72種單方中草藥對烏鱧源維氏氣單胞菌的體外抑菌效果

孫云貴 李澤昱 強璐 高迎莉

摘要：為篩選出抑制烏鱧源維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）的單方中草藥，結合了前人研究結果及《水產養(yǎng)殖用藥明白紙2022年2號》中規(guī)定使用的中草藥，挑選了73種中草藥，通過煎煮法制備中草藥提取液，篩選抑菌圈>10 mm的中草藥；進而測定中草藥的最小抑菌質量濃度（MIC）和最小殺菌質量濃度（MBC）。研究結果表明，訶子（Chebulae Fructus）、五倍子（Galla chinensis）、五味子（Schisandrae chinensis）、烏梅（Mume Fructus）、地錦草（Euphorbiae humifusa Herba）和酒萸肉（Corn：Fructus）的抑菌效果最好，對10株維氏氣單胞菌的抑菌圈直徑均在10 mm以上，高度敏感率為55%；MIC≤62.5 mg/mL，在所有MIC中的占比為85%；MBC≤125 mg/mL，在所有MBC中的占比為90%。地榆（Sanguisorba Radix）和丁香（Caryophylli Flos）等25種中草藥對維氏氣單胞菌有抑菌作用；使君子（Quispualis Fructus）和雷丸（Omphalia）等47種中草藥無抑菌作用。以上結果顯示，訶子等6種中草藥對烏鱧源維氏氣單胞菌具有明顯抑菌和殺菌活性，可作為防控維氏氣單胞菌的用藥參考。

關鍵詞：維氏氣單胞菌；中草藥；抑菌；最小殺菌質量濃度

中圖分類號：S948；S182? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）08-0157-09

收稿日期：2023-06-01

基金項目：江蘇省政策引導類計劃（蘇北科技專項）（編號：SZ-LYG202133）；江蘇省高等學校基礎科學（自然科學）研究面上項目（編號：22KJB240001）；江蘇省生物技術重點實驗室開放基金（編號：HS2020003）；江蘇省優(yōu)勢學科建設項目。

作者簡介：孫云貴（1998—），男，山西晉中人，碩士研究生，主要從事水產動物病害與免疫研究。E-mail：Sunyungui@outlook.com。

通信作者：高迎莉，博士，講師，主要從事水產動物病害與免疫研究。E-mail：yingli.gao@jou.edu.cn。

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）在水生環(huán)境和陸生環(huán)境中分布非常廣泛［1］。據(jù)報道，維氏氣單胞菌可引起多種水生動物潰爛病及牲畜和人類的腹瀉，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成經濟損失，也嚴重影響了人類健康［2］。

目前，國內外對水產養(yǎng)殖動物疾病預防和治療策略主要還傾向于使用抗生素和化學品，但藥物殘留、環(huán)境微生態(tài)平衡破壞及細菌耐藥性的問題已對水產養(yǎng)殖業(yè)產生影響［3］。2023年2月，我國農業(yè)農村部發(fā)布的《春季水產技術指引》中規(guī)定“嚴禁抗生素濫用”；同年3月，農業(yè)農村部發(fā)布的《農業(yè)農村部辦公廳關于做好2023年水產綠色健康養(yǎng)殖技術推廣“五大行動”工作的通知》中提到“骨干基地要實現(xiàn)用藥量、特別是抗生素使用量同比持續(xù)降低”。因此，為響應政府號召，做好綠色健康養(yǎng)殖，尋找替代抗生素的治療藥物和策略迫在眉睫。

近年來，人們對食品安全的關注程度逐年增加，人們越來越趨向于天然產品的消費。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)表明，2021年中草藥及中成藥類成交額達 1 855.30 億元，并且在2013—2021年間中草藥及中成藥類成交額一直處于上升趨勢，具有良好的增長潛力［4］?！爸胁菟帯币辉~最早出現(xiàn)在《神農本草經》中，最初中草藥用于治療人類的疾病，之后發(fā)展到治療動物疾病。近年來，中草藥被廣泛應用于水產疫病防控中［5-8］，使用綠色、低廉的中草藥治療水產動物疾病已成為一種趨勢。羅非魚（Oreochromis niloticus GIFT strain）飼喂苦參含量為0.1%的飼料后，無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）攻毒后的死亡率僅為21.1%，相對存活率為73.3%，表明苦參對無乳鏈球菌有很強的抑菌效果［9］。野鯪（Labeo victorianus）抗嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的研究中發(fā)現(xiàn)，野鯪的存活率會隨著飼料中蕁麻（Urtica fissa）細粉的含量增加而增加，飼料中蕁麻細粉添加到5%時，野鯪的存活率達95%［10］。東北林蛙（Rana dybowskii）飼喂含 0.2 kg/kg中草藥提取物的活餌5～6 d后，采用嗜水氣單胞菌對其進行攻毒，對照組在攻毒后9 d全部死亡，紅花（Carthamus tinctorius）組和五倍子（Galla chinensis）組在攻毒 11 d 后死亡情況趨于穩(wěn)定，存活率分別為55%和35%，抑菌效果明顯［11］。擬穴青蟹（Scylla paramamosain）在濃度為20 mg/L的五倍子溶液中藥浴3 d后，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）攻毒后的最終存活率為40%，存活的螃蟹表現(xiàn)出敏捷的活力，而對照組的死亡率在5 d達100%［12］。綜上所述，中草藥可作為疫苗、抗生素或化學藥品的有效替代品，在治療和預防水產養(yǎng)殖動物等方面顯現(xiàn)出非常廣闊的應用前景，也使人類能夠獲得更安全的水產養(yǎng)殖產品。

本研究通過煎煮法制得訶子（Chebulae Fructus）等73種中草藥提取液，分別測定了72種中草藥提取液對不同來源的維氏氣單胞菌的體外抑菌圈大小、最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），篩選出能夠抑制維氏氣單胞菌的單方中草藥，研究結果旨在為烏鱧源維氏氣單胞菌引起疾病的臨床治療提供理論依據(jù)，同時為中草藥對烏鱧潰爛病的預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 LB營養(yǎng)瓊脂和LB營養(yǎng)肉湯（青島海博生物技術有限公司）；96孔板和8 mm打孔器及其他試驗所需材料，均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.2 供試菌株 不同株的烏鱧源維氏氣單胞菌見表1，由江蘇海洋大學江蘇海水養(yǎng)殖動物病害重點實驗室提供，2022年5月分離鑒定。在超凈工作臺中，劃線接種，培養(yǎng)24 h（28 ℃），挑單菌落于1.5%無菌生理鹽水中，采用紫外分光光度計將濃度調整為1.0×107 CFU/mL，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 中草藥液的制備 雞血藤、烏梅、丁香、艾葉、大黃、黃柏、穿心蓮、魚腥草、黃連、大青葉、黃芪、柴胡、青蒿、側柏葉、苦參、玄參、鶴虱、板藍根、山豆根、陳皮、川楝子、桔梗、熟地黃、酒萸肉、白頭翁、山藥、車前子、牡丹皮、茯苓、龍膽、厚樸、石膏、五味子、知母、五倍子、當歸、黃藥子、百部、梔子、玄明粉、浙貝母、綿馬貫眾、虎杖、黃芩、淫羊藿、茵陳、地錦草、甘草、仙鶴草、訶子、蘇木、辣蓼、檳榔、地榆、石榴皮、常山、使君子、木香、蒼術、郁金、連翹、半夏、金銀花、青黛、益母草、苦諫樹皮、丹參、山楂、麥芽、雷丸、蒲公英和博落回等72種中草藥（表2），均購于安徽亳州中藥材市場。

2022年11月，在江蘇海洋大學水產動物病害與免疫學實驗室分別取研磨至約100目的中草藥超微粉劑10 g， 加200 mL蒸餾水，在磁力攪拌器上攪拌30 min，使藥粉與水充分混合，然后浸泡2 h，4 000 r/min 離心10 min，取上清采用濾紙過濾，取濾液加熱濃縮至10 mL，8 000 r/min離心10 min，取上清制成1 000 mg/mL的藥液，121 ℃高溫滅菌，4 ℃ 保存。此方法用于體外抑菌圈試驗，減小工作量，已達快速篩選的目的。

取初步篩選的中草藥超微粉劑20 g，加400 mL蒸餾水，在磁力攪拌器上攪拌30 min，使藥粉與水充分混合后，浸泡2 h，大火煮沸改小火熬制30 min，4 000 r/min 離心10 min，收集濾液，重復3次。將收集得到的濾液加熱濃縮至20 mL，8 000 r/min離心10 min，取上清制成1 000 mg/mL的藥液，高溫滅菌后，4 ℃保存?zhèn)溆?。此方法用于測定中草藥的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.2 藥物敏感性測定 采用瓊脂擴散法測定藥物敏感性［13］，取維氏氣單胞菌懸液0.1 mL，涂布于厚度為8 mm LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，采用打孔器打孔（孔徑為8 mm，每個培養(yǎng)基打4個孔，3個孔為生物學重復，1個孔為陰性對照），加100 μL LB營養(yǎng)瓊脂封底，試驗孔加入0.1 mL中藥原液；28 ℃正置培養(yǎng)24 h，以3個不同角度測定抑菌圈直徑。根據(jù)研究方法［14］規(guī)定，判斷抑菌圈。

1.2.3 單方中草藥MIC和MBC測定 參照夏與晴等的方法［15］，測定烏梅、五倍子、五味子、訶子、地錦草和酒萸肉（抑菌圈直徑>10 mm）的MIC和MBC。無菌條件下，8個離心管分別加入300 μL LB肉湯，后在第1管中加入300 μL待測中藥混勻，接著2倍比稀釋至第8管，每管液體終體積300 μL。96孔酶標板見圖1，各孔加入上述配制好的溶液100 μL。A～H行藥液濃度分別為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91 mg/mL。1～3列的A～H行加入菌懸液10 μL，作為試驗組；第4～6列（A～B行）加入肉湯作為空白對照組，觀察是否有細菌生長；第4～6列（C～D行）加入 50 μL 肉湯和50 μL待測藥液，作為陰性對照；第4～6列（E～F行）加入10 μL菌液，作為陽性對照（細菌是否正常生長）；采用保鮮膜包裹，28 ℃培養(yǎng)18～24 h后，每孔吸取50 μL待測溶液進行涂布并培養(yǎng)18 h（倒置）。根據(jù)前人試驗的觀察結果［16］判定，試驗組與空白對照組的透明度相同的濃度，即為待測中草藥的MIC。

取高于MIC濃度的96孔中的混合液涂布，培養(yǎng)18 h，少于5個單菌落的濃度即為待測中草藥的MBC。

2 結果與分析

2.1 制取工藝影響

由圖2可知，2種制取工藝制得的中草藥液間的抑菌圈大小，SPSS數(shù)據(jù)分析結果表明，2種方法的抑菌圈直徑差異不顯著（P>0.05）。

2.2 73種中草藥液體外抑菌效果

由表3可知，25種中草藥對維氏氣單胞菌具有抑菌效果，其他47種單方中草藥無抑菌效果。結果顯示，五倍子對菌株C的作用極強（+++），抑菌圈直徑為 21 mm；訶子等22 種中草藥對不同菌株存在中等強度或以上的抑菌效果，其中，訶子、地錦草、五倍子、酒萸肉、烏梅和五味子對所有菌株均有中等或以上的抑菌強度（+），抑菌圈直徑為11～21 mm；受試菌株對側柏葉等50種中草藥提取物不敏感，抑菌圈直徑均<10 mm。

2.3 MIC和MBC的測定結果

由表4可知，訶子、五倍子、烏梅、五味子和酒萸肉對10株受試菌株的MIC多數(shù)在31.25～62.50 mg/mL 之間，其中，五倍子和烏梅對菌株12的MIC最低，濃度為15.63 mg/mL，五味子對菌株10的MIC最高，濃度為250 mg/mL；地錦草除了對菌株C和菌株2F1的MIC為31.25 mg/mL外，對其他菌株的MIC均在125.00～500.00 mg/mL之間。

3 討論

3.1 中草藥提取工藝

目前， 實驗室提取中草藥液的方法主要是煎煮法，優(yōu)點是對設備的要求低，但篩選過程耗時長，工作量大。因此，本研究在煎煮法的基礎上做了一些改進，采用了中草藥的超微粉劑，并采用磁力攪拌的方法加速中草藥與水混合，獲取濾液用于中草藥抑菌圈試驗，相比傳統(tǒng)的煎煮法的提取效率顯著增加。

3.2 中草藥抑菌效果

研究表明，抗生素主要通過抑制細胞壁的合成、與細胞膜相互作用等機制發(fā)揮抗菌的作用，對細菌選擇壓力大，易誘導細菌產生耐藥性［17］。而中草藥的抑菌和殺菌機制是其中的有效成分作用于細菌的致病因子，減少細菌的抗藥性和致病能力，同時促進機體的免疫應答，從而起到抑制及殺滅細菌的效果。所以，中草藥抑菌的主要機制是直接抑菌作用和增強免疫應答［18］。中草藥抑菌大大降低了細菌的選擇壓力， 不易產生耐藥性［19］。因此， 研究中草藥的抑菌效果具有重要意義。

王寶屯等的研究結果顯示，烏梅、蘇木、五倍子、丁香和艾葉對花鱸（Lateolabrax maculatus）源維氏氣單胞菌具有較強的體外抑菌效果（抑菌圈直徑在15～25 mm之間），MIC<125 mg/mL，且MBC<500 mg/mL［20］。朱成科等研究發(fā)現(xiàn)，單方中草藥五倍子、石榴皮、地榆和烏梅對黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）源維氏氣單胞菌的抑菌作用最強，抑菌圈直徑>20 mm，其中，五倍子抑菌和殺菌作用最強（MIC和MBC均為1.95 mg/mL）；地榆次之，MIC為1.95 mg/mL，MBC為3.91 mg/mL［21］。張恒橋等發(fā)現(xiàn)，五倍子、黃芩、地榆、訶子、黃連和蘇木等6種中草藥對昆明裂腹魚（Schizothorax grahami）源維氏氣單胞菌的抑菌作用最強，抑菌圈直徑介于18～22 mm，其中，五倍子抑菌和殺菌效果最好（MIC和MBC分別為1.95 mg/mL和3.19 mg/mL）；訶子、蘇木、黃芩次之，均為3.19 mg/mL和7.81 mg/mL；黃連和地榆均為7.81 mg/mL和15.63 mg/mL［16］。本研究表明，72種中草藥中有22種中草藥對烏鱧源維氏氣單胞菌具有明顯的抑菌作用（中等強度及以上），其中，對10株菌均有抑菌效果的中草藥有6種，分別是訶子、酒萸肉、五倍子、烏梅、地錦草和五味子，且均具有中等強度或以上的抑菌作用；6種中草藥的MIC和MBC結果表明，MIC≤62.5 mg/mL，在所有MIC中的占比為85%；MBC≤125 mg/mL，在所有MBC中的占比為90%；有些中草藥對個別菌株也表現(xiàn)出了較好的抑菌效果，如地榆對菌株12和菌株C的抑菌圈直徑分別為19 mm和18 mm；丁香對菌株C的抑菌圈大小為19 mm，也具有中等強度的抑菌作用。通過比較6種中草藥對同一菌株的MIC和MBC，發(fā)現(xiàn)兩者間的數(shù)值相同或呈二倍關系，原因可能是中草藥水提液較為渾濁，而肉眼觀察其透明度會存在一定誤差。

中草藥體外抑菌的試驗方法借鑒于抗生素敏感試驗方法，該方法研究抑菌效果的同時，也帶來諸多問題［22］。中草藥定性試驗采用瓊脂擴散法可簡單、快速地篩選出具有抑菌效果的中草藥，但準確度不高，存在人為因素導致的誤差。中草藥定量試驗采用稀釋法雖可測定中草藥對細菌的MIC和MBC，獲得最基本的藥效學數(shù)據(jù)，但中草藥的有效成分復雜，主要是通過調節(jié)機體平衡、增強免疫力來治療疾病，因此，往往會出現(xiàn)體外抑菌效果差的中草藥，在體內卻能發(fā)揮較好的抑菌作用［23］。因此，本研究將定性和定量試驗相結合，盡可能全面評估不同單方中草藥的抑菌效果。本研究中的訶子、五倍子、烏梅和五味子在上述研究中均有提到，表明這些中草藥的抑菌效果較強、抗菌譜廣。本研究通過定性方法從《水產養(yǎng)殖用藥明白紙2022年2號》篩選出具有抑菌效果的中草藥，均可進一步用于魚體研究，對尋找具有良好藥效的中草藥及研究中草藥組方合劑具有重要的研究價值，旨在為防治維氏氣單胞菌引起的水產動物疾病提供參考。

3.3 不同菌株對中草藥的敏感程度

在實際的生產實踐中，引起水產養(yǎng)殖動物暴發(fā)疾病的病原菌的不同分離株對中草藥的敏感程度也會存在差異［24-25］，因此，研究中草藥對同一細菌不同分離株的抑制效果，有助于篩選出抗菌譜廣的中草藥，對水產疫病的防控具有重要意義。在前期的研究中，在實驗室從患病魚體的不同部位及水體中分離出了10株不同的維氏氣單胞菌，抑菌試驗篩選出的6種中草藥對不同位置分離的維氏氣單胞菌均表現(xiàn)出了中等以上的抑菌效果。然而，同一種中草藥對不同分離株的抑菌效果仍存在較大差異。本研究結果顯示，魚體中分離菌株對中草藥的高度敏感率（56%）高于水體中分離的菌株（50%），其中，眼部分離株的高度敏感率（91.7%）顯著高于水體中分離株，并且水體中分離菌株的MIC和MBC與其他試驗組相比均處于最高值。在周光等的抗生素藥敏試驗中，外環(huán)境分離菌株的敏感率高于魚體分離的菌株［26］。本研究結果與之相反，原因可能是魚體內藥物使用造成的體內菌株耐藥性增加。目前，單方中草藥體外抑菌試驗多針對一種細菌的某一分離株或不同種類的多株細菌進行研究，而對同一種菌的不同分離株同時進行中草藥體外抑菌試驗的研究較少。

3.4 中草藥活性成分

隨著中草藥在水產動物疫病防控方面的應用越來越廣，進一步研究中草藥的作用機理將成為今后研究的重點。研究表明，中草藥的抑菌效果主要與其中的活性成分有關，其主要分為15大類：黃酮類、生物堿類、葡萄糖苷類、糖苷類、精油類、樹脂類、光敏色素類、有機酸類、氨基酸類、單寧類、蛋白質類、酶類、微量元素類、多糖類和礦物鹽類［27］。

訶子中含有酚類、黃酮類和有機酸類等活性成分［28］。Reddy等發(fā)現(xiàn)，訶子鞣酸可抑制脂多糖（LPS）誘導小鼠巨噬細胞產生的炎癥反應；訶子有效成分中的沒食子酸甲酯對志賀氏菌（Shigella）的最小抑菌濃度范圍為128～256 μg/mL、最小殺菌濃度為256～512 μg/mL，抑菌效果明顯［29-30］。本研究結果中，訶子對多數(shù)維氏氣單胞菌具有高等強度的抑菌作用，MIC和MBC范圍均在31.25～62.50 mg/mL 之間，表明訶子的抗菌譜廣，在實際應用中可適當調整訶子水提物的濃度，提高其中有效成分含量，達到預防和治療疾病的效果。

五倍子藥用范圍廣，其活性成分可以分為三萜類、黃酮類、精油類、有機酸類、類固醇類和木脂素類等6大類［31］。Wei等研究發(fā)現(xiàn)，五倍子中的沒食子單寧能夠通過抑制NF-κB信號來減少結腸炎癥［32］；鄭夢珍等從五倍子粗提物中分離出的五倍子活性組分均能顯著抑制無乳鏈球菌的生長［33］。五倍子常用于治療皮膚潰爛和腹瀉［34］。結合本研究結果發(fā)現(xiàn)，潰爛灶處分離的菌株12對五倍子高度敏感，且MIC（15.63 mg/mL）明顯低于其他試驗組，推測五倍子中的有效成分對引起潰爛病的細菌抑制作用強。

烏梅中含有大量的有機酸類、糖類和維生素類成分［35］。烏梅提取物中的咖啡酸、香豆酸和原兒茶酸等酚酸類活性物質可降低腸道的炎性反應［36］。烏梅醇提物能明顯抑制細菌和真菌的生長，其中，分離的有機酸對金黃色葡萄球菌（Streptococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）等細菌有顯著的抑制效果［37］。乙醇體積分數(shù)為95%、料液比（g ∶mL）為1 ∶25、超聲波提取時間60 min及提取頻率為 100 kHz 等條件下，烏梅有機酸的提取率最高（12.17%），對枯草桿菌（Bacillus subtilis）和大腸桿菌等具有顯著的抑制效果。本研究結果顯示，烏梅對魚體分離菌株的MIC和MBC在15.63～31.25 mg/mL 之間，抑菌和殺菌效果顯著高于其他5味中草藥，這與王寶屯等的研究結果［20］一致。推測與烏梅提取物中的有機酸含量有關。

五味子的活性物質主要有木脂類、三萜類、酚酸類、黃酮類和植物甾醇等［38］。五味子醇提取物能降低促炎癥細胞因子的分泌，增強抗氧化能力，達到抑制腸道炎癥反應的效果［39］；此外，五味子葉片提取物比果實提取物具有更好的抗氧化和抗菌活性，主要原因是葉片提取物中的酚酸含量更高［40］。地錦草中含有黃酮及其苷類、酚酸和鞣質類、萜類和生物堿類等化學成分［41］。地錦草中豐富的酚類化合物，可抑制NO和TNF-α產生而達到抗炎癥反應的效果［42］；其次，地錦草乙酸乙酯提取物中的木犀草素、槲皮素、山柰酚等主要活性物質可破壞金黃色葡萄球菌的細胞完整性及增加細胞膜的通透性，抑制生物膜的合成，從而達到抗菌的功效［43］。酒萸肉有生物堿類等多種活性物質［44］。酒萸肉的黃酮類、酚酸類和環(huán)烯醚萜類活性物質對細菌具有很強的抑制作用，抑菌效果會隨著沒食子酸和阿魏酸濃度的增加而增加［45-46］。本結果顯示，五味子、地錦草、酒萸肉的抑菌圈直徑多數(shù)在11～15 mm之間，MIC和MBC大多在62.5～125.0 mg/mL之間，與其他3味中草藥相比，抑菌效果較差，但它們發(fā)揮抗炎和抑菌作用均與酚酸類活性成分有一定關系。

綜上所述，本研究中篩選出的6種中草藥對烏鱧源維氏氣單胞菌均有中度以上的抑菌效果，綜合以往研究結果，6種中草藥的提取物均有降低炎性反應的作用且6種中草藥的抑菌效果多由酚類化合物的含量決定，因此，推測這6種中草藥對維氏氣單胞菌產生抑菌效果可能與其對炎癥的抑制效果有關，以及推測酚類化合物可能是抑制維氏氣單胞菌的重要活性成分之一。

4 結論

從72種中草藥中篩選出25種對烏鱧源維氏氣單胞菌具有抑菌作用的中草藥；其中，訶子、地錦草、五倍子、烏梅、酒萸肉和五味子對10株維氏氣單胞菌均表現(xiàn)出較強的抑菌和殺菌活性，表明訶子等6種單方中草藥可作為防控維氏氣單胞菌的用藥參考。

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