東寮芋頭組織快繁技術(shù)初探

0 引言

芋（Colocasiaesculenta）是一種經(jīng)濟(jì)作物，芋頭富含纖維、淀粉等營養(yǎng)成分，可藥用、食用，也可用于食品加工，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。東寮芋頭（屬檳榔芋）作為廣東省揭陽市的傳統(tǒng)特色農(nóng)產(chǎn)品，主要種植于揭陽市揭東區(qū)東寮村及其周邊地區(qū)，由于其個(gè)頭大、質(zhì)地細(xì)膩、口感軟糯、甜度高、營養(yǎng)豐富而遠(yuǎn)近聞名，被譽(yù)為“芋頭之王”。近幾年，由于東寮芋頭備受市場(chǎng)青睞，呈現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)象。

東寮芋頭雖有廣闊的市場(chǎng)前景，但由于村民連年種植，芋頭疫病和軟腐病等病害頻頻發(fā)生，因此病害防控成為當(dāng)?shù)赜筠r(nóng)的當(dāng)務(wù)之急。加之傳統(tǒng)的東寮芋頭繁殖方式存在周期長(zhǎng)、效率低等問題，不僅嚴(yán)重影響了村民的種植效益，也打擊了農(nóng)民的種植積極性。

組培快繁技術(shù)具有繁殖速度快、遺傳穩(wěn)定、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)[1-5]。目前，已有研究表明，可以通過組培快繁技術(shù)實(shí)現(xiàn)芋頭的無病毒、快速及高效繁殖[6-12]，對(duì)提升芋頭產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。研究以揭陽東寮芋頭為試驗(yàn)對(duì)象，就東寮芋頭外植體的消毒、增殖與生根培養(yǎng)、移栽與馴化進(jìn)行初步研究，以期為揭陽地區(qū)芋頭產(chǎn)業(yè)的高效、良性發(fā)展提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料從揭陽市揭東區(qū)農(nóng)戶家收集種芋以供試驗(yàn)

1.2材料處理

將收集的種芋半埋放于濕沙中，促使芋頭生芽。當(dāng)芋芽長(zhǎng) 3～5cm 時(shí)，將其莖尖切取作外植體。

1.3 啟動(dòng)培養(yǎng)

采用MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別量（稱）取母液、蔗糖、瓊脂及根據(jù)配方量添加6-BA和NAA，用蒸餾水混合后邊攪拌邊加熱使其完全熔化，再滴加 1mol/L HC1溶液或 1mol/LNaOH 溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH值至5.8，后加人蒸餾水定容至所需容量，趁熱按每瓶 10mL 的量分裝至 56mL 的玻璃培養(yǎng)瓶中并封好瓶蓋。將分裝好的培養(yǎng)基放進(jìn)高壓滅菌鍋，在 0.105MPa 下蒸汽消毒 20min 后置于超凈工作臺(tái)，在室溫下冷卻凝固后存放，3d后檢查培養(yǎng)基污染情況，清洗掉污染的培養(yǎng)基，留下無菌污染的培養(yǎng)基進(jìn)行接種。

1.4外植體消毒與處理

將外植體用流水沖洗 30min 后，分別置于滅菌后的玻璃培養(yǎng)瓶中（每瓶放1個(gè)），在超凈工作臺(tái)上剝掉其葉鞘，往玻璃瓶中倒入 75% 酒精消毒10 s，一半玻璃瓶加入 10% 次氯酸鈉溶液并浸泡 10min ，剩余一半玻璃瓶加入藍(lán)月亮84消毒液（按原液和水1：50比例稀釋）并浸泡 20min （見表1），均用無菌水沖洗3＼～4次，以徹底去除殘留消毒劑；置于接種盤上，剝?nèi)∏o尖；接種后置于 MS+6-BA0.5mg/L+ NAA 0.1mg/L 萌發(fā)培養(yǎng)基上，30d后，選擇無污染且已萌發(fā)的外植體再進(jìn)行分化培養(yǎng)。

1.5 分化培養(yǎng)

對(duì)經(jīng)過啟動(dòng)培養(yǎng)已萌發(fā)的外植體進(jìn)行修剪，后轉(zhuǎn)到 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L 的分化培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基pH值為5.8），繼續(xù)誘導(dǎo)叢芽分化，培養(yǎng)30d后觀察分化情況。

分化率 分化芽數(shù)量/接種外植體數(shù)量 ×100%

1.6 增殖培養(yǎng)

采用MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖30g/L 、瓊脂 7g/L ，調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5.8。添加不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（如6-BA、NAA、KT等）有機(jī)物（如水解酪蛋白和酵母提取液等），進(jìn)行配方優(yōu)化，設(shè)置多個(gè)處理組合（見表1），以觀察不同配方對(duì)東寮芋頭增殖的影響。每瓶接種3個(gè)芽，每組處理接種20瓶，30d后統(tǒng)計(jì)出芽增殖率。

增殖率 有效芽數(shù)量（高度大于 1.0cm 的芽）/接種芽數(shù)量 ×100%

1.7 生根培養(yǎng)

采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖 30g/L 瓊脂 7g/L ，調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5.8，附加活性炭 和NAA 0.1mg/L 。每瓶接種1個(gè)芽，30d后觀察生根情況。

1.8 培養(yǎng)條件

將接種芽放入含有不同配方培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，并置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)定適宜的光照強(qiáng)度（ 2000lx 、光照周期（每天光照 16h 、溫度[（25±2） 小、相對(duì)濕度（ 50% ）。定期觀察并記錄外植體的生長(zhǎng)狀況，并及時(shí)清理污染培養(yǎng)基。

1.9 移栽與馴化

待東寮芋頭組培苗具3＼～4片葉且根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)健壯時(shí)進(jìn)行移栽。移栽前進(jìn)行煉苗處理，首先進(jìn)行開瓶煉苗（7d左右），該部分分3個(gè)階段進(jìn)行：先松瓶塞1＼～2d，接著半開蓋1＼～2d，剩下幾天完全揭去瓶蓋。開瓶練苗后，首先，將東寮芋頭組培苗用鑷子小心取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到裝有人工配制的培養(yǎng)基質(zhì)（泥炭土與珍珠巖體積比2：1的營養(yǎng)杯中；其次，轉(zhuǎn)移到溫室大棚中管理30d，該過程保持基質(zhì)濕潤但不過濕，避免陽光直曬及積水；最后，移栽于戶外。

2 結(jié)果與分析

2.1不同消毒劑對(duì)外植體消毒效果試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，外植體在 75% 乙醇中處理10s再用 10% 次氯酸鈉溶液浸泡 10min 的方法，污染率較低，成功率達(dá) 80% 。

莖尖在2種不同的消毒劑處理下均出現(xiàn)不同程度的褐化。成活的莖尖外植體在培養(yǎng)5d后逐漸開始膨大且明顯變綠，經(jīng)過30d的培養(yǎng)能觀察到新的組織塊，在整個(gè)生長(zhǎng)過程中均未觀察到愈傷組織。

2.2分化培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

莖尖在分化培養(yǎng)的過程中出現(xiàn)一定程度的褐化。經(jīng)過啟動(dòng)培養(yǎng)的外植體分化培養(yǎng)20d后逐漸分化出芽，分化率達(dá)到 73.14% ，分化出來的芽整體較粗壯。每塊幼芽能分化出2～3株長(zhǎng)有2～4片葉的東寮芋頭幼苗。

2.3增殖培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)結(jié)果

采用MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)比不同處理組合的結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見表2），不同處理過程都在一定程度上促進(jìn)出芽，在NAA和KT質(zhì)量濃度一致的情況下，處理1芽的增殖數(shù)量最多，即MS+6-BA5.0mg/L+NAA 水解酪蛋白100mg/L+ 酵母提取液 0.5% 的組合最有利于東寮芋頭外植體的增殖。該配方下，外植體的增殖速度較其他配方快且生長(zhǎng)狀態(tài)好。

2.4生根培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果

采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加活性炭 0.5g/L 和NAA 0.1mg/L 進(jìn)行東寮芋頭組培苗的生根培養(yǎng)試驗(yàn)。經(jīng)過30d的培養(yǎng)，每株組培苗均能生根，根系較發(fā)達(dá)，且無愈傷組織生成。即在設(shè)定的培養(yǎng)條件下，東寮芋頭組培苗能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)并成功誘導(dǎo)生根。

2.5再生植株的移栽與馴化

移栽具有3＼～4片葉且根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)健壯的東寮芋頭組培苗。移栽時(shí)，選擇透氣性良好、保水保肥能力適中的基質(zhì)（珍珠巖與泥炭土混合物）。在移植前，為有效促進(jìn)東寮芋苗根系的進(jìn)一步發(fā)育，增強(qiáng)其對(duì)新環(huán)境的耐受能力，需要進(jìn)行煉苗處理。此后，隨著植株的生長(zhǎng)，逐漸將其轉(zhuǎn)移至室外，使其逐漸適應(yīng)自然環(huán)境。經(jīng)過一段時(shí)間的馴化，再生植株的葉片顏色鮮綠、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，與常規(guī)繁殖的植株無明顯差異。這表明通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的東寮芋頭再生植株具有良好的生長(zhǎng)潛力和應(yīng)用價(jià)值，初次嘗試的移栽成活率在 75% 以上。

3結(jié)論與討論

研究表明，用東寮芋頭進(jìn)行組培繁殖時(shí)，外植體用 75% 乙醇處理10s再用 10% 次氯酸鈉溶液浸泡 10min 的方法，污染率較低； NAA 0.1mg/L 的配方適用于東寮芋頭莖尖的啟動(dòng)培養(yǎng)： $＼mathrm{MS^{+6-BA2.0＼mg/L+NAA0.1＼mg/L}}$ 的配方適用于東寮芋頭莖尖的分化培養(yǎng)；較適合東寮芋頭組培苗的增殖培養(yǎng)基是 $＼mathrm{MS+6-BA～5.0～＼mg/L+NAA}$ 水解酪蛋白 酵母提取液 0.5% ；能促進(jìn)東寮芋頭組培苗生根的培養(yǎng)基是 活性炭 0.5g/L+NAA0.1mg/L ，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度 、每天光照 16h 、溫度（25±2） 、相對(duì)濕度 50% 。

研究初步探索了東寮芋頭組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，包括外植體的消毒、啟動(dòng)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、增殖和生根培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)條件調(diào)控及再生植株的移栽和馴化。通過一系列優(yōu)化措施的實(shí)施，能成功獲得健壯的東寮芋頭再生植株，但整體增殖系數(shù)偏低。在對(duì)芋頭莖尖進(jìn)行消毒，以及后續(xù)的分化培養(yǎng)過程中，外植體均出現(xiàn)不同程度的褐化。由于褐化是植物組織培養(yǎng)過程中一種常見的現(xiàn)象，往往會(huì)影響該技術(shù)的成功實(shí)施[1]。未來研究應(yīng)進(jìn)一步探討降低芋頭外植體褐化的方法（如添加防褐化劑活性炭[12-13]、維生素C等[14-15]或調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度[16-17]等），以及探索能提高東寮芋頭組織培養(yǎng)分化、增殖效率的培養(yǎng)基配方[18-23]

此外，光照強(qiáng)度、光照周期、溫度及相對(duì)濕度的調(diào)控等培養(yǎng)條件對(duì)植株生長(zhǎng)也具有顯著影響。因此，應(yīng)設(shè)置不同的培養(yǎng)條件，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來促進(jìn)植株在組培階段的健康生長(zhǎng)和高效繁殖。提高再生植株的移栽成活率和適應(yīng)能力也是提高東寮芋頭組織快繁技術(shù)不可或缺的環(huán)節(jié)，可對(duì)栽培基質(zhì)及管理方式進(jìn)一步優(yōu)化。

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