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    恒溫隔絕式PCR快速檢測蠟樣芽孢桿菌方法的建立及應(yīng)用

    2024-05-16 03:25:02寇肖迪孟含蘇雅航湯承胡瑜唐俊妮
    現(xiàn)代食品科技 2024年4期
    關(guān)鍵詞:蠟樣芽孢探針

    寇肖迪,孟含,蘇雅航,湯承,胡瑜,唐俊妮,*

    (1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610225)(2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室,四川成都 610041)(3.康美包(蘇州)有限公司,江蘇蘇州 215021)

    蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種常見的食源性致病菌,廣泛存在于土壤、空氣、水、動物的腸道以及植物源和動物源食品中,尤其是蛋白質(zhì)和碳水化合物含量豐富的食品,如糧食制品、乳制品、肉類制品和豆制品等[1-3]。近些年發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌也能感染包括人在內(nèi)的多種動物,是一種人畜共生細菌,感染者癥狀主要表現(xiàn)為惡心甚至嘔吐、腹脹腹痛腹瀉等[4]。據(jù)文獻報道,我國發(fā)生的B.cereus食源性疾病主要是以嘔吐型為主,占75.9%[5]。食用含有超過105CFU/g 的蠟樣芽孢桿菌即可導(dǎo)致食物中毒[6]。因此,對食品是否污染蠟樣芽孢桿菌的檢測十分重要。目前,蠟樣芽孢桿菌的檢測方法主要有GB 4789.14-2014[7]、免疫學(xué)檢測方法如ELISA、免疫組化及實時熒光PCR 等技術(shù)[8-11]、PCR 技術(shù)[12,13]。傳統(tǒng)鑒定蠟樣芽孢桿菌的方法操作繁瑣、耗時長、檢出率低;ELISA、免疫組化以及PCR 等方法對儀器設(shè)備和操作人員要求高[14,15]。因此,建立一種快速、準確、簡捷檢測蠟樣芽孢桿菌的方法,具有十分重要的應(yīng)用價值。

    恒溫熱隔絕式PCR(Insulated Isothermal PCR,iiPCR)是一種以Rayleigh-Benard 對流系統(tǒng)為原理的能夠通過反應(yīng)管底部液體持續(xù)加熱產(chǎn)生上下液體溫差,控制對流時間與散熱速率,使其在管內(nèi)形成穩(wěn)定溫度梯度,從而提供PCR 所需快速、低耗的核酸擴增平臺[16]。該技術(shù)最早在2002 年,由Krishnan 首次報道,結(jié)合POCKITTM系列手持式核酸檢測儀,體積小、自帶電源,加樣后一鍵操作,反應(yīng)僅需42 min 便可完成,結(jié)果以“+”、“-”、“?”直接顯示于液晶屏幕上,方便快捷,可達到現(xiàn)場快速檢測的目的[17]。如Tsen[18]等建立了iiPCR 方法檢測雞肉中沙門氏菌,樣品培養(yǎng)到5 h 即可檢測樣品是否含有沙門氏菌;楊若璇等[19]使用iiPCR 檢測食品中的沙門氏菌,其靈敏度較高,最低檢出限可達75 CFU/mL,在6 h 內(nèi)完成檢測;李傳友等[17]建立iiPCR 快速檢測技術(shù)對食品中的金黃色葡萄球菌進行檢測,檢出限為102CFU/mL,檢出時間為6 h 且具有較高穩(wěn)定性。

    蠟樣芽孢桿菌的管家基因gyrB 基因具有高度保守性[20],能夠編碼蠟樣芽孢桿菌旋轉(zhuǎn)酶B 亞基,可用于蠟樣芽孢桿菌PCR 快速檢測[21-23]。本研究利用iiPCR 技術(shù),建立一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌gyrB基因的新方法,該方法能在更短的時間內(nèi)完成高特異性和高靈敏性的擴增,儀器設(shè)備也簡易便攜,能夠?qū)ΜF(xiàn)場檢測提供有效穩(wěn)定準確快速的技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 菌株來源

    蠟樣芽孢桿菌ATCC11778(Bacillus cereus)、金黃色葡萄球菌ATCC6538(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌ATCC25922(Escherichia coli)、單增李斯特菌ATCC19115(Listeria monocytogenes)、腸炎沙門氏菌CICC 21482(Salmonellaenteritidis)等均由本實驗室保存。

    1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

    甘露醇卵黃多粘素培養(yǎng)基(Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin Agar Base,MYP)、多粘素B、胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB),購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;核酸染料GELVIEW、DL50 Marker、Premix Ex Taq(Probe qPCR)、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、Taq PCR Master Mix(2x,blue dye),購于寶生物工程(大連)有限公司;G-10電泳凝膠瓊脂糖,購于Biowest 公司;各種食物樣品購于學(xué)校食堂、超市以及攤位。

    1.1.3 設(shè)備與儀器

    POCKITTM小型智能型核酸分析儀、R-tube(48),廈門金瑞鴻捷生物科技有限公司;CFX96 熒光定量PCR 儀、VerSaDoc 2000 凝膠成像系統(tǒng),美國 Bio-Rad 有限公司;PCR 儀,TSNENEN031445基因(美國)有限公司;Galanz WD800B 型微波爐,順德市格蘭仕微波爐電器有限責任公司;SC-15 數(shù)控超級恒溫槽,寧波新芝生物科技股份有限公司;Eppendorf 5804R 型冷凍離心機,Eppendorf 公司;DYY-6C 電泳儀,北京六一儀器廠。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 引物及探針的設(shè)計與合成

    選取蠟樣芽孢桿菌的管家基因gyrB 基因作為靶基因,利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計一對引物及探針,并進行BLAST 比對,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,探針由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。引物和探針序列信息見表1。

    表1 用于iiPCR方法的gyrB特異性引物、探針基本信息Table 1 Basic information for iiPCR of gyrB specific primers and probes

    1.2.2 菌株復(fù)蘇

    從超低溫冰箱中取出保存的蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌于室溫解凍,分別吸取50 μL 菌液接種置5 mL TSB 液體培養(yǎng)基中,30 ℃(蠟樣芽胞桿菌)或37 ℃(其他細菌)恒溫震蕩培養(yǎng)12~18 h。

    1.2.3 DNA模板提取

    取1.2.2 中蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌等菌株過夜培養(yǎng)菌液1 mL 于1.5 mL 的無菌EP 離心管中,4 ℃,12 000 r/min 離心2 min,PBS 洗滌菌體2~3次,棄上清液收集菌體。參考周晏陽等[24]微波提取DNA 方法,向離心管中加入500 μL TE 緩沖液,渦旋震蕩30 s,取100 μL 于PCR 管中,Galanz WD 800B 型微波爐預(yù)熱1 min 后將PCR 管用微波爐加熱40~120 s;12 000 r/min 離心1 min 收集上清液即為模板DNA。

    1.2.4 引物及探針驗證

    采用實時熒光定量PCR 儀(CFX96)對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌及陰性對照進行擴增檢測,以驗證引物和探針的可行性。

    反應(yīng)體系及條件參考崔溢和張貴海[25],10 μL 2×Premix Ex Taq,2 μL 探針(10 μmol/L),上、下游引物各1.0 μL(10 μmol/L),5 μL DNA 模板,無菌水補足至20 μL,利用無菌去離子水代替DNA 模板做無模板陰性對照。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 10 min;60 ℃ 1 min;40 個循環(huán),在56 ℃結(jié)束開始收集熒光信號。

    1.2.5 iiPCR反應(yīng)體系摸索

    參考楊若璇等[19]方法,采用25 μL 體系分別對Taq 酶(預(yù)混酶)5 U/μL(11~13.5 μL)上下游引物10 μmol/μL(0.5~2 μL)、探針10 μmol/μL(0.25~1 μL)、模板DNA(原始濃度94.75 ng/μL)(1~4 μL)、無菌水的用量進行條件探索,確定各自用量的最佳值。

    1.2.6 特異性實驗

    采用本實驗建立的iiPCR 方法對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、腸炎沙門氏菌標準菌株基因組DNA 進行擴增,同時設(shè)置1.2.3 中的蠟樣芽孢桿菌DNA 為陽性對照,無菌ddH2O 為陰性對照。

    1.2.7 靈敏度試驗

    對濃度為1.5×108CFU/mL 的菌懸液進行10 倍的梯度稀釋,并對10 個梯度濃度的菌液進行DNA提取,測定DNA 濃度,采用已建立的iiPCR 方法進行檢測。同步進行常規(guī)PCR 靈敏性對比試驗,常規(guī)PCR 反應(yīng)體系為20 μL:2×TSINGKE Master mix 10 μL;10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL;DNA 模板2 μL;無菌去離子水7.2 μL,陰性對照試驗利用無菌去離子水代替DNA 模板。擴增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性40 s,56 ℃退火50 s,72 ℃延伸40 s;循環(huán)35 次;所得產(chǎn)物進行4%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果,并對比常規(guī)PCR 擴增結(jié)果。

    1.2.8 穩(wěn)定性試驗

    采用建立的iiPCR 方法對菌液的三個稀釋度(10-5、10-6、10-7)進行三組重復(fù)實驗,以評價該方法的穩(wěn)定性。

    1.2.9 與其它蠟樣芽孢桿菌檢測方法比較

    分別采用傳統(tǒng)PCR 方法和熒光定量PCR 對蠟樣芽胞桿菌DNA 和菌液不同稀釋梯度進行檢測。

    常規(guī)PCR 方法參考高瑞等[26]的方法稍作修改,即常規(guī)PCR 反應(yīng)體系共20 μL:2×TSINGKE Master mix 10 μL;10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL;DNA模板1 μL;無菌去離子水8.2 μL,陰性對照利用無菌去離子水代替DNA 模板。擴增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性40 s,56 ℃退火50 s,72 ℃延伸40 s;循環(huán)35 次;所得產(chǎn)物進行4%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

    實時熒光定量PCR(SYBER Green Ⅰ熒光染料法)根據(jù)董歆[27]的方法稍作修改,反應(yīng)體系共15 μL:TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 7.5 μL;上下游引物各0.5 μL;模板DNA 1 μL;ddH2O 15 μL,陰性對照試驗利用無菌去離子水代替DNA 模板。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,56 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40 個循環(huán),在延伸時采集熒光信號。

    實時熒光定量PCR(TaqMan 探針法)根據(jù)柯振華[28]的方法稍作修改,反應(yīng)總體系為25 μL:Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5 μL;上下游引物各1 μL;探針0.5 μL;模板DNA 2 μL;ddH2O 8 μL,陰性對照試驗利用無菌去離子水代替DNA 模板。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,56 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40 個循環(huán),在延伸時采集熒光信號。

    將上述實驗結(jié)果與1.2.6 結(jié)果做對比。

    1.2.10 實際樣品檢測

    從成都各大農(nóng)貿(mào)市場、路邊小攤、食堂、餐館等地購買糧食制品、肉制品、豆制品、乳制品以及熟食樣品共計42 份(詳見表3),并將食品樣品切成1 cm 長小段攪拌混勻,準確稱取各處理后的食品樣品25 g 至胰蛋白胨大豆肉湯中,振蕩培養(yǎng)2、4、6、8 h 取樣(通過預(yù)實驗iiPCR 需培養(yǎng)6 h,常規(guī)PCR 至少培養(yǎng)8 h),按1.2.3 方法提取基因組DNA,采用1.2.4 已建立iiPCR 方法和常規(guī)PCR 方法進行檢測,并分析蠟樣芽孢桿菌在食品中的流行情況。

    1.2.11 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)處理采用Excel 2020 進行整理計算。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 引物及探針驗證結(jié)果

    采用實時熒光定量PCR 分別對不同標準菌株提取DNA 進行擴增,結(jié)果如圖1 所示,只有1 號蠟樣芽孢桿菌出現(xiàn)陽性,能夠得到特異性擴增,2~5號其他菌株為陰性,證明本研究根據(jù)選取的gyrB基因所設(shè)計的引物與探針具有良好特異性。

    圖1 蠟樣芽胞桿菌引物、探針驗證結(jié)果Fig.1 The primer and probe verification for Bacillus cereus

    2.2 優(yōu)化后的反應(yīng)體系

    通過對Taq 酶、探針、引物、模板用量進行區(qū)間優(yōu)化(如圖2),最終確定的反應(yīng)體系如表2 所示。Taq 預(yù)混酶的用量確定為各2.5×106U/L,上、下游引物用量確定為各0.2 mol/L,探針用量確定為0.2 mol/L,DNA 模板用量確定為7.58 ng/μL。

    圖2 iiPCR 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果Fig.2 The optimization results of iiPCR

    2.2 特異性評價

    對純培養(yǎng)的蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和沙門氏菌提取DNA 作為模板,按上述建立的方法進行iiPCR 擴增,結(jié)果如圖3a、b 所示,POCKITTM手持式核酸分析儀界面上顯示只有蠟樣芽孢桿菌檢出為陽性(+),陰性對照和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌檢出均為陰性(-)。表示針對蠟樣芽孢桿菌所建立的iiPCR 檢測方法特異性良好。

    圖3 特異性試驗Fig.3 Specific test

    2.3 靈敏度試驗結(jié)果

    將制備好的菌懸液梯度10 倍稀釋,分別選擇100 μL 不同梯度的稀釋菌液,均勻涂于營養(yǎng)瓊脂平板上,在(30±1)℃下倒置過夜培養(yǎng),當培養(yǎng)基上生長出清晰的單個菌落,并統(tǒng)計典型菌落數(shù),取平均值后得到第10-5稀釋梯度的菌落平均數(shù)為1 500 CFU/mL,經(jīng)計算得出所制得菌懸液的原始濃度為1.5×108CFU/mL。

    對所稀釋的10 個梯度濃度的蠟樣芽孢桿菌的菌懸液采用微波法提取DNA,采用上述擴增體系進行檢測,結(jié)果如圖4 所示,POCKITTM手持式核酸分析儀界面上濃度為1.5×103CFU/mL 和1.5×102CFU/mL均顯示為陽性(+),濃度為15 CFU/mL 和陰性對照顯示為陰性(-),說明建立的iiPCR 檢測方法對蠟樣芽孢桿菌純培養(yǎng)菌液的最低檢出限為150 CFU/mL。

    圖4 蠟樣芽胞桿菌不同濃度菌液檢出結(jié)果Fig.4 Detection results of Bacillus cereus in different concentrations of bacterial solution

    注:1~4 泳道分別為1.5×103、1.5×102、1.5×10 CFU/mL、陰性對照。

    2.4 穩(wěn)定性評價

    分別對純培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌菌懸液的10-5、10-6、10-7,3 個稀釋梯度即1.5×103、1.5×102、1.5×10 CFU/mL,分別提取DNA 作為模板,通過上述建立的iiPCR方法對其擴增,進行三次重復(fù)性平行試驗,結(jié)果如圖5a、b、c 所示,POCKITTM手持式核酸分析儀界面上陰性對照和1.5×10 CFU/mL 顯示為陰性(-),1.5×103、1.5×102CFU/mL 顯示為陽性(+),三次重復(fù)檢測結(jié)果一致,表示本研究所建立的iiPCR 方法具有良好的穩(wěn)定性。

    圖5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Fig.5 Stability evaluation test results

    2.5 與其他檢測方法比較結(jié)果

    將純培養(yǎng)的濃度為1.5×108CFU/mL 蠟樣芽孢桿菌菌懸液經(jīng)10 倍梯度稀釋,采用傳統(tǒng)PCR 方法、實時熒光定量PCR(熒光染料SYBR Green Ⅰ和TaqMan 探針法)技術(shù)擴增對其靈敏性進行檢測。檢測結(jié)果如圖6 所示。

    圖6 傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量菌液濃度靈敏度試驗結(jié)果Fig.6 Traditional PCR,real-time fluorescence quantitative PCR Concentration sensitivity test results

    結(jié)果表明,傳統(tǒng)PCR 方法對蠟樣芽孢桿菌的最低檢出限為1.5×103CFU/mL;實時熒光定量PCR方法對蠟樣芽孢桿菌的最低檢出限為1.5×102CFU/mL;與2.3 中結(jié)果比較分析可知,本研究建立的iiPCR方法對蠟樣芽孢桿菌的最低檢出限與實時熒光檢測技術(shù)相同,均比常規(guī)PCR 技術(shù)檢測結(jié)果高出一個數(shù)量級。

    iiPCR 方法無需凝膠電泳檢測,總檢測流程僅需7~8 h 即可得到結(jié)果,擴增時間40 min 即可顯示檢測結(jié)果。

    2.6 實際樣品檢測結(jié)果分析

    為驗證已建立方法對食品中蠟樣芽胞桿菌的檢測效果,采集實際食品樣品42 份進行方法的檢驗。采用上述研究建立的iiPCR 方法對采集的42 份實際食品樣品中蠟樣芽孢桿菌進行檢測,結(jié)果如圖7 所示,從圖中可以看出,當培養(yǎng)到6 h 時,42 份食品樣品中共檢測出蠟樣芽孢桿菌陽性有19 份,總檢出率為45.23%(19/42),其中米面制品的檢出率為23.81%(10/42),乳制品的檢出率為4.76%(2/42),熟食類(肉制品及涼拌菜)檢出率分別為4.76%(2/42)和2.38%(1/42),豆制品檢出率為9.52%(4/42)。如果按米面制品細分,其檢出率為62.50%(10/16)。

    圖7 食品樣品iiPCR 檢出結(jié)果Fig.7 Food samples iiPCR detection results

    2.7 實際樣品iiPCR與普通PCR方法檢出結(jié)果比較

    采用常規(guī)PCR 方法對上述采集的食品樣品檢測加以驗證iiPCR 方法的準確性,當樣品增菌培養(yǎng)到8 h 時提取DNA(前增菌6 h 常規(guī)PCR 未能檢測出),通過常規(guī)PCR 進行擴增,結(jié)果如圖8 所示,由圖可以看出此時常規(guī)PCR 方法可對19 份樣品均檢出陽性結(jié)果,將兩種方法的檢出結(jié)果進行比較,比較結(jié)果如表3 所示,常規(guī)PCR 方法與iiPCR 方法的檢測結(jié)果一致??梢姡狙芯克ο灅友挎邨U菌檢測的iiPCR 方法比傳統(tǒng)PCR 方法具有耗時更短、操作更簡便的優(yōu)勢,在實際食品樣品的現(xiàn)場檢測應(yīng)用方法中,建立的iiPCR 方法更加快捷、實用。

    表3 iiPCR與常規(guī)PCR檢測結(jié)果的比較Table 3 Comparison of iiPCR and traditional PCR results

    本研究所采集的食品樣品蠟樣芽孢桿菌的總檢出率為45.23%(19/42),與田萬帆等[29](24.00%)、李芳等[30](26.56%)、權(quán)玉玲等[31](13.03%)、畢宇涵等[32](30.51%)的研究檢測結(jié)果偏高,可能的原因是本研究所采集的食品樣品集中在7~9 月,夏季氣溫高導(dǎo)致大部分食源性致病菌生長繁殖快。糧食制品是蠟樣芽孢桿菌最易感染的食品來源,本研究中米面等糧食制品的小類檢出率最高,為62.50%(10/16),連國平等[33]在分析四類不同食品中蠟樣芽孢桿菌的分布規(guī)律時,也得出熟制米面制品最易感染蠟樣芽孢桿菌的結(jié)論,且檢出率最高,與本研究結(jié)論相同。

    食品中蠟樣芽孢桿菌含量超過105CFU/g 即可作為食物中毒的判斷依據(jù)[34],但由于本次所采樣品未進行蠟樣芽孢桿菌含量及是否含有能夠產(chǎn)生嘔吐及腹瀉毒素的毒力基因檢測,雖所檢出樣品含有蠟樣芽孢桿菌,但無法斷定其含量是否會導(dǎo)致食物中毒癥狀發(fā)生,以后我們會進一步針對食品中細菌的含量及毒素進行定量檢測。

    3 結(jié)論

    本研究建立了快速檢測蠟樣芽孢桿菌的iiPCR方法,選擇gyrB 基因作為檢測靶基因,通過iiPCR方法與傳統(tǒng)檢測方法以及熒光PCR 等方法對不同致病菌的對比得出iiPCR 方法蠟樣芽孢桿菌最低檢出限僅為1.5×102CFU/mL,且耗時僅為7~8 h,此結(jié)果遠遠低于傳統(tǒng)PCR 方法與熒光PCR 方法的檢測結(jié)果,說明該方法靈敏度高、耗時短、操作便捷;通過重復(fù)試驗及對實驗室其他保藏菌進行試驗對比,說明已建立方法穩(wěn)定性好、特異性強;采用已建立方法與常規(guī)PCR 方法做實際樣品檢測驗證,結(jié)果表明兩種方法檢測結(jié)果一致,iiPCR 方法可以用于食品的檢測。

    綜上,本研究建立的基于恒溫熱隔絕式PCR 技術(shù)檢測食品中的蠟樣芽孢桿菌,可應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測,不僅節(jié)省時間還提高了檢測效率,降低了微生物檢測工作的部分難度。

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