麥洼牦牛糞便纖維素降解菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

姜立春 付丹陽 趙欣悅 蔣道玉 張雨潔 宋晚晴

姜立春，付丹陽，趙欣悅，等. 麥洼牦牛糞便纖維素降解菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（7）：223-230.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.030

（綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽 621000）

摘要：為從麥洼牦牛糞便中篩選出具有高纖維素降解能力的菌株，通過羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，再利用濾紙條崩解和剛果紅平板透明圈試驗(yàn)進(jìn)行初篩，將獲得的菌株使用DNS法測定CMC酶活力進(jìn)行復(fù)篩。根據(jù)菌體形態(tài)學(xué)觀察及16S rRNA序列測定及序列同源性比較結(jié)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定該菌分類地位。結(jié)果表明，從麥洼牦牛糞便中篩選出1株酶活性為11.88 U/mL的纖維素酶產(chǎn)生菌株，經(jīng)菌種初步鑒定該菌為溶桿菌屬，命名為Lysobacter sp. MY16。以菌株MY16發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：最適碳源蔗糖（50 g/L），最適氮源尿素（7 g/L）為基礎(chǔ)，對其培養(yǎng)條件采用Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)合Box-Benhnken試驗(yàn)響應(yīng)面法分析，得出培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果為溫度41 ℃、接種量8.1%、時(shí)間21 h。在最適條件下，培養(yǎng)CMCase活性為36.12 U/mL，比優(yōu)化前提高了2.04倍。綜上可知，本研究篩選出了1株具有高CMC酶活性的菌株MY16，可為纖維素的生物高值轉(zhuǎn)化提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌；牦牛糞便；纖維素酶；單因素法；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號(hào)：1002-1302（2024）07-0223-08

纖維素是一種非常豐富的資源，廣泛存在于秸稈和畜禽類糞便等農(nóng)業(yè)廢棄物中。我國是世界上農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量最大的國家［1］，秸稈可用作肥料、燃料、飼料等，具有高利用價(jià)值。但由于焚燒占比大，每年秸稈損失氮素高達(dá)20萬t［2］。并且秸稈焚燒會(huì)對環(huán)境、社會(huì)及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)造成危害［3］。近年來養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，隨之而來的問題便是大量的畜禽糞便未得到資源化利用或無害化處理。未處理的糞污可形成有害物質(zhì)，污染環(huán)境、威脅人類健康；大量糞便占用土地，制約畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［4］。因此，纖維素高效、循環(huán)利用對于充分利用資源本身，甚至對于環(huán)境、社會(huì)等綜合效益均有非常重要的意義。

纖維素是一種呈鏈狀的高分子化合物，由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵聯(lián)結(jié)起來形成非常穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，水分子、化學(xué)試劑等難以進(jìn)入與之結(jié)合［5］，這些特點(diǎn)使纖維素很難被降解利用。在過去的科學(xué)研究中，有科學(xué)家曾采用酸、堿的化學(xué)處理法［6-7］和蒸汽加熱的物理處理法［8］來處理纖維素，相較于物理法和化學(xué)法而言，生物處理法因?yàn)榉磻?yīng)條件更溫和并且對環(huán)境無污染而被廣泛使用。

生物法常以自然界中篩選的高效降解纖維素菌株為基礎(chǔ)，而食草性動(dòng)物的消化系統(tǒng)及糞便因具有較多纖維素降解功能的菌群可作為優(yōu)質(zhì)菌源。張智等從大熊貓糞便中篩選得到1株需氧的纖維素降解菌，初步鑒定該菌株為Paenibacillus cookii LZ033［9］。何靜等從雙峰駝糞便中分離篩選得到1株能夠降解纖維素的纖維化纖維微菌（Cellulosimicrobium cellulans）［10］。牦牛（Bos grunniens），屬于牛亞科動(dòng)物，草食性反芻家畜，分布于青藏高原及其相鄰高寒地區(qū)。因牦牛生活在特殊的生態(tài)環(huán)境，對高原高寒少氧、降水少、日照短、輻射強(qiáng)等惡劣的環(huán)境條件有極高適應(yīng)性［11］，形成了耐粗飼的特性［12］。所以牦牛消化道及糞便中的微生物具有極高的研究價(jià)值。聶遠(yuǎn)洋等從不同年齡的牦牛大腸內(nèi)容物中分離到微需氧菌和厭氧菌共90株細(xì)菌［13］。繁萍等通過宏基因組法分析牦牛糞便中的物種DNA信息，共注釋物種數(shù)8 774種，其中，注釋細(xì)菌8 099個(gè)種［14］。本研究以麥洼牦牛糞便為菌源，擬篩選出1株纖維素酶活性較高的菌株，并從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)上進(jìn)行菌種鑒定。對該菌株培養(yǎng)基配方進(jìn)行單因素優(yōu)化，并在培養(yǎng)基配方優(yōu)化的基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman和最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)合Box-Benhnken及響應(yīng)面分析對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化產(chǎn)酶條件，提高產(chǎn)酶能力，為該菌株的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

試驗(yàn)樣品來自于四川省紅原縣天然牧場飼養(yǎng)的4歲齡健康麥洼牦牛的新鮮糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉瓊脂培養(yǎng)基（g/L）[JP]：CMC-Na 5.0 g、瓊脂17.0 g、KH2PO4 1.0 g、NaNO3 3.0 g、KCl 0.5 g、FeSO4 0.01 g（pH值5.5～6.0）［15］；牛肉膏蛋白胨（BPD）培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g、牛肉膏5.0 g、瓊脂18.0 g、蛋白胨10.0 g（pH值7.4～7.6）；濾紙培養(yǎng)基：蒸餾水1 L、濾紙條（1 cm×5 cm），酵母粉3.0 g、MgSO4 0.5 g、KH2PO4 1.0 g（pH值7.0～7.2）；種子培養(yǎng)基：蒸餾水1 L、NaCl 5.0 g、牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g（pH值7.1～7.3）；液體產(chǎn)酶鑒定培養(yǎng)基：蒸餾水1 L、蛋白胨10.0 g、NaCl 4.0 g[JP]、酵母膏5.0 g、KH2PO4 4.0 g、CMC-Na 10.0 g（pH值6.8～7.4）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素降解菌的分離

取1 g麥洼牦牛糞便至250 mL錐形瓶中，加入99 mL無菌蒸餾水，在30 ℃條件下振蕩10 min。取5 mL菌懸液加入 95 mL 的富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)3 d。將富集后的培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋至10-7～10-2。分別吸取 0.2 mL 10-7～10-4濃度梯度的稀釋液涂布至羧甲基纖維素鈉選擇培養(yǎng)基，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。選擇其中最適宜的稀釋濃度梯度繼續(xù)進(jìn)行多次純化培養(yǎng)，直至得到純化的單菌落。

1.2.2 降解菌的初篩

將純化后的菌落接種至羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）平板培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)3 d，待菌落生長完成后，測量菌落直徑（d）。覆蓋質(zhì)量濃度為1 mg/mL的剛果紅（CR）溶液，染色30 min后，倒去CR溶液，采用0.9% NaCl溶液沖洗2～3次，測量水解圈直徑（D）。計(jì)算D/d，菌株纖維素水解能力與該值呈正比［16］，選出比值較高的即纖維素水解能力強(qiáng)的菌株。把初步分離的菌株置于種子培養(yǎng)基中制成種子液，35 ℃搖床振蕩培養(yǎng)3 d后再分別接種于濾紙條培養(yǎng)基中，置于 30 ℃、130 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d，觀察并記錄濾紙的崩解情況，崩解程度越高說明菌株纖維素水解能力越強(qiáng)［17］。

1.2.3 降解菌的復(fù)篩

1.2.3.1 粗酶液的制備

將初篩得到的菌株分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃、130 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d后，離心20 min，除去培養(yǎng)基及菌體殘?jiān)占锨逡鹤鳛榇置敢?，用于CMCase的活性測定。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別加入不同濃度（0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/mL）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和DNS溶液2.0 mL于試管中，在100 ℃水浴中加熱5 min，把溶液冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10 mL，混合均勻，測定540 nm下的吸光度（D），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 酶活力測定

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，代入D值計(jì)算出葡萄糖濃度，再根據(jù)羧甲基纖維素酶（CMCsae）活性的測定參照標(biāo)準(zhǔn)QB 2583—2003［18］得出其CMC酶活性，選擇酶活性相對較高的菌種進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

將最終篩選出的菌株于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察菌株形態(tài)。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［19］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［20］，根據(jù)菌落形狀大小、顏色變化、表面狀況、邊緣是否光滑、菌落質(zhì)地軟硬、是否透明等判斷菌種類型。

1.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

使用試劑盒提取細(xì)菌的DNA，采用16S rDNA通用引物F27和R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測，將符合條件的PCR產(chǎn)物送至生物技術(shù)公司測序。測序完成后根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行同源性對比，通過MEGA 11.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.2.5 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

對培養(yǎng)基的碳源（果糖、蔗糖、微晶纖維素、淀粉、玉米粉CMC-Na、葡萄糖、麥芽糖、乳糖）和氮源（酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4、KNO3、NaNO3、玉米粉、尿素）采用單因素法測定其對CMCase活性的影響。其中，碳源和氮源質(zhì)量濃度范圍分別為20、30、40、50、60、70、80 g/L和1、3、5、7、9、12 g/L，分別測定CMC酶活性。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化

在上述單因素優(yōu)化培養(yǎng)基配方條件的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件對培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值這6個(gè)產(chǎn)酶影響因素進(jìn)行P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到對產(chǎn)酶培養(yǎng)條件影響顯著的因子。再通過爬坡實(shí)驗(yàn)確定顯著影響因子的中心范圍，以CMCase活性為優(yōu)化目標(biāo)根據(jù)B-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析，并使用模型推測和實(shí)際相結(jié)合的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，對模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

2.1.1 菌株初篩

以麥洼牦牛糞便為菌源，經(jīng)過富集培養(yǎng)與羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基的初步篩選，獲得16株能降解纖維素的菌株，命名為MY01～MY16。經(jīng)剛果紅染色法與濾紙條試驗(yàn)法進(jìn)一步判斷其是否具有產(chǎn)纖維素降解酶的能力及產(chǎn)酶能力大小。由表1可知，通過水解圈比值（D/d）大小得出16株纖維素降解菌均具有一定的纖維素降解能力，且2種不同的試驗(yàn)方法得出的結(jié)果具有較好相關(guān)性，總體上來說水解圈比值越大濾紙崩解情況越強(qiáng)。其中，菌株MY04、MY10、MY16對纖維素的作用較大，D/d>5且遠(yuǎn)大于其他菌株，在試驗(yàn)7 d后濾紙失去形狀或直接呈糊狀。

2.1.2 菌株復(fù)篩

為驗(yàn)證菌株產(chǎn)酶能力的準(zhǔn)確性，還需要對獲得的菌株使用DNS法測定CMC酶活性進(jìn)行復(fù)篩。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，得到回歸曲線方

程：y=0.04 383x+0.00 092（r2=0.99 902）。根據(jù)16株菌株的吸光度分別計(jì)算葡萄糖濃度，再測定其CMCase活性。由表2可知，其中，菌株MY04、MY10酶活力較高，MY16最高，為11.88 U/mL。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，選MY16菌株作為后續(xù)的研究對象。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株MY16在培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)菌落生長前期呈乳白色且形成較慢，菌落形成前后菌株開始快速生長，顏色加深并帶有乳黃色。菌落形態(tài)較小，表面圓滑潤濕、有突起，正反面顏色相同、稍透明，且質(zhì)地柔軟，與培養(yǎng)基結(jié)合不牢固，易被挑取。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

通過對菌株MY16的16S rDNA序列同源性比對，使用MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖1可知，菌株MY16的16S rDNA序列與溶桿菌屬的同源性為99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與溶桿菌屬的細(xì)菌并于一個(gè)分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，初步確定菌株MY16為溶桿菌，命名為Lysobacter sp. MY16。

2.3 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

以相同質(zhì)量濃度的9種不同碳源配制培養(yǎng)基，測定CMC酶活性。由圖2-a可知，在本次試驗(yàn)中當(dāng)以蔗糖為碳源時(shí)CMC酶活性達(dá)到最高，為12.35 U/mL。因此，選用蔗糖為最適碳源。

以不同濃度的蔗糖為碳源發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵后菌液中的CMC酶活性。由圖2-b可知，當(dāng)蔗糖濃度為20 g/L時(shí)，CMC酶活性為4.38 U/mL。當(dāng)蔗糖濃度為70 g/L時(shí)，CMC酶活性為14.27 U/mL，達(dá)最大值。在這之間酶活力隨著蔗糖濃度的逐漸增大而呈波浪式上升。其濃度為80 g/L時(shí)，CMCase活性為11.35 U/mL?？紤]到所用培養(yǎng)菌種為細(xì)菌，碳源濃度過高可能導(dǎo)致培養(yǎng)基過于黏稠，不利于菌種生長，且在50 g/L時(shí)，酶活力也達(dá)到了小高峰。因此，最適蔗糖濃度為50 g/L。

以相同質(zhì)量濃度的9種不同氮源配制培養(yǎng)基，測定CMC酶活性。由圖2-c可知，當(dāng)以尿素為氮源時(shí)CMCase活性達(dá)到最高，為14.72 U/mL。因此，選用尿素為最適碳源。

以不同濃度的尿素為碳源發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵后菌液中的CMC酶活性。由圖2-d可知，當(dāng)尿素濃度為1 g/L時(shí)，CMCase[JP2]活性為15.95 U/mL，其濃度為 7 g/L 時(shí)的CMCase活性為23.89 U/mL，且為最大值，酶活性上升趨勢較為平緩，其濃度超過7 g/L后CMCase活性緩慢下降，前后變化趨勢相似，整個(gè)圖像為鐘罩形。因此，選用最適氮源濃度為7 g/L。

2.4 培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 Plackett-Burman試驗(yàn)

利用Design-Expert（8.0）軟件對培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值這6個(gè)酶活性的影響因素進(jìn)行P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3）。對模型方差進(jìn)行分析，得到影響力的顯著性排序（表4）。數(shù)據(jù)分析得到該菌株CMC酶活性的多元一次方程為：CMCase活性=26.54+1.58X1+2.09X2-0.33X3+0.42X4+1.77X5-0.16X6。該模型的R2=0.953 1，說明模型的相關(guān)性良好，得到的數(shù)據(jù)可靠。由表4可知，影響CMC酶活性的關(guān)鍵因素的顯著性順序?yàn)閄2（接種量）>X5（培養(yǎng)時(shí)間）>X1（培養(yǎng)溫度）>X4（初始pH值）>X3（裝液量）>X6（轉(zhuǎn)速）。其中，X1（培養(yǎng)溫度）、X2（接種量）和X5（培養(yǎng)時(shí)間）為極顯著影響因素（P<0.01），所以確定其為進(jìn)一步優(yōu)化的關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.4.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

為確定對產(chǎn)酶影響極顯著的3個(gè)因子的試驗(yàn)最大響應(yīng)值所在區(qū)域，逐步增大這3個(gè)因素的試驗(yàn)水平，采用最陡爬坡路徑方法，將溫度（A）、接種量（B）和時(shí)間（C）分別設(shè)置為30～50 ℃、6%～10%、16～24 h，以CMC酶活性作為判定指標(biāo)。各顯著因素的變化方向和試驗(yàn)結(jié)果，由表5可知， 試驗(yàn)號(hào)為2、3、4處理對應(yīng)的酶活性最高，可達(dá)33.98 U/mL。綜上所述，溫度、接種量和時(shí)間最適范圍分別為35～45 ℃、7%～9%、18～22 h。

2.4.3 Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

通過對PB試驗(yàn)結(jié)果與最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的充分分析，在逼近最大響應(yīng)的區(qū)域內(nèi)，以溫度（35～45 ℃）、接種量（7%～9%）和時(shí)間（18～22 h）為自變量、CMCase活性為響應(yīng)值進(jìn)行B-B響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。由試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（表6）可知，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合分析，得到影響CMCase活性的回歸方程為：CMCase酶活力=34.95+0.90A+0.84B+2.30C+0.06AB+0.43AC+0.23BC-2.55A2-4.00B2-3.28C2。

對模型回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。失擬項(xiàng)F=0.98>0.05（不顯著），P<0.000 1（極顯著水平）。[JP2]根據(jù)回歸方程的決定系數(shù)R2=0.987 7>[JP]0.9和校正系數(shù)R2Adj=0.971 9>0.9，可知98%數(shù)據(jù)的可變性可用此模型來解釋，并且預(yù)測值與實(shí)際值間的相關(guān)性較好。綜上所述，該回歸模型具有較好的擬合效果，用來確定最適產(chǎn)酶條件是可靠的。分析回歸模型可發(fā)現(xiàn)，交互項(xiàng)AB、AC、BC對CMCase活性的影響不顯著，而一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對CMCase活性均有極顯著影響（P<0.01）。由圖3可知，由多元二次回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖及其等高線，可直觀地觀察各因素間對CMC酶活性的交互影響作用，由圖3可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，A、B、C存在極大值點(diǎn)。利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸模型的優(yōu)化分析，得到最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)為（41.05、8.12、20.74），即培養(yǎng)溫度為41.05 ℃、接種量為8.12%、培養(yǎng)時(shí)間為20.74 h。在此點(diǎn)預(yù)測的CMCase活性可達(dá)35.513 9 U/mL。為驗(yàn)證以上結(jié)果，結(jié)合實(shí)際情況把培養(yǎng)條件優(yōu)化為41 ℃、8.1%、21 h，[JP2]在最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方和最適產(chǎn)酶培養(yǎng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，測得CMC酶活性為36.12 U/mL，[JP]與預(yù)測值相近，并且比優(yōu)化前提高了2.04倍。

3 討論與結(jié)論

采用生物法對纖維素進(jìn)行高值轉(zhuǎn)化可推進(jìn)資源的合理利用，對農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義［21］。國內(nèi)外對纖維素降解微生物的研究正在不斷深入完善，食草動(dòng)物由于其食性特點(diǎn)，其消化系統(tǒng)及糞便是纖維素降解菌的優(yōu)質(zhì)菌株來源。牦牛作為一種在青藏高原上生長的食草動(dòng)物，具有抵御惡劣環(huán)境及耐粗飼的特性。毛婷等從天祝牦牛的糞便中分離篩選出1株降解玉米秸稈的Bacillus pumilus菌株［22］。本研究以麥洼牦牛糞便為菌源，通過初篩復(fù)篩，篩選出了1株纖維素降解能力較高的菌株，命名為MY16，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，可初步確定MY16菌株為溶桿菌屬。

楊波等從鹿糞中篩選出了纖維素降解細(xì)菌A27和A36，其CMCase[JP]活性分別為0.158、0.042 U/mL［23］。崔登雪篩選分離了1株為枯草芽胞桿菌Bacillus subtils的菌株JK7，其纖維素酶活性最高可達(dá) 12.16 U/mL［24］。兩者相對來說纖維素酶活較低且差別較大，除了酶活性計(jì)算方法可能存在差異，還在于菌株自身的降解能力不同及產(chǎn)酶條件等尚需進(jìn)一步優(yōu)化。對產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化，通常采用的是單因素法。曾文婷等從竹鼠腸道中分離鑒定出了1株名為枯草芽孢桿菌GL-4的纖維素降解菌，并對其培養(yǎng)條件采用了單因素優(yōu)化法，得出其FPAase活性在溫度37 ℃、pH值8.0、時(shí)間 24 h 的培養(yǎng)條件時(shí)最高［25］。但單因素法僅能分析單一條件對酶活力的影響，不能考察多個(gè)條件間旳交互作用，而響應(yīng)面分析法能同時(shí)評價(jià)影響過程的各因素水平及其交互作用從而對過程進(jìn)行優(yōu)化。本研究在對MY16菌株進(jìn)行培養(yǎng)基單因素優(yōu)化的條件下，采用P-B試驗(yàn)篩選出影響其產(chǎn)酶條件的3個(gè)顯著性因素，再用最陡爬坡試驗(yàn)法確定其最適濃度范圍，最后對MY16菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件采用 B-B 響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化。確定菌株MY16的最佳培養(yǎng)條件為溫度41 ℃、接種量8.1%、時(shí)間 21 h，在最適培養(yǎng)基配方和最適培養(yǎng)條件下，CMCase活性可達(dá)36.12 U/mL，與優(yōu)化前相比，提高了2.04倍。與郭曉杰的試驗(yàn)結(jié)果［26］相比較，本研究的酶活力優(yōu)化效果更為明顯。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了主要有細(xì)菌、放線菌和真菌這3種類別的具有纖維素分解能力的微生物［27］。其中，細(xì)菌擁有生長速度快、耐酸堿程度高、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，使其在纖維素降解的應(yīng)用上擁有巨大的應(yīng)用潛力［28］。本研究篩選出了1株Lysobacter sp. MY16（纖維素分解溶桿菌MY16），為纖維素降解微生物提供了更廣闊的選擇。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過誘變育種的方式提高產(chǎn)酶能力的方法已日漸運(yùn)用到菌種選育工作中。在今后的研究中，將采用誘變育種的方法對菌株進(jìn)行改良，以期為農(nóng)業(yè)廢棄物中纖維素的降解提供更優(yōu)質(zhì)的菌種。

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基金項(xiàng)目：四川省阿壩藏族羌族自治州應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)資金（編號(hào)：19YYJSYJ0031）；四川省綿陽市應(yīng)用基礎(chǔ)研發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：17YFNY007）。

作者簡介：姜立春（1977—），男，吉林梨樹人，博士，教授，主要從事應(yīng)用微生物方面研究。E-mail：jiang_lichun@126.com。