煙草鐮刀菌根腐病病原生物學(xué)特性及其優(yōu)勢(shì)種的代謝表型特征

黃玉鳳 李菲 汪漢成 蔡劉體 陳興江 邱學(xué)柏

黃玉鳳，李 菲，汪漢成，等. 煙草鐮刀菌根腐病病原生物學(xué)特性及其優(yōu)勢(shì)種的代謝表型特征［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（7）：124-132.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.017

（1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550001；2. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州貴陽(yáng) 550081）

摘要：為明確煙草鐮刀菌根腐?。╰obacco Fusarium root rot）病原生物學(xué)特性和代謝表型特征，采用菌絲生長(zhǎng)速率法和活體接種法分別測(cè)定了3種煙草鐮刀菌根腐病病原［腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、木賊鐮刀菌（Fusarium solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）］在不同溫度、光照條件下的生長(zhǎng)速率和致病力，同時(shí)采用Biolog代謝表型技術(shù)測(cè)定其優(yōu)勢(shì)種腐皮鐮刀菌的碳氮源、滲透壓和pH值下的代謝表型。結(jié)果表明，3種病原菌菌絲生長(zhǎng)適宜溫度均為25～30 ℃，木賊鐮刀菌M417菌絲生長(zhǎng)速率最快，可達(dá)10.71 mm/d；腐皮鐮刀菌F421產(chǎn)孢量最高，可達(dá)9.15×10.6 個(gè)/cm2；連續(xù)黑暗條件均有利于菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。尖孢鐮刀菌J419和腐皮鐮刀菌F503致病力較強(qiáng)，7 d時(shí)的病斑面積分別為1.05 cm2和1.35 cm2。代謝表型結(jié)果表明，腐皮鐮刀菌碳氮源代謝能力強(qiáng)，可高效代謝丙三醇、D-甘露醇、D-松二糖等54種碳源，以及L-鳥(niǎo)氨酸a-氨基-N-戊酸、L-鳥(niǎo)氨酸等大部分氮源；其pH值適應(yīng)范圍為3.5～8.5，最適pH值為6，表現(xiàn)出強(qiáng)脫羧酶活性和弱脫氨酶活性；在1%～5.5% NaCl、5%～10%乙二醇、1%甲酸鈉、2%～3%尿素、7%～9%乳酸鈉、10～50 mmol/L硫酸銨（pH值=8）、10～100 mmol/L硝酸鈉、10～40 mmol/L亞硝酸鈉等環(huán)境下均可正常生長(zhǎng)。研究結(jié)果揭示了3種鐮刀菌屬根腐病病原的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)種腐皮鐮刀菌的營(yíng)養(yǎng)需求廣、具有較強(qiáng)的滲透壓和pH值環(huán)境適應(yīng)能力，為鐮刀菌根腐病災(zāi)變規(guī)律的研究提供了參考。

關(guān)鍵詞：煙草根腐??；鐮刀菌屬；生物學(xué)特性；代謝表型

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號(hào)：1002-1302（2024）07-0124-09

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，被廣泛種植并用于生產(chǎn)香煙、雪茄等煙草制品［1］。然而，煙草種植過(guò)程中常常受到多種病害的威脅，其中一種真菌性土傳病害——鐮刀菌根腐病（tobacco Fusarium root rot）較為常見(jiàn)［2］。該病害由鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌侵染引起，被報(bào)道的致病菌有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）等［3-4］。該病主要發(fā)生于煙草大田期，典型癥狀有煙株矮小、底部葉片葉尖黃化蜷縮焦干。近年來(lái)，隨著氣候條件與種植方式的變化，該病害在我國(guó)貴州煙區(qū)的發(fā)生范圍及危害程度呈現(xiàn)上升、加重趨勢(shì)，給煙農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［5］，亟須對(duì)其病原的生物學(xué)特性加強(qiáng)研究，以期掌握該病害的災(zāi)變規(guī)律。

溫度、光照等環(huán)境因子影響著植物病原菌的生長(zhǎng)［6］。已有少量煙草根腐病病原菌生物學(xué)特性的報(bào)道，趙杰研究表明，煙草根腐病病原尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌在10～35 ℃溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃［7］。陳高航對(duì)煙草尖孢鐮刀菌研究發(fā)現(xiàn)，其致死溫度為60 ℃，且環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)［8］。汪漢成等研究發(fā)現(xiàn)，煙草腐爛病病原菌九州鐮刀菌（F. kyushuense）在完全黑暗、完全光照、光暗交替環(huán)境下菌絲生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異［9］。此外，碳氮源營(yíng)養(yǎng)、滲透壓等環(huán)境因子也影響著病原菌的生物活性，病原菌對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)因子的代謝表型特征可反映其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力。文增葉等研究發(fā)現(xiàn)，三七根腐病病原尖孢鐮刀菌可有效利用淀粉、乳糖等多種碳源和硝酸銨等氮源［10］。楊靜美等研究發(fā)現(xiàn)，番木瓜腐皮鐮刀菌（Fusarium solani f. sp. glycine）在pH值 3～10范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，最適pH值為7～10［11］。相較而言，作為嚴(yán)重危害煙葉生產(chǎn)的根腐病，其病原菌的生物學(xué)特性和環(huán)境適應(yīng)力卻缺乏了解。

為此，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定鐮刀菌根腐病病原在不同溫度、光照條件下的生長(zhǎng)速率，利用活體接種法測(cè)定不同種的致病力，同時(shí)采用Biolog代謝表型技術(shù)研究其在不同碳氮源、滲透壓和pH值下的代謝表型，旨在明確其生物學(xué)特性和環(huán)境適應(yīng)力，為煙草根腐病的災(zāi)變規(guī)律研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況及材料

試驗(yàn)于 2023年6—11月在貴州省貴陽(yáng)市觀(guān)山湖區(qū)貴州省煙草科學(xué)研究院進(jìn)行。煙草鐮刀菌根腐病病原腐皮鐮刀菌（F. solani）菌株F421、F506、F503，木賊鐮刀菌（F. equiseti）菌株M417、M423、M16，尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）菌株J419、J3、J210，均由貴州省煙草科學(xué)研究院真菌實(shí)驗(yàn)室提供。供試煙草品種為云煙87，待煙葉長(zhǎng)至7～8葉時(shí)備用。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L；燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基：燕麥片30 g、瓊脂17 g、蒸餾水 1 L；烷基酯瓊脂培養(yǎng)基（AEA）培養(yǎng)基：酵母提取粉5 g、瓊脂20 g、丙三醇20 mL、硝酸鈉6 g、磷酸氫二鉀1.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.25 g；綠豆湯培養(yǎng)基：新鮮綠豆20 g，洗凈，放入1 000 mL純凈水中煮沸20 min，過(guò)濾去除豆渣，濾液加水補(bǔ)足1 000 mL，加入瓊脂粉20 g，攪拌均勻，分裝，121 ℃濕熱滅菌20 min。

Biolog代謝板FF（貨號(hào)：94545）、PM3（貨號(hào)：12121）、PM9（貨號(hào)：12161）、PM10（貨號(hào)：12162）和接種液FF-IF（filamentous fungi-inoculating fluid）（貨號(hào)：72106），均由美國(guó)Biolog公司生產(chǎn)；D-葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鈉等，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；酵母氮源，購(gòu)自美國(guó)Difco公司；Omnilog PM高通量微生物細(xì)胞表型芯片測(cè)定系統(tǒng)，由美國(guó)Biolog公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 煙草鐮刀菌根腐病病原的生物學(xué)特性 （1）溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響：用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌在不同溫度范圍的菌絲生長(zhǎng)速率。用直徑6 mm打孔器制取培養(yǎng)7 d的根腐病菌菌碟，置于PDA培養(yǎng)基上，于5、10、15、20、25、30、35 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)，接種7 d后采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算生長(zhǎng)速率。平板測(cè)定完后，用10 mL無(wú)菌水洗滌平板，制成孢子懸浮液，在顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定單位面積（cm2）的產(chǎn)孢量。（2）光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響：采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同光照條件下菌絲生長(zhǎng)速率。使用無(wú)菌打孔器在PDA培養(yǎng)基上制取直徑為6 mm的培養(yǎng)7 d的根腐病菌菌碟，將其接種到新的PDA培養(yǎng)基中，置于溫度均為28 ℃、光照條件分別為連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、光—暗周期為12 h—12 h的生化培養(yǎng)箱，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，接種 7 d 后采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算生長(zhǎng)速率。隨后用10 mL無(wú)菌水洗滌平板，制成孢子懸浮液，在顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定單位面積（cm2）的產(chǎn)孢量。（3）菌絲致死溫度的測(cè)定：隨機(jī)選取3株菌株（尖孢鐮刀菌J419、腐皮鐮刀菌F503、木賊鐮刀菌M16）進(jìn)行菌絲致死溫度測(cè)定。在PDA培養(yǎng)基上制取直徑為6 mm的菌碟，將其置于盛有 5 mL 滅菌水的無(wú)菌試管中，分別置于35、40、45、50、55 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，同時(shí)緩慢搖動(dòng)試管使之受熱均勻，取出試管冷卻至室溫，將處理后的菌餅接種到PDA平板中央，并置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，6 d后觀(guān)察菌絲生長(zhǎng)情況以確定致死溫度范圍。每個(gè)處理重復(fù)3次。（4）不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：參照上述方法制備腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌直徑6 mm 的菌碟，分別置于PDA、OA、AEA、綠豆湯培養(yǎng)基上，接菌后所有平板均置于溫度為28 ℃黑暗條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次，7 d后測(cè)量菌落直徑。

1.2.2 煙草鐮刀菌根腐病病原的致病力測(cè)定 隨機(jī)選取尖孢鐮刀菌菌株J419、腐皮鐮刀菌菌株F503、木賊鐮刀菌菌株M16進(jìn)行病原菌致病力測(cè)定。煙草莖部和根部的致病力測(cè)定參照畢武等的方法［12］，葉部致病力的測(cè)定參照汪漢成等的方法［8］。將6 mm菌餅分別接種到刺傷和無(wú)刺傷的煙苗組織上，接種后菌碟和煙株組織采用浸有無(wú)菌水的脫脂棉保濕，隨后放在28 ℃黑暗條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)，對(duì)照組接種無(wú)菌絲的PDA菌碟。接種7 d后，采用“十字交叉法”測(cè)量病斑直徑，每個(gè)菌株重復(fù)3次。

1.2.3 代謝表型測(cè)定 由“1.2.1”節(jié)測(cè)定結(jié)果可知腐皮鐮刀菌F421產(chǎn)孢能力較強(qiáng)，選擇此菌株進(jìn)行測(cè)定。使用Biolog系統(tǒng)測(cè)定其代謝表型。將煙草根腐病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃、[JP2]黑暗條件下培養(yǎng)7 d，至產(chǎn)生大量分生孢子。無(wú)菌棉簽蘸用FF接種液（FF-IF）浸濕，在菌落表面旋轉(zhuǎn)，接著將棉簽浸入20 mL的 FF-IF[JP]接種液中制備1×10.5 個(gè)/mL的孢子懸浮液。碳源代謝表型測(cè)定：將孢子懸浮液依次加入FF代謝板微孔中（100 μL/孔）；氮源代謝表型測(cè)定：取10.025 mL孢子懸浮液、D-葡萄糖溶液0.375 mL、酵母氮源溶液1 mL與無(wú)菌水0.6 mL均勻混合加入到PM3代謝板中；滲透壓和pH值環(huán)境下代謝表型測(cè)定：取孢子懸浮液20.05 mL、D-葡萄糖溶液0.75 mL、 酵母氮源溶液2 mL、無(wú)菌水 1.2 mL 均勻混合，加入PM9和PM10代謝板中；按照Biolog PM微生物細(xì)胞表型流程將各測(cè)定板放于Biolog 培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)，設(shè)置 OmniLog 工作軟件，每15 min收集1次數(shù)據(jù)。根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，分析其代謝表型特征。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 2010和SPSS 24.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用LSD（least significant difference）法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草鐮刀菌根腐病病原的生物學(xué)特性[HT]

2.1.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響 在不同溫度下，腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)速率各不相同，且存在顯著性差異。在5～30 ℃ 條件下，所測(cè)尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和木賊鐮刀菌菌株均能生長(zhǎng)。隨著溫度的升高，菌絲生長(zhǎng)速率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。在25～30 ℃時(shí)，9株菌株的菌絲生長(zhǎng)速度均較快。在25 ℃時(shí)，木賊鐮刀菌M16、木賊鐮刀菌M423、腐皮鐮刀菌F421、尖孢鐮刀菌J210的菌絲生長(zhǎng)速率較快，分別為7.07、10.45、8.43、10.00 mm/d；在30 ℃時(shí)，木賊鐮刀菌M417、腐皮鐮刀菌F506、腐皮鐮刀菌F503、尖孢鐮刀菌J419、尖孢鐮刀菌J3的菌絲生長(zhǎng)速率最快，分別達(dá)到10.71、9.78、8.90、8.64、6.67 mm/d。25 ℃和30 ℃的生長(zhǎng)速度顯著高于其他溫度處理（P<0.05）（圖1-A）。9株菌株菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為25～30 ℃，低于15 ℃或高于30 ℃菌絲生長(zhǎng)緩慢。

2.1.2 溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響 在不同溫度下，煙草鐮刀菌屬根腐病菌產(chǎn)孢量之間存在差異。隨著溫度升高，腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。在15～35 ℃溫度范圍內(nèi)均可產(chǎn)孢，在25～30 ℃ 時(shí)產(chǎn)孢量最多。在25 ℃時(shí)，木賊鐮刀菌M423、尖孢鐮刀菌J419、尖孢鐮刀菌J210產(chǎn)孢量最多，分別為7.45×10.6、5.33×10.6、4.95×10.6 個(gè)/cm2；在30 ℃時(shí)，腐皮鐮刀菌F421、腐皮鐮刀菌F506產(chǎn)孢量最多，分別為 8.65×106、7.40×10.6個(gè)/cm2；而腐皮鐮刀菌F503、尖孢鐮刀菌J3、木賊鐮刀菌M16、木賊鐮刀菌M417在這2個(gè)溫度范圍內(nèi)的產(chǎn)孢量無(wú)顯著性差異。在35 ℃，產(chǎn)孢量呈下降趨勢(shì)，尖孢鐮刀菌J3、尖孢鐮刀菌J419、木賊鐮刀菌M16、木賊鐮刀菌M417、木賊鐮刀菌M423在此溫度范圍不產(chǎn)孢（圖1-B）?？傊?，9株鐮刀菌產(chǎn)孢的適宜溫度為25～30 ℃，低于 15 ℃ 或高于30 ℃時(shí)產(chǎn)孢量少甚至不產(chǎn)孢。

2.1.3 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗和 12 h—12 h光暗交替條件下，均可正常生長(zhǎng)。在3種光照條件下，木賊鐮刀菌M16在連續(xù)黑暗條件和12 h—12 h光暗交替條件下的菌絲生長(zhǎng)速率分別為4.45、4.33 mm/d，兩者之間無(wú)顯著性差異，但顯著高于連續(xù)光照條件；尖孢鐮刀菌J3在連續(xù)黑暗和連續(xù)光照條件下的菌絲生長(zhǎng)速率分別為4.18、4.02 mm/d，兩者之間無(wú)顯著性差異，但顯著高于 12 h—12 h光暗處理?xiàng)l件；尖孢鐮刀菌J210在連續(xù)光照條件和12 h—12 h光暗交替條件下的菌絲生長(zhǎng)速率分別為9.19、9.57 mm/d，兩者之間無(wú)顯著性差異，但顯著低于連續(xù)黑暗條件。在3種光照測(cè)試條件下，腐皮鐮刀菌F503的菌絲生長(zhǎng)速率范圍為4.07～4.76 mm/d，尖孢鐮刀菌J419的菌絲生長(zhǎng)速率為9.24～10.02 mm/d，相同菌種的不同菌株間均無(wú)顯著性差異；在黑暗條件下，木賊鐮刀菌M417、木賊鐮刀菌M423、腐皮鐮刀菌F421、腐皮鐮刀菌F506的菌絲生長(zhǎng)速率均最快，顯著高于其他2個(gè)光照條件處理（P<0.05，圖2-A）。因此，連續(xù)黑暗條件為腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的最適光照條件。

2.1.4 光照對(duì)產(chǎn)孢量的影響 在不同光照條件下，所有腐皮鐮刀菌、 木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌菌株均可產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量在不同光照條件下存在差異性。

由圖2-B可知，9株鐮刀菌屬根腐病菌在黑暗條件下的產(chǎn)孢量最多，例如腐皮鐮刀菌F421的產(chǎn)孢量為7.05×10.6個(gè)/cm2，尖孢鐮刀菌J3的產(chǎn)孢量為 4.88×10.6 個(gè)/cm2。連續(xù)光照條件下，產(chǎn)孢量均最少。為此，連續(xù)黑暗條件有利于腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌9株鐮刀菌的產(chǎn)孢。

2.1.5 菌絲的致死溫度 腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌在35、40 ℃水浴處理10 min后，重新置于28 ℃黑暗條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)均可生長(zhǎng)，而在45、50、55 ℃條件下水浴處理后不能生長(zhǎng)（表1）。為此，3株鐮刀菌的致死溫度均為45 ℃。

2.1.6 不同培養(yǎng)基對(duì)鐮刀菌屬根腐病病原菌絲生長(zhǎng)速率的影響 結(jié)果表明，在PDA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)

基、AEA培養(yǎng)基、綠豆湯培養(yǎng)基上，腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)速率存在差異（表2）。在相同條件下，木賊鐮刀菌M16、尖孢鐮刀菌J210、腐皮鐮刀菌F506在A(yíng)EA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率最大，分別為10.19、11.36、10.07 mm/d，OA培養(yǎng)基和綠豆湯培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)速率差異不顯著，而PDA培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)速率最慢。尖孢鐮刀菌J3和腐皮鐮刀菌F503在A(yíng)EA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率最快，分別為9.72、9.95 mm/d，在PDA培養(yǎng)基和綠豆湯培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異。木賊鐮刀菌M417在A(yíng)EA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率最大，達(dá)到11.09 mm/d，在OA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異。木賊鐮刀菌M423在PDA培養(yǎng)基、AEA培養(yǎng)基、綠豆湯培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率分別4.29、5.24、4.36 mm/d，三者之間無(wú)顯著性差異。尖孢鐮刀菌J419在A(yíng)EA培養(yǎng)基上和綠豆湯培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率分別為9.36、8.88 mm/d，兩者之間無(wú)顯著性差異。腐皮鐮刀菌F421在A(yíng)EA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率最大，達(dá)到10.21 mm/d，而在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率最小。為此，3種鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基均為AEA培養(yǎng)基。

2.2 煙草鐮刀菌根腐病病原的致病力

致病力試驗(yàn)結(jié)果表明，3株腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌菌株刺傷、無(wú)刺傷接種，煙草葉片7 d后均出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，且刺傷接種的尖孢鐮刀菌J419、腐皮鐮刀菌F506的致病力較強(qiáng)，病斑面積分別為1.35 cm2和1.05 cm2；木賊鐮刀菌M16的致病力較弱。3菌種在葉部均形成褐色病斑，病斑周?chē)悬S褐色暈圈，3個(gè)種在葉片上的致病力強(qiáng)弱順序依次為尖孢鐮刀菌>腐皮鐮刀菌>木賊鐮刀菌。腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌在接種莖部后，莖部均出現(xiàn)白色菌絲體，隨后病斑逐漸擴(kuò)大直至整株死亡，3個(gè)種在莖上的致病力強(qiáng)弱順序依次為尖孢鐮刀菌>腐皮鐮刀菌>木賊鐮刀菌。根部接種3種病原菌后，煙株葉部均發(fā)現(xiàn)不同程度的萎蔫黃化，根系破碎，須根減少（圖3）。

2.3 腐皮鐮刀菌的代謝表型特征

2.3.1 碳源代謝表型 由圖4可見(jiàn)，腐皮鐮刀菌對(duì)Biolog FF板上的所有碳源都能代謝，不同碳源間的代謝強(qiáng)度存在差異。其中可高效代謝的碳源約有54種，包括D-阿拉伯糖醇、丙三醇、D-甘露醇、D-松二糖、L-焦谷氨酸等，但對(duì)α-D-乳糖、γ-羥基丁酸等5種碳源的代謝能力相對(duì)較弱。

2.3.2 氮源代謝表型 由圖4可見(jiàn)，腐皮鐮刀菌對(duì)Biolog PM3板上的所有氮源都能代謝。其中，能夠高效代謝的氮源包括Met-Ala、α-氨基-N-戊酸、L-鳥(niǎo)氨酸等6種氮源；對(duì)8種氮源的代謝能力相對(duì)較弱，包括羥胺、甲胺、正戊胺、e-氨基-N-己酸、谷胱甘肽等；相較而言，腐皮鐮刀菌對(duì)谷胱甘肽的利用能力最弱。

2.3.3 滲透壓和pH值代謝表型特征 由圖5可知，腐皮鐮刀菌具有較強(qiáng)的滲透壓適應(yīng)能力，可代謝10～40 mmol/L 亞硝酸鈉、1%～ 5.5% 硫酸鈉、1%甲酸鈉、1%和7%～9%的乳酸鈉、5%～10% 乙二醇、2%～3%的尿素、10～100 mmol/L 硝酸鈉、10～40 mmol/L 亞硝酸鈉，而對(duì)6.5%、8%的氯化鈉、20～200 mmol/L 苯甲酸鈉（pH值5.2）、60～80 mmol/L 亞硝酸鈉、7%的尿素的代謝較弱。在6% 氯化鈉與不同滲透壓物質(zhì)協(xié)同下，腐皮鐮刀可代謝滲透壓物質(zhì)，但對(duì)甜菜堿、四氫嘧啶、肌酸、γ-氨基-N-丁酸的代謝較弱。腐皮鐮刀菌可進(jìn)行代謝的pH值范圍為3.5～8.5，最適pH值為6。當(dāng)pH值 4.5脅迫與不同氨基酸混合時(shí)，腐皮鐮刀菌可高效代謝大部分基質(zhì)，例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-組氨酸、L-天門(mén)冬酰胺等，但不能代謝鄰氨基苯甲酸。當(dāng)pH值 9.5脅迫與不同氨基酸混合時(shí)，腐皮鐮刀菌可代謝大部分基質(zhì)，如L-谷氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸、腐胺、胍基丁胺、酪胺等，而對(duì)L-酪氨酸的代謝較弱。此外，還可高效代謝X-β-D-氨基葡萄糖苷、X-β-D-氨基半乳糖苷、X-氨基磷酸酶、X-芳基硫酸酯酶、X-SO4等基質(zhì)。在pH值分別為4.5和95的不同氨基酸脅迫下，分別測(cè)定了B1～D12和E1～G12孔中PM10的脫羧酶和脫氨酶活性。結(jié)果反映該病原菌的脫羧酶活性較高，但脫氨酶活性較差。

3 討論

煙草鐮刀菌根腐病是發(fā)生在煙草上的真菌性土傳病害，在我國(guó)各種植煙區(qū)均有發(fā)生，其危害于煙草根部，對(duì)煙草的經(jīng)濟(jì)效益造成重大損失［13-14］。溫度和光照條件能顯著影響病原菌的生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌在 10～35 ℃條件下均可生長(zhǎng)，25～30 ℃溫度范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速率最大、產(chǎn)孢量最多，這與趙杰報(bào)道的結(jié)果［7］基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)煙草鐮刀菌根腐病病原生長(zhǎng)的適溫范圍與同為煙草土傳病害的煙草黑脛病菌Phytophthora parasitica（21～35 ℃）［15］類(lèi)似，這可能是煙草田間病害鐮刀菌根腐病與黑脛病常常混發(fā)、難以防治的原因之一。汪漢成等報(bào)道九州鐮刀菌光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，光暗交替更利于其產(chǎn)孢［16］；而本研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌在黑暗條件下更利于菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，其差異可能是不同種鐮刀菌的生物學(xué)特性不同造成的。本研究發(fā)現(xiàn)煙草鐮刀菌屬根腐病病原尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌均可致煙草葉部、莖部和根部發(fā)病，結(jié)果與姚健等研究認(rèn)為的煙草根腐病病原菌尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌可致煙草發(fā)病的結(jié)論［17］一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果的可靠性。王立國(guó)等研究報(bào)道，廣金錢(qián)草根腐病病原腐皮鐮刀菌在PDA和OA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)差異不顯著［18］，而本研究發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌菌絲在OA培養(yǎng)基上比PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更快，說(shuō)明同種菌菌株間在不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度間存在差異。

營(yíng)養(yǎng)元素是病原菌生長(zhǎng)的必要條件，碳源和氮源的利用是其生長(zhǎng)最重要的兩大營(yíng)養(yǎng)元素。病原菌對(duì)不同碳氮源利用的種類(lèi)和強(qiáng)度存在差異性，如汪漢成等［19］研究報(bào)道煙草赤星病菌可高效代謝的碳源有L-果膠糖、D-半乳糖等34種，氮源有L-谷氨酸、L-賴(lài)氨酸等60余種。本研究采用Biolog FF碳源代謝板進(jìn)行測(cè)試，F(xiàn)F板大部分碳源為真菌可代謝碳源，能反映腐皮鐮刀菌對(duì)大部分碳源的需求。本研究發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌可高效代謝大部分碳源，如D-阿拉伯糖醇、丙三醇等，推測(cè)這些碳源有助于根腐病菌的生長(zhǎng)。通過(guò)Biolog PM3氮源代謝板可知腐皮鐮刀菌對(duì)大部分氮源的代謝能力一般，且對(duì)谷胱甘肽的代謝能力最弱，推測(cè)這類(lèi)氮源可抑制根腐病菌的生長(zhǎng)。

滲透壓和pH值等環(huán)境因子對(duì)病原菌的生長(zhǎng)與危害具有重要影響［19］，病原菌在不同環(huán)境中的代謝能力變化，可反映其對(duì)環(huán)境的耐受性。本研究基于Biolog表型技術(shù)測(cè)定了煙草鐮刀菌屬根腐病菌腐皮鐮刀菌生長(zhǎng)的最適pH值為6。當(dāng)pH值為4.5時(shí)，腐皮鐮刀菌可代謝大部分氨基酸；當(dāng)pH值為9.5時(shí)，煙草根腐病菌腐皮鐮刀菌對(duì)氨基酸代謝活性相對(duì)較弱；該結(jié)果反映腐皮鐮刀菌的脫羧酶活性較高，但脫氨酶活性較差。煙草根腐病菌與煙草其他病原菌相比，其pH值適應(yīng)范圍與煙草青枯病菌Ralstonia solanacearum （pH值 5.0～10） ［20］、煙草黑脛病菌 （pH值 3.5～10）［15］相似。病原菌在煙草上的pH值范圍不同可能是其脫羧酶活性和脫氨酶活性的差異造成的。病原菌對(duì)不同滲透壓物質(zhì)的代謝活性不同，可反映其在不同逆境中的耐受力。煙草腐皮鐮刀菌對(duì)20～200 mmol/L 苯甲酸鈉（pH值 5.2）、60～80 mmol/L亞硝酸鈉、甜菜堿、四氫嘧啶等部分物質(zhì)的代謝較弱，因此可使用不同濃度的滲透壓物質(zhì)來(lái)減輕該病害的危害，這需進(jìn)一步深入研究。本研究獲得的煙草腐皮鐮刀菌的代謝表型組學(xué)信息為鐮刀菌屬其他病原菌的代謝表型研究提供了借鑒。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32160522、31960550）；貴州省科技基金（編號(hào)：黔科合基礎(chǔ)-ZK［2021］重點(diǎn)036）；中國(guó)煙草總公司科技項(xiàng)目［編號(hào)：110202101048（LS-08）、110202001035（LS-04）］；貴州省“百層次”創(chuàng)新型人才項(xiàng)目（編號(hào)：黔科合平臺(tái)人才-GCC［2022］028-1）；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目“茄科葉用經(jīng)濟(jì)作物病害綠色防控科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)”。

作者簡(jiǎn)介：黃玉鳳（1998—），女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事病原微生物學(xué)研究工作。E-mail：397521401@qq.com。

通信作者：汪漢成，研究員，主要從事煙草植保及微生態(tài)研究，E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com；李 菲，教授，主要從事植物根際微生態(tài)研究，E-mail：ifei00987@outlook.com。