群的影響最為顯著[10]。

2 腸道菌群與免疫系統(tǒng)的關(guān)系

腸道菌群在維持人和動(dòng)物的生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)的成熟以及機(jī)體健康方面起到非常重要的作用[11]。例如,與正常雞相比,無菌雞盲腸扁桃體明顯萎縮,并完全缺失淋巴濾泡[12];無菌雞的杯狀細(xì)胞發(fā)育不成熟,導(dǎo)致腸腔內(nèi)黏蛋白缺失,進(jìn)而造成腸道黏液屏障受損[13-14]。給肉用公雛雞飼喂發(fā)酵乳桿菌和啤酒酵母,提高了公雛雞的Toll樣受體2(toll like receptor 2,TLR2)和TLR4的表達(dá),同時(shí)提高了公雛雞結(jié)腸組織內(nèi)CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量[15]。張小龍等研究表明,低體重雞血清脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)水平顯著高于高體重雞,TLR4、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)及相關(guān)炎性細(xì)胞因子在低體重雞空腸組織中的表達(dá)顯著上調(diào),導(dǎo)致腸道屏障完整性受損[16]。

基于腸道菌群的重要性,近年來,菌群移植技術(shù)已經(jīng)廣泛用于試驗(yàn)和臨床研究,尤其是在腸道疾病治療方面效果顯著。例如,給患有腸炎的低體重雞移植糞菌后,血清LPS濃度顯著降低,空腸及其腸絨毛的長度均有顯著增加,TLR4、MyD88和NF-κB等分子的相對(duì)mRNA表達(dá)量顯著降低,白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)等促炎細(xì)胞因子的相對(duì)mRNA表達(dá)量顯著降低, IL-4、IL-10等抗炎細(xì)胞因子顯著升高,空腸炎癥得到緩解,生長性能得以恢復(fù)[16]。同樣,SPF雞在接受健康雞的糞菌移植后,體重顯著升高,腸絨毛長度顯著增加,血液中IL-1β、IL-18含量顯著升高,同時(shí)對(duì)沙門氏菌的抗感染能力也有所增強(qiáng)[17]。以上試驗(yàn)均證實(shí)腸道菌群對(duì)免疫系統(tǒng)的成熟具有重要的作用。

腸道菌群與腸道免疫系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[18]。腸道黏膜表面存在大量分泌免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)的B細(xì)胞、上皮淋巴細(xì)胞、γδ T細(xì)胞、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg),這些淋巴細(xì)胞的分布和功能是由腸道菌群調(diào)節(jié)的,以此對(duì)抗病原體感染,維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[11,19-20],同時(shí)阻止病原微生物侵入腸道黏膜下層,對(duì)腸道單層上皮及腸道緊密連接起到第一道防火墻的作用[21]。反之,免疫系統(tǒng)也可調(diào)控腸道共生菌群的穩(wěn)定性,腸道黏膜除了為腸道菌群提供定居點(diǎn)和營養(yǎng)外,黏膜層內(nèi)的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞對(duì)侵入的病原菌做出適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答,既要控制和消滅病原微生物,同時(shí)避免產(chǎn)生過度的免疫應(yīng)答,維持腸道共生菌群的生長和菌群穩(wěn)定[12,22]。然而,腸道菌群與腸道免疫系統(tǒng)之間的復(fù)雜且精細(xì)的相互作用易受到外來多種因素的干擾和破壞,例如抗菌藥物添加和微生物感染[18],造成營養(yǎng)物質(zhì)吸收、代謝、抗感染免疫的缺陷。

3 抗菌藥物對(duì)禽腸道菌群穩(wěn)態(tài)的影響

抗菌藥物的副作用更多的是造成腸道菌群紊亂,而不是藥物的直接副作用?？咕幬锿ㄟ^直接或間接作用導(dǎo)致禽腸道菌群失調(diào),影響機(jī)體免疫力。盡管適當(dāng)使用抗菌藥物對(duì)禽的健康不會(huì)造成明顯的副作用,但是抗菌藥物添加是導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的最主要因素[23],對(duì)禽的免疫調(diào)控或健康造成一定危害。在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),混合抗菌藥物(氨芐西林、硫酸新霉素、甲硝唑和萬古霉素)投喂肉雞后,肉雞腸道菌群豐度及多樣性顯著降低,雞腸道菌群失調(diào),導(dǎo)致肉雞的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、IL-17和TLR2顯著降低,進(jìn)而顯著降低雞肺部抗敗血癥支原體感染的能力[24]。另外,混合抗菌藥物(萬古霉素、新霉素、甲硝唑和兩性霉素B)飼喂2周后再經(jīng)LPS攻毒的蛋雞,其IgM和IgY的總含量均顯著降低,腸道中放線菌門、變型菌門顯著升高,厚壁菌門顯著降低[25]。Videnska P[26]等經(jīng)16S rRNA測序發(fā)現(xiàn),給母雞飼喂四環(huán)素或鏈霉素后,其糞便中雙歧桿菌、擬桿菌、梭菌、脫硫弧菌、伯克氏菌和彎曲菌的數(shù)量降低,而腸桿菌和乳桿菌的數(shù)量有所上升,相應(yīng)的腸道微生物代謝物含量可能存在極大差異。

4 抗菌藥物影響機(jī)體免疫的機(jī)制

為了證實(shí)抗菌藥物對(duì)腸道菌群、機(jī)體免疫器官成熟及免疫相關(guān)指標(biāo)的影響,通常采用給人口服廣譜抗菌藥物或給動(dòng)物(小鼠或禽)投喂某類抗菌藥物[27],通過16S rRNA或宏基因組測序,分析腸道或糞便中菌群組成及豐度變化,結(jié)合組織病理切片、免疫學(xué)、人工病原微生物感染等手段分析抗菌藥物的影響,以此評(píng)估特定菌群變化對(duì)禽腸道健康及免疫指標(biāo)水平的影響[17,24],并由此證實(shí)腸道菌群在調(diào)控禽類免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[25]。有研究數(shù)據(jù)和結(jié)果顯示,抗菌藥物可通過如下幾個(gè)方面對(duì)機(jī)體免疫造成影響。

4.1 通過直接或間接的殺滅作用破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)

腸道菌群的不同亞群之間普遍存在共生和相互依賴關(guān)系。某一類細(xì)菌的代謝產(chǎn)物是某些腸道微生物生長所必需的。例如,腸道中的許多細(xì)菌可以產(chǎn)生乙酸鹽[28],而在無乙酸鹽的情況下,糞桿菌不會(huì)在純培養(yǎng)物中生長[29];青春雙歧桿菌在低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)純培養(yǎng)物上生長的過程中會(huì)產(chǎn)生大量乳酸,而在與哈氏真桿菌共培養(yǎng)時(shí)乳酸的可檢測量明顯降低[30];腸道羅氏菌與長雙歧桿菌在FOS純培養(yǎng)物中共培養(yǎng)時(shí),腸道羅氏菌起初的生長被抑制,隨著長雙歧桿菌產(chǎn)生足夠多的醋酸鹽,腸道羅氏菌的生長逐漸恢復(fù)正常[31]。

但在消滅病原菌的過程中,由于抗菌藥物的廣譜殺菌活性,腸道共生菌群被抗菌藥物無差別的殺滅或抑制。需要指出的是,不同的抗菌藥物或者聯(lián)合用藥,具有不同的抗菌譜,導(dǎo)致腸道菌群的變化也有差異。正常情況下,禽類腸道內(nèi)的細(xì)菌通過發(fā)酵,產(chǎn)生短鏈脂肪酸及合成某些維生素,提高飼料轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)性能。研究發(fā)現(xiàn),禽類盲腸內(nèi)微桿菌和鞘氨醇單胞菌的豐度與脂肪代謝呈正相關(guān),可以促進(jìn)禽類的生產(chǎn)性能;而放線菌科中的史雷克菌(Slackia)與脂肪代謝卻呈負(fù)相關(guān)[32]。

4.2 抗菌藥物破壞腸道免疫反應(yīng)

腸道菌群時(shí)刻通過Toll樣受體(TLRs)和NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)等模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)與宿主進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[33-34],參與宿主生長發(fā)育[34]、炎癥反應(yīng)[35-36]等過程。在抗菌藥物的作用下,禽類腸道中某些有益菌豐度顯著降低,而攜帶大量抗菌藥物耐藥基因的藍(lán)藻菌豐度顯著升高,回腸中黏蛋白2(Mucin-2)、TLR4、MyD88和NF-κB、IL-1β和IFN-γ等基因的mRNA水平均顯著下降,導(dǎo)致免疫應(yīng)答相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻,腸道調(diào)節(jié)炎癥的能力減弱[37]。雞TLRs在天然免疫方面具有重要作用,病原體多種成分可以同時(shí)激活幾種TLRs,產(chǎn)生免疫反應(yīng)[38]。肉雞腸道組織和免疫器官的TLRs表達(dá)顯著高于其他組織[39],雞TLR2可識(shí)別細(xì)菌并引起免疫應(yīng)答,雞TLR4可特異性識(shí)別LPS,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[40],但抗菌藥物處理后腸組織中TLR2、TLR4的mRNA含量顯著降低[41],導(dǎo)致腸道非特異性免疫降低。腸道共生菌可通過影響免疫細(xì)胞或者上皮細(xì)胞的活性進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道黏膜穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),非致病性沙門氏菌抑制人腸道上皮細(xì)胞炎癥因子的合成,這可能是由于沙門氏菌阻止IκB-α的降解,抑制NF-κB的激活,下調(diào)依賴NF-κB的細(xì)胞因子表達(dá)[42];多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)通過加快腸道上皮細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄因子核輸出,進(jìn)而抑制NF-κB的活性[43],而抗菌藥物的濫用,必然會(huì)打破腸道共生菌調(diào)節(jié)的腸道黏膜穩(wěn)態(tài)。

4.3 抗菌藥物影響宿主免疫應(yīng)答及免疫細(xì)胞發(fā)育

腸道黏膜固有層內(nèi)的3型天然淋巴細(xì)胞(group 3 innate lymphoid cells,ILC3s)可以通過IL-22依賴的途徑限制腸腔內(nèi)微生物的轉(zhuǎn)位。然而,抗菌藥物對(duì)ILC3s的招募和成熟具有較大的影響,導(dǎo)致IL-22的表達(dá)下降,便于病原微生物的侵入[44]。同時(shí),抗菌藥物也可以破壞腸道內(nèi)輔助性T細(xì)胞1(T helper cell 1,Th1)與Th2的比例,導(dǎo)致腸道內(nèi)T細(xì)胞比例失調(diào),降低Th17細(xì)胞的豐度,使腸道防御病原微生物感染的能力下降。

大腸內(nèi)的細(xì)菌通過發(fā)酵纖維素產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFAs),SCFAs在維持上皮細(xì)胞的完整性、Treg細(xì)胞的分化和聚集以及調(diào)控炎癥和免疫應(yīng)答方面具有重要作用?？咕幬锟梢杂绊懩c道SCFAs的產(chǎn)量,從而影響Th17及Treg細(xì)胞的豐度,加重病原菌感染后的炎癥反應(yīng)[44-45]。通過給雞飼喂混合抗菌藥物(氨芐西林、硫酸新霉素、甲硝唑和萬古霉素),發(fā)現(xiàn)雞肺部抗敗血癥支原體感染能力顯著減弱[24],其原因在于抗菌藥物破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致乙酸、丙酸、丁酸及維生素A的生物活性分子(視黃醇、視黃烯)顯著降低,其中丁酸鹽可以誘導(dǎo)具有強(qiáng)抗菌活性的巨噬細(xì)胞分化[46],而維生素缺乏則與嚴(yán)重的支原體感染相關(guān)聯(lián)[47]。

5 展望

抗菌藥物在家禽生產(chǎn)中主要用于疾病的預(yù)防與治療,但抗菌類藥物的不合理使用,可潛在破壞家禽腸道菌群組成結(jié)構(gòu)及定植屏障,間接導(dǎo)致宿主腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育不良、免疫應(yīng)答受阻等狀況,從而為外源性病原菌在腸道內(nèi)定植并最終引起腸道感染提供了機(jī)會(huì)。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用,有助于研究者對(duì)禽類腸道菌群及其與機(jī)體免疫系統(tǒng)關(guān)系的進(jìn)一步了解,并結(jié)合腸道菌群結(jié)構(gòu)特征開發(fā)針對(duì)性的配方飼料、藥物研發(fā)及疾病防治等的研究,通過調(diào)控特定腸道菌群的組成與豐度,達(dá)到調(diào)節(jié)禽類免疫系統(tǒng)發(fā)育、生長代謝、疾病防控等效果,實(shí)現(xiàn)降本增效的目標(biāo)。